DEFINIÇÃO
A vacina oral contra a poliomielite é uma preparação obtida a partir de estirpes aprovadas do vírus poliomielítico vivo atenuado do tipo 1, 2 ou 3 cultivadas em culturas celulares in vitro aprovadas. A vacina contém um dos tipos víricos ou uma combinação de qualquer dos 3 tipos da estirpe de Sabin e é apresentada sob uma forma adaptada à administração oral.
A vacina apresenta-se na forma de um líquido límpido que pode ser corado em consequência da presença de um indicador de pH.
PRODUÇÃO
Deve ser demonstrado que as estirpes da vacina e o método de produção utilizados originam de modo constante vacinas orais contra a poliomielite de um poder imunogénico e de uma inocuidade adequadas para o homem.
A produção da vacina é baseada num sistema de lote semente viral. As linhas celulares são utilizadas segundo um sistema de banco de células. Se se tratar de células renais primárias de macaco, a produção satisfaz às exigências particulares indicadas adiante. Salvo excepção justificada e autorizada, o vírus contido na vacina final deve ter sofrido, no máximo, 2 passagens a partir do lote semente primário.
PREPARAÇÕES DE REFERÊNCIA
A vacina oral contra a poliomielite tipos 1, 2 e 3 PBR serve como preparação de referência do vírus para o ensaio de concentração em vírus infeccioso.
Os padrões internacionais do vírus poliomielítico do tipo 2 (Sabin) para a análise por titulação MAPREC (análise dos
vírus mutantes por PCR e fracção por enzima de restrição) e do vírus poliomielítico do tipo 3 da estirpe de Sabin, ADN sintético para análise por titulação MAPREC são apropriados para o ensaio dos marcadores genéticos e os ensaios moleculares para a regularidade da produção.
Estão disponíveis preparações de referência para cada tipo de vírus poliomielítico da estirpe de Sabin inicial mais 2 passagens, a saber WHO (SO 2)/l para o vírus tipo 1, WHO (SO 2)/II para o vírus tipo 2 e WHO (SO 2)III para o vírus tipo 3, para a comparação da neurovirulência in vivo com a neurovirulência das vacinas homotípicas. Os pedidos de preparações de referência internacionais para os ensaios de neurovirulência in vivo são feitos junto da OMS, Organização Mundial de Saúde, Serviço de produtos biológicos, Genève, Suiça.
Deve ser incluída em cada ensaio uma preparação de referência apropriada.
SUBSTRATO PARA A MULTIPLICAÇÃO DO VÍRUS
O vírus multiplica-se em células diplóides humanas (5.2.3), em linhas celulares contínuas (5.2.3) ou em células renais primárias de macaco (e inclui células que sofreram passagens em série a partir de células primárias de rim de macaco).
Células renais primárias de macaco. As exigências
particulares seguintes para o substrato para a multiplicação do vírus aplicam-se às vacinas preparadas em células renais primárias de macaco.
Macacos usados para a preparação de culturas de células renais e para o ensaio do vírus. Se a vacina é preparada em culturas de células renais primárias de macaco, utilizam-se animais pertencentes a uma espécie aprovada pela Autoridade competente, saudáveis, mantidos em colónias fechadas sob vigilância intensiva e que não tenham jamais servido em alguma experiência.
Os macacos são alojados em jaulas, tão espaçosas quanto possível, num biotério bem construído e suficientemente arejado. Devem ser tomadas as precauções necessárias para evitar infecção cruzada de uma jaula para a outra. Colocam-se, no máximo, 2 macacos por jaula e evita-se a troca de animais entre as jaulas. Antes de serem utilizados, estes macacos são mantidos no país de fabrico da vacina em grupos de quarentena durante um período, no mínimo, de 6 semanas.
Um grupo de quarentena representa uma colónia de macacos seleccionados, saudáveis, alojados num local dispondo de instalações limpas, de alimentação separada e privados de qualquer contacto com os outros macacos durante o período de quarentena. Se a qualquer momento do período de quarentena, a taxa global de mortalidade de um ou dos vários grupos atingir 5 por cento (excluindo as mortes devidas a acidentes ou a causas manifestamente não relacionadas com uma doença infecciosa), todos os macacos destes grupos são colocados em quarentena, no mínimo, durante 6 semanas.
Mesmo após o final do período de quarentena, os grupos mantêm-se isolados nas mesmas condições até ao momento da utilização dos animais. Quando o último macaco de um grupo for utilizado, o local que serviu para alojar este grupo é cuidadosamente limpo e descontaminado antes de acolher um novo grupo. Se forem utilizados rins de macacos obtidos por cesariana antes do termo, a mãe deve ser mantida em quarentena até ao final da gestação.
Os macacos em que são retirados os rins são anestesiados e examinados com cuidado a fim de detectar sinais de
Vacinas
Vacina oral contra a poliomielite
tuberculose ou de uma infecção por vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B).
Para a preparação de um lote semente ou da vacina não podem ser utilizados macacos que apresentem uma lesão patológica relacionada com a utilização dos seus rins, assim como os restantes macacos do respectivo grupo de quarentena, a menos que se prove que o seu uso não compromete a inocuidade do produto.
Todas as operações descritas nesta secção são efectuadas fora dos locais de produção da vacina.
Os macacos utilizados são isentos de anticorpos contra o vírus símio 40 (SV40), contra o vírus da imunodeficiência simiana e contra os spumavírus. A amostra de sangue utilizada na pesquisa de anticorpos dirigidos contra o SV40 deve ser colhida sempre que possível após ablação dos rins.
Se forem utilizados para a produção macacos Macaca spp.
verifica-se igualmente que são isentos de anticorpos contra o vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B). O vírus herpético humano utiliza-se como indicador da ausência de anticorpos contra o vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B) em consequência do perigo que inclui a manipulação deste último. Estabelece-se que os macacos utilizados para a produção de novos lotes de semente são isentos de anticorpos dirigidos contra o citomegalovirus símio (sCMV).
Culturas celulares de rins de macaco destinadas à produção da vacina. Os rins utilizados para a preparação de culturas de células não apresentam nenhum sinal patológico. Se a origem dos macacos for uma colónia mantida com vista à produção da vacina, podem ser utilizadas as células repicadas em série a partir de células primárias de rins de macaco, senão as células não repicadas em série. O vírus é cultivado em condições de assépsia. O soro animal pode ser utilizado para manter o crescimento celular, mas o meio utilizado para manter o crescimento celular durante a multiplicação vírica não deve conter soro.
Cada grupo de culturas celulares provenientes de um macaco ou, no máximo, de 10 fetos de macacos obtidos por cesariana antes do termo será preparado e controlado separadamente.
LOTES SEMENTE
A identidade e o histórico das estirpes do vírus poliomielítico utilizadas devem ser atestadas por documentos contendo nomeadamente informações relativas à origem das estirpes e às manipulações a que foram submetidas.
Os lotes semente de trabalho devem ter sofrido uma única passagem a partir do lote semente primário e um número de passagens aprovado a partir do vírus de Sabin inicial. Os lotes semente víricos são preparados em grande quantidade e conservados a uma temperatura inferior a –60°C.
Para a multiplicação do vírus só pode ser utilizado um lote semente que satisfaça aos ensaios descritos a seguir.
Identificação. Cada lote semente de trabalho é identificado como sendo o vírus poliomielítico do tipo indicado, com o auxílio de anticorpos específicos.
Concentração em vírus. Determinada pelo método
especificado abaixo, a concentração em vírus contribui para estabelecer a quantidade de vírus a utilizar no ensaio de neurovirulência.
Agentes estranhos (2.6.16). Se forem produzidos em células diplóides humanas (5.2.3) ou numa linha celular contínua, os lotes semente de trabalho satisfazem às exigências para os lotes semente das vacinas víricas. Se forem produzidos em células renais primárias de macaco, os lote semente de trabalho satisfazem às exigências dadas em «Multiplicação e colheita de vírus» e «Mistura monovalente de colheitas» e aos ensaios nos murganhos adultos, ratinhos recém-nascidos e cobaios prescritos em «Ensaio de agentes estranhos nas vacinas víricas para uso humano» (2.6.16).
Para além das exigências do capítulo 2.6.16, no caso das vacinas produzidas em linhas celulares e quando o lote semente é produzido em culturas celulares renais primárias de macaco, deve efectuar-se um ensaio validado de sCMV.
Os lotes semente de trabalho devem ser isentos de sequências detectáveis de ADN provenientes do vírus símio 40 (SV 40).
Neurovirulência. Cada lote semente primário e cada lote semente de trabalho satisfazem ao ensaio de neurovirulência da vacina oral contra a poliomielite em macacos (2.6.19).
Além disso, deve demonstrar-se que, pelo menos, os 4 primeiros lotes consecutivos de misturas monovalentes de colheitas preparadas a partir desses lotes semente satisfazem ao ensaio de neurovirulência da vacina oral contra a poliomielite em macacos (2.6.19), antes que o lote semente seja considerado como satisfatório para utilização.
Além disso, um lote semente deve cessar de ser utilizado para a produção da vacina se a frequência de obtenção de resultados não satisfatórios, para as misturas monovalentes de colheitas que deles são obtidos, se torna superior ao valor previsto estatisticamente. Este valor é estimado para cada controlo sobre a totalidade dos graneis controlados e é dado pela probabilidade de falsas rejeições quando de um primeiro controlo (isto é, 1 por cento), se a probabilidade de falsas rejeições quando de uma repetição é desprezável. Se o ensaio só for efectuado pelo fabricante, as lâminas do ensaio são submetidas à Autoridade de controlo para exame.
Marcadores genéticos. Cada lote semente de trabalho é submetido ao ensaio descrito em «Mistura monovalente de colheitas» para estabelecer a sua capacidade em se multiplicar às temperaturas compreendidas entre 36°C e 40°C. Um perfil (percentagem de mutantes) das colheitas de vírus é preparado com o auxílio de um ensaio MAPREC. Os lotes semente de vírus tipo 3 satisfazem ao ensaio MAPREC descrito em
«Mistura monovalente de colheitas».
MULTIPLICAÇÃO E COLHEITA
Todas as operações efectuadas nos bancos de células e as culturas celulares que daí resultam é feita em condições de assépsia e em locais onde não foi executada nenhuma outra manipulação de células. O soro animal aprovado (mas não humano) pode ser utilizado na composição dos meios de cultura, mas o meio de cultura final utilizado para manter o crescimento celular durante a multiplicação vírica não deve conter soro animal. É demonstrado que no soro e na tripsina utilizados na preparação das suspensões de células e dos meios são isentos de agentes estranhos. O meio de cultura celular pode conter um indicador de pH, como o vermelho de fenol, e antibióticos aprovados à mais fraca concentração eficaz. No decurso da produção, é preferível utilizar um substrato isento de antibióticos. No dia da inoculação com o lote semente de trabalho do vírus, conserve, no mínimo, 5 por cento ou 1 000 ml, escolhendo a quantidade média,
Vacinas
Vacina oral contra a poliomielite
culturas celulares utilizadas na produção da vacina como culturas celulares não infectadas (células testemunha); as exigências particulares dadas a seguir aplicam-se às células testemunha, se a vacina for produzida em células renais primárias de macaco. A colheita do vírus é efectuada o mais tardar 4 dias após a inoculação. Após inoculação da cultura celular com o lote semente de trabalho do vírus, as culturas celulares infectadas são mantidas a uma temperatura determinada, que tenha sido demonstrada apropriada entre 33°C e 35°C; a temperatura é mantida constante a ± 0,5°C aproximadamente; as culturas celulares testemunha são mantidas a 33-35°C, durante um período de incubação apropriado.
Na preparação da mistura monovalente de colheitas só pode ser utilizada uma colheita única que satisfaça às exigências descritas a seguir.
Concentração em vírus. A concentração em vírus nas colheitas de vírus é determinada como prescrito em
«Concentração em vírus» a fim de assegurar a regularidade da produção e determinar a diluição a utilizar na preparação do granel final.
Ensaios moleculares para a regularidade da produção.
Efectue a aferição MAPREC em cada colheita de vírus.
Os critérios de aceitação e de rejeição da regularidade da produção são determinados de acordo com a Autoridade competente para cada fabricante e para cada lote semente de trabalho. Estes critérios são revistos e actualizados regularmente com o acordo da Autoridade competente.
É necessário um exame aprofundado se os resultados de produção incompatíveis com os antecedentes forem obtidos para uma colheita vírica.
Células testemunhas. As células testemunhas satisfazem a um ensaio de identificação e às exigências dos agentes estranhos (2.6.16), ou se forem utilizadas para a produção células renais primárias de macaco, as exigências prescritas abaixo.
Células renais primárias de macaco. As exigências
particulares seguintes aplicam-se à multiplicação e colheita do vírus nas células renais primárias de macaco.
Culturas celulares. No dia da inoculação do vírus do lote semente de trabalho, cada cultura celular será examinada a fim de verificar que não apresenta degenerescência devido a um agente infeccioso. Se este exame revelar a presença de um agente contaminante numa cultura, a totalidade do grupo de culturas em causa será rejeitada.
No dia da inoculação do vírus do lote semente de trabalho, retire uma amostra, no mínimo de 30 ml, da mistura dos líquidos provenientes das culturas celulares dos rins de cada macaco ou, no máximo, de 10 fetos obtidos por cesariana antes do termo e dividida em 2 porções iguais. Examine uma das porções em culturas celulares de rins provenientes de 1 macaco da mesma espécie do animal utilizado para a produção da vacina, mas não do mesmo animal. Examine a outra porção, se necessário, em culturas celulares de rins de uma outra espécie de macaco, de maneira a que os ensaios sejam efectuados em culturas celulares provenientes, no mínimo, de 1 espécie conhecida por ser sensível ao vírus SV40. A mistura de líquidos é introduzida em frascos contendo essas culturas celulares de modo que a diluição da mistura no meio nutritivo não seja superior a 1/4. A superfície da camada celular é de, pelo menos, 3 cm2/ml
de mistura. Conserve, no mínimo, um frasco de cada tipo de cultura celular como testemunha sem ser semeado. Se a espécie de macaco utilizada para a produção é conhecida por ser sensível ao SV40, não é necessário repetir a prova numa segunda espécie. O soro animal pode ser usado para a multiplicação celular, desde que seja isento de anticorpos anti-SV40, mas após a inoculação da amostra o meio de manutenção não deve conter soro animal excepto nas condições descritas a seguir.
As culturas são incubadas entre 35-37°C e mantidas em observação, no mínimo, durante 4 semanas. Durante este período e após 2 semanas, no mínimo, de incubação efectue uma subcultura do líquido proveniente de cada uma dessas culturas no mesmo sistema de cultura celular. As subculturas são igualmente mantidas em observação, no mínimo, durante 2 semanas.
No momento de efectuar a repicagem pode ser adicionado soro à cultura inicial, na condição que não contenha anticorpos anti-SV40.
As técnicas de imunofluorescência podem ser úteis para detectar o vírus SV40 ou outros vírus nas células.
A ausência do vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B) ou outros vírus é verificada numa outra amostra, no mínimo, de 10 ml da mistura de líquidos. A pesquisa é efectuada em culturas de células renais de coelho. Deve ser estabelecido previamente que o soro usado no meio nutritivo das culturas é isento de inibidores do vírus B. O herpesvírus humano tem sido utilizado como indicador da ausência de inibidores do vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B) em virtude do perigo que implica a manipulação deste último. A amostra é introduzida em frascos contendo as culturas celulares de modo que a diluição da mistura de líquidos no meio nutritivo não seja superior a 1/4. A superfície da camada celular, no mínimo, é de 3 cm2/ml de mistura. Sem ser semeado é conservado, no mínimo, um frasco de cultura celular como testemunha.
As culturas são incubadas entre 35-37°C e mantidas em observação, no mínimo, durante 2 semanas.
A ausência de agentes contaminantes é igualmente verificada numa outra amostra da mistura de líquidos, retirada das culturas celulares no dia de inoculação do vírus semente, inoculando 10 ml da amostra em culturas celulares humanas sensíveis ao vírus da rubéola.
Os ensaios só são válidos se a proporção dos frascos de cultura rejeitados antes do fim do período das respectivas provas por razões acidentais não específicas não ultrapassar os 20 por cento.
Se esses ensaios revelarem a presença de um agente estranho, a colheita única proveniente do conjunto das culturas celulares em causa é considerada imprópria para a produção da vacina.
Se for demonstrada a presença do vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B), o fabrico da vacina oral contra a poliomielite é interrompido e informada a Autoridade competente. O fabrico, não pode ser retomado antes de ser efectuado um inquérito, tomadas as devidas precauções de modo a impedir a reaparição da infecção e só se retoma o fabrico após a concordância da Autoridade competente.
Se os ensaios mencionados acima, não forem efectuados imediatamente, as amostras da mistura de líquidos são
Vacinas
Vacina oral contra a poliomielite
conservadas a uma temperatura igual ou inferior a -60°C, à excepção da amostra destinada à pesquisa do vírus B, que pode ser conservada a 4°C, desde que o ensaio seja efectuado nos 7 dias seguintes à colheita.
Células testemunha. No dia da inoculação do vírus do lote semente de trabalho, 25 por cento (no máximo, 2,5 litros) da suspensão celular proveniente dos rins de cada macaco ou, no máximo, de 10 macacos obtidos por cesariana antes do termo, é retirada para preparar as culturas celulares não semeadas (células testemunha). Estas culturas que servirão de testemunha são incubadas nas mesmas condições que as culturas semeadas, no mínimo, durante 2 semanas e são examinadas durante este período para a pesquisa de eventuais alterações citopatogénicas. Os ensaios só são válidos se a proporção de culturas celulares testemunha rejeitadas por razões acidentais não específicas não exceder os 20 por cento. No fim do período de observação, as culturas celulares testemunha são examinadas para assegurar que não apresentam sinais de degenerescência devida um agente infeccioso. Se este exame ou um dos ensaios prescritos na presente secção revelar a presença de um agente estranho numa cultura testemunha, o vírus poliomielítico das culturas semeadas provenientes do mesmo grupo é rejeitado.
Pesquisa de vírus hemadsorventes. No momento da colheita, ou nos 4 dias seguintes à sementeira das culturas de
produção com o vírus do lote semente de trabalho, retire uma amostra de 4 por cento das culturas celulares testemunha na qual se pesquisa a presença de vírus hemadsorventes.
No fim do período de observação, efectue a mesma pesquisa nas restantes culturas celulares testemunha. As provas são praticadas como é indicado em «Ensaios dos agentes estranhos nas vacinas víricas para uso humano» (2.6.16).
Pesquisa de outros agentes estranhos. No momento da colheita, ou nos 7 dias seguintes à sementeira, das culturas de produção com o vírus do lote semente de trabalho, retiram-se da mistura de líquidos de cada grupo de culturas testemunha uma amostra, no mínimo, de 20 ml que é submetida a ensaios em 2 tipos de culturas de células renais de macaco, como indicado abaixo.
No fim do período de observação das culturas celulares testemunha de origem são retiradas das amostras similares da mistura de líquidos e os ensaios referidos nesta secção em 2 tipos de culturas de células de rins de macaco, assim como em culturas celulares de coelho, são repetidos como indicado abaixo em «Culturas celulares».
Se for demonstrada a presença do vírus herpético dos cercopitecídios tipo 1 (vírus B), as culturas destinadas à produção não são utilizadas e as medidas indicadas abaixo respeitantes à produção da vacina são aplicadas.
Os líquidos retirados das culturas celulares testemunha no momento da colheita do vírus e no fim do período de observação podem ser misturados antes dos ensaios dos agentes contaminantes. Uma amostra de 2 por cento da mistura é examinada em cada um dos sistemas das culturas celulares indicadas.
Colheitas únicas
Ensaios efectuados nas colheitas únicas neutralizadas provenientes de culturas de células renais primárias de macaco. Uma amostra, no mínimo, de 10 ml de cada colheita única é neutralizada através de um soro específico do tipo de poliovírus considerado. Este soro é preparado por imunização de animais que não seja o macaco, com o auxílio
Ensaios efectuados nas colheitas únicas neutralizadas provenientes de culturas de células renais primárias de macaco. Uma amostra, no mínimo, de 10 ml de cada colheita única é neutralizada através de um soro específico do tipo de poliovírus considerado. Este soro é preparado por imunização de animais que não seja o macaco, com o auxílio