Vaccinum poliomyelitidis inactivatum
DEFINIÇÃO
A vacina inactivada contra a poliomielite é uma suspensão líquida obtida a partir de estirpes apropriadas dos vírus poliomielíticos humanos dos tipos 1, 2 e 3 cultivadas em
culturas celulares apropriadas e inactivadas por um método validado. A vacina apresenta-se na forma de um líquido límpido que pode ser corado devido à presença de um indicador de pH.
PRODUÇÃO
É conveniente estabelecer que o método de produção utilizado origina de modo constante vacinas de poder imunogénico e de inocuidade aceitáveis para o homem.
A vacina é produzida segundo um sistema de lote semente vírico. As linhas celulares são utilizadas segundo um sistema de banco de células. Se forem utilizadas células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco, a produção satisfaz às especificações indicadas abaixo.
Salvo excepção justificada e autorizada, o vírus contido na vacina final não deve ter sofrido, depois do lote semente primário, um número de passagens superior ao utilizado para preparar a vacina em que foi demonstrada a inocuidade e a eficácia nos estudos clínicos.
O método de produção é objecto de uma validação que permite demonstrar que o produto, quando aplicável, satisfaz ao ensaio de toxicidade anormal dos soros e vacinas para uso humano (2.6.9).
SUBSTRATO DE MULTIPLICAÇÃO DOS VÍRUS O vírus é multiplicado numa linha de células diplóides humanas (5.2.3), numa linha contínua de células (5.2.3) ou em células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco.
Células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco. As especificações particulares que se seguem para o substrato de multiplicação do vírus aplicam-se às vacinas preparadas sobre células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco.
Macacos utilizados na preparação das culturas de células renais para a produção e controlo da vacina. Os animais utilizados são pertencentes a uma espécie aprovada pela Autoridade competente, saudáveis e, salvo excepção justificada e autorizada, que não tenham sido utilizados em nenhuma outra experiência. As células renais para a produção e controlo da vacina são obtidas a partir de macacos criados em colónias fechadas e vigiadas e não de animais capturados no meio natural. Sob reserva de autorização da Autoridade competente, um lote semente já aprovado e preparado a partir do vírus que tenha sofrido uma passagem em células provenientes de macacos selvagens pode ser utilizado na preparação da vacina se os dados históricos sobre a inocuidade o justificarem.
Colónias fechadas e vigiadas de macacos. Os macacos são alojados em grupos nas jaulas. Para prevenir a contaminação por agentes estranhos, os animais utilizados são mantidos em colónias fechadas, submetidos a uma vigilância veterinária e a ensaios laboratoriais sistemáticos e contínuos a fim de detectar a presença de agentes infecciosos. O fornecedor de animais deve ser aprovado pela Autoridade competente. Cada macaco submete-se a ensaios serológicos com intervalos regulares durante um período de quarentena, no mínimo, de 6 semanas antes de entrar na colónia e durante a sua permanência na colónia.
Vacinas
Vacina inactivada contra a poliomielite
Verifica-se que os macacos utilizados apresentam reacção negativa à tuberculina e que são isentos de anticorpos contra o vírus símio 40 (SV40) e contra o vírus da imunodeficiência símia. A colheita da amostra sanguínea utilizada na pesquisa de anticorpos dirigidos contra o SV40 deve ser também próxima quanto possível da colheita dos rins. Se forem utilizados macacos do género Macaca para a produção, verifica-se igualmente se são isentos de anticorpos contra o herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco). O herpesvírus 1 humano é utilizado como indicador da ausência de
anticorpos contra o herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco) em virtude do perigo que implica a manipulação deste último.
Os macacos cujos os rins devem ser retirados, são examinados com cuidado nomeadamente para detectar a tuberculose e uma infecção pelo herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco). Qualquer macaco que apresente uma lesão patológica relacionada com a utilização dos seus rins não pode ser utilizado para a preparação de um lote semente ou de uma vacina, assim como não serão os outros macacos do grupo em questão, a menos que seja evidente que o seu uso não compromete a inocuidade do produto.
Todas as operações descritas na presente secção são efectuadas fora dos locais de produção da vacina.
Culturas de células renais de macaco destinadas à produção da vacina. Os rins utilizados para a preparação das culturas de células não devem apresentar nenhum sinal patológico.
Cada grupo de culturas celulares proveniente de um macaco constitui uma cultura celular de produção separada de onde deriva uma colheita única separada.
A suspensão de células renais primárias de macaco satisfaz ao ensaio das micobactérias (2.6.2); efectue o ensaio sobre um lisado das células.
Se forem utilizadas células secundárias ou terciárias é conveniente demonstrar por ensaios de validação apropriados que células a um nível de passagem além do utilizado para a produção são isentas de poder tumorígeno.
LOTES SEMENTE
A identidade das 3 estirpes do vírus da poliomielite utilizadas é atestada por documentos indicando nomeadamente a sua origem e as manipulações a que foram submetidas.
Para a multiplicação do vírus só pode ser utilizado um lote semente de trabalho que satisfaça às especificações seguintes.
Identificação. Cada lote semente de trabalho é identificado como vírus poliomielítico humano do tipo 1, 2 ou 3, por um ensaio de neutralização do vírus com anticorpos específicos.
Concentração em vírus. A concentração em vírus de cada lote semente de trabalho é avaliada de modo a determinar a quantidade de vírus a utilizar na inoculação das células de produção.
Agentes estranhos. O lote semente de trabalho satisfaz às especificações definidas para os lotes semente para vacinas víricas (2.6.16). Por outro lado, se tiverem sido utilizadas células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco no isolamento da estirpe, os controlos são praticados para assegurar que estes vírus não são contaminados por vírus símios como o vírus da imunodeficiência símia, o vírus
símio 40, os filovírus e os herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco). Um lote semente de trabalho preparado em células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco satisfaz igualmente às especificações dadas a seguir em
«Multiplicação e colheita do vírus» para as colheitas únicas preparadas nessas células.
MULTIPLICAÇÃO E COLHEITA
Todas as manipulações efectuadas no banco de células e as culturas celulares são feitas em condições de assepsia em locais onde não são manipuladas simultaneamente outras células ou outros vírus. Um soro animal aprovado (com excepção de soro humano) pode ser utilizado nos meios de cultura celular. A ausência de agentes estranhos é verificada no soro e na tripsina utilizados para a preparação das suspensões celulares e dos meios. Os meios de cultura celular podem conter um indicador de pH, como o
vermelho de fenol, e antibióticos aprovados na concentração correspondente ao limiar de eficácia. Reserve um volume correspondente, no mínimo, a 500 ml das culturas celulares utilizadas para a produção da vacina como cultura de células não infectadas (células testemunha). No caso de utilização de uma linha de células contínua cultivada num fermentador, tome 200 106 células para a preparação das células testemunha. No caso de utilização de células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco, tome uma amostra equivalente, no mínimo, a 500 ml da suspensão celular à concentração utilizada para a produção (células testemunha).
Na preparação da vacina só pode ser utilizada uma colheita única que satisfaça às especificações seguintes. Os ensaios de identificação e de contaminação bacteriana e fúngica podem ser efectuados de preferência na mistura das colheitas monovalentes purificadas, e não na colheita única. O ensaio da concentração em vírus, em vez de ser efectuado na colheita única, pode ser efectuado na mistura das colheitas monovalentes purificadas após ter sido demonstrada a regularidade da produção no estado da colheita única.
Células testemunhas. As células testemunha da cultura celular de produção satisfazem a um ensaio de identificação (se for utilizado um sistema de banco de células para a produção) e às especificações dos agentes estranhos (2.6.16);
se forem utilizadas para a produção células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco, os ensaios em culturas celulares são efectuados como é descrito em «Ensaio em culturas de células de rins de coelho» e em «Ensaio em culturas de células de rins de cercopitecos».
Ensaio em culturas de células de rins de coelho. Examine uma amostra, no mínimo, de 10 ml da mistura de líquido sobrenadante de células testemunha por inoculação em culturas de células de rins de coelho a fim de detectar o herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco) e outros vírus.
A diluição do líquido sobrenadante no meio nutritivo não deve exceder 1/4 e a superfície da camada celular deve ser, no mínimo, de 3 cm2 por mililitro de inóculo. Mantenha um ou vários recipientes de cada lote de células com o mesmo meio como células testemunha não semeadas. Incube as culturas a 37°C e observe-as, no mínimo, durante 2 semanas.
O ensaio só é válido se, no mínimo, 20 por cento das culturas testemunha forem rejeitadas por razões não específicas acidentais.
Ensaio em culturas de células de rins de cercopiteco. Examine
Vacinas
Vacina inactivada contra a poliomielite
uma amostra, no mínimo, de 10 ml da mistura de líquido sobrenadante das células testemunha a fim de detectar o vírus SV40 e outros agentes estranhos, por inoculação em culturas celulares preparadas a partir de rins de macacos cercopithecus ou de outras células demonstradas, no mínimo, também sensíveis ao SV40; proceda como é descrito em «Ensaio em culturas de células de rins de coelho». O ensaio só é válido se, no máximo, 20 por cento das culturas testemunha forem rejeitadas por razões não específicas acidentais.
Identificação. A colheita única é identificada como contendo o vírus poliomielítico humano do tipo 1, 2 ou 3 por um ensaio de neutralização do vírus em culturas celulares com anticorpos específicos.
Concentração em vírus. Determina-se a concentração em vírus da colheita única titulando o poder infeccioso do vírus em culturas celulares.
Contaminação bacteriana e fúngica. A colheita única satisfaz ao ensaio de esterilidade (2.6.1). Efectue o ensaio utilizando 10 ml da amostra para cada meio.
Micoplasmas (2.6.7). A colheita única satisfaz ao ensaio dos micoplasmas. Efectue o ensaio utilizando 10 ml da amostra para cada meio.
Ensaio em culturas de células de rim de coelho. Se a produção for efectuada em células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco, examine uma amostra, no mínimo, de 10 ml da colheita única, a fim de detectar o herpesvírus B (herpesvírus 1 cercopiteco) e outros vírus, por inoculação em culturas de células de rim de coelho, como antes descrito para as células testemunhas.
Ensaio em culturas de células de rim de cercopitecos.
Se a produção for efectuada em células renais primárias, secundárias ou terciárias de macaco, examine uma amostra de 10 ml da colheita única a fim de detectar o vírus SV40 e outros agentes estranhos. Neutralize a amostra com um soro de título elevado contra o tipo de vírus da poliomielite presente. Efectue o ensaio em células renais primárias de cercopitecos ou em células demonstradas, no mínimo, também sensíveis ao SV40. Incube as células a 37°C durante 14 dias. No fim deste período, efectue uma subcultura do líquido nas células do mesmo sistema e observe as 2 culturas durante mais 14 dias.
PURIFICAÇÃO E COLHEITA MONOVALENTE PURIFICADA Podem ser misturadas e eventualmente concentradas várias colheitas únicas do mesmo tipo. A colheita monovalente ou a mistura de colheitas monovalentes é purificada por métodos validados. Se a produção for efectuada em linhas celulares contínuas, convém demonstrar que o método de purificação utilizado reduz regularmente o teor em ADN proveniente das células do substrato, no máximo, a 100 pg por dose humana unitária.
Para a preparação da colheita monovalente inactivada só pode ser utilizada uma colheita monovalente purificada que satisfaça às especificações seguintes.
Identificação. O vírus é identificado quer por neutralização em culturas celulares com anticorpos específicos, quer por determinação do antigénio D.
Concentração vírica. Determina-se a concentração em vírus titulando o poder infeccioso.
Actividade específica. Determina-se a relação entre a concentração em vírus ou o teor em antigénio D, por um método imunoquímico apropriado (2.7.1), e o teor em proteínas totais (actividade específica) da colheita monovalente purificada situa-se dentro dos limites aprovados para o produto específico.
INACTIVAÇÃO E COLHEITA MONOVALENTE INACTIVADA Antes de proceder à inactivação, é possível misturar várias colheitas monovalentes purificadas do mesmo tipo. A fim de evitar os defeitos da inactivação devido à presença de agregados víricos, proceda a uma filtração antes e durante o processo de inactivação. O processo de inactivação desenvolve-se num prazo apropriado de tempo após prévia filtração; este prazo é de preferência inferior a 24 h e em todos os casos deve ser inferior a 72 h. A suspensão vírica é inactivada por um método validado que tenha sido demonstrado que permite inactivar o vírus poliomielítico sem comprometer o poder imunogénico; durante os estudos de validação é estabelecida uma curva de inactivação representando a diminuição, no tempo, da concentração em vírus vivo residual, no mínimo, com 4 medidas (por exemplo, 0 h, 24 h, 48 h e 96 h). Se for utilizado o formaldeído para a inactivação, verifica-se a presença de um excesso de formaldeído livre no fim da inactivação.
Na preparação de um concentrado trivalente ou de um granel final só pode ser utilizada uma colheita monovalente inactivada que satisfaça aos ensaios seguintes.
Ensaio de inactivação. Após neutralização do formaldeído pelo bissulfito de sódio (se necessário), verifique por inoculação em culturas celulares apropriadas, a ausência do vírus poliomielítico vivo residual em 2 amostras de cada colheita monovalente inactivada correspondente, no mínimo, a 1500 doses humanas. Uma amostra é recolhida o mais tardar aos 3/4 da operação e outra no fim do período de inactivação. Inocule as 2 amostras em culturas celulares de modo que a diluição da vacina no líquido nutritivo não exceda 1/4 e que a superfície da camada celular seja, no mínimo, de 3 cm2 por mililitro de inóculo. Coloque de lado, para servirem de caixas de cultura testemunha não inoculadas contendo o mesmo meio, uma ou várias caixas de culturas. As caixas de cultura celulares são mantidas em observação, no mínimo, durante 3 semanas. Proceda, no mínimo, a 2 repicagens a partir de cada caixa uma no final do período de observação e outra 1 semana antes do fim deste período. As repicagens são efectuadas a partir do sobrenadante das culturas e a inoculação é feita do mesmo modo que para a amostra de origem. Mantenha as repicagens em observação, no mínimo, durante 2 semanas. Nenhum sinal de multiplicação do vírus poliomielítico é observado nas culturas celulares. No fim do período de observação, a sensibilidade da cultura celular utilizada é verificada por meio de um vírus poliomielítico vivo do mesmo tipo que o presente na colheita monovalente inactivada.
Esterilidade (2.6.1). A colheita monovalente inactivada
Vacinas
Vacina inactivada contra a poliomielite
satisfaz ao ensaio de esterilidade. Utilize 10 ml da amostra para cada meio.
Teor em antigénio D. Determine o teor em antigénio D por um método imunoquímico apropriado (2.7.1). O teor situa-se dentro dos limites aprovados para a preparação específica.
GRANEL FINAL
O granel final pode ser preparado quer directamente a partir das colheitas monovalentes inactivadas dos vírus poliomielíticos humano do tipo 1, 2 e 3, quer a partir de uma mistura trivalente de colheitas monovalentes inactivadas.
No caso de utilização de uma mistura trivalente de colheitas monovalentes inactivadas, efectua-se uma prova de eficácia da inactivação na fase desta mistura, em vez de no granel final. Podem ser adicionados um estabilizante e um conservante apropriados.
Na preparação do lote final só pode ser utilizado um granel final que satisfaça às especificações seguintes.
Esterilidade (2.6.1). O granel final satisfaz ao ensaio de esterilidade. Utilize 10 ml da amostra para cada meio.
Conservante antimicrobiano. Determine, quando aplicável, o teor em conservante antimicrobiano por um método químico ou físico-químico apropriado. Não é inferior a 85 por cento nem superior a 115 por cento do teor pretendido.
Inactivação. Antes de qualquer adição de conservante antimicrobiano, submeta uma amostra, no mínimo, de 1500 ml ou, no caso de se tratar da preparação de uma vacina purificada e concentrada, o equivalente a 1 500 doses, a uma prova em cultura celular destinada a verificar a ausência do vírus poliomielítico vivo residual, segundo a técnica descrita para a colheita monovalente inactivada. Se o granel final for preparado a partir de uma mistura trivalente de colheitas monovalentes inactivadas, o ensaio de inactivação é efectuado nesta última, em vez de no granel final.
LOTE FINAL
Só pode ser libertado um lote final que satisfaça a cada um dos ensaios descritos em «Identificação», «Ensaio»
e «Actividade». Se os ensaios do formaldeído livre, do conservante antimicrobiano e a determinação da actividade in vivo tiverem sido efectuados com resultados satisfatórios no granel final, podem ser omitidos no lote final.
A aferição da actividade in vivo do componente poliomielítico pode não ser efectuada se tiver sido demonstrado, num determinado produto e para cada tipo de vírus poliomielítico, que os critérios de aceitação da determinação do teor em antigénio D são tais que fornecem os mesmos resultados que a aferição da actividade in vivo em termos de aceitação ou rejeição de um lote. Esta demonstração deve incluir ensaios sobre lotes com actividade alterada, produzidos experimentalmente, se necessário por tratamento pelo calor, por exemplo, ou por outros métodos que permitam diminuir a actividade imunogénica. Deverá ser avaliado o impacto sobre as aferições da actividade in vivo e in vitro e considerada a necessidade de revalidação se houver modificação significativa do processo de produção dos antigénios ou da sua formulação.
Se o ensaio da albumina sérica bovina tiver sido efectuado com resultados satisfatórios na mistura trivalente de colheitas monovalentes inactivadas ou no granel final, pode ser omitido no lote final.
IDENTIFICAÇÃO
Demonstra-se que a vacina contém os vírus poliomielíticos humanos do tipo 1, 2 e 3, por um método imunoquímico apropriado (2.7.1) tal como a determinação do antigénio D por imunoadsorção com enzima conjugada (ELISA).
ENSAIO
Formaldeído livre (2.4.18): no máximo, 0,2 g/l.
Conservante antimicrobiano. Determine, quando aplicável, o teor em conservante antimicrobiano por um método químico ou físico-químico apropriado. Não é inferior ao valor estabelecido como limiar de eficácia nem superior a 115 por cento do valor indicado no rótulo.
Teor em azoto proteico (método de Lowry). No máximo, 10 µg por dose humana unitária.
Albumina sérica bovina. No máximo, 50 ng por dose humana unitária determinda por um método imunoquímico apropriado (2.7.1).
Esterilidade (2.6.1). A vacina satisfaz ao ensaio de esterilidade.
Endotoxinas bacterianas (2.6.14): no máximo, 5 U.I. por dose humana unitária.
ACTIVIDADE
Teor em antigénio D. A fim de controlar a regularidade da produção, determine o teor em antigénio D para os vírus poliomielíticos humanos do tipo 1, 2 e 3 por um método imunoquímico apropriado (2.7.1), utilizando uma preparação de referência aferida em unidades da Farmacopeia Europeia do antigénio D. Para cada tipo, o teor determinado, expresso por comparação ao teor em antigénio D indicado no rótulo, situa-se dentro dos limites aprovados para o produto específico. A vacina inactivada contra a poliomielite PBR, aferida em unidades da Farmacopeia Europeia, destina-se a ser utilizada para a determinação do teor em antigénio D. A Unidade da Farmacopeia Europeia e a Unidade Internacional são equivalentes.
Ensaio in vivo. A vacina satisfaz à aferição in vivo da vacina inactivada contra a poliomielite (2.7.20).
ROTULAGEM No rótulo indica-se:
– os tipos de vírus poliomielíticos presentes na vacina, – a quantidade nominal de vírus de cada tipo (1, 2 e 3),
expressa em unidades da Ph. Eur. de antigénio D, por dose humana unitária,
– o substrato celular utilizado para a preparação da vacina.
Vacinas
Vacina inactivada oral contra a cólera