DEFINIÇÃO
A vacina viva contra a varíola é uma preparação líquida ou liofilizada do vírus vivo da vaccinia cultivada «in ovo» na membrana de embriões de galinha, em culturas celulares ou injectado na pele de animais vivos.
A presente monografia aplica-se às vacinas produzidas a partir de estirpes com eficácia confirmada no homem, em particular aquelas que foram utilizadas para a erradicação da varíola, como por exemplo a estirpe Lister (por vezes chamada estirpe Lister/Elstree) e a estirpe de New York City Board of Health (NYCBOH). Não se aplica às estirpes não replicativas, tais como a estirpe do vírus modificado de Ankara (MVA).
Vacinas
Vacina viva contra a varíola
PRODUÇÃO
DISPOSIÇÕES GERAIS
Deve ser estabelecido que o método de produção utilizado dá origem de forma reprodutível a vacinas contra a varíola com inocuidade e com poder imunogénico satisfatórios no homem. Estabelece-se que a estirpe utilizada produz lesões cutâneas típicas da vaccinia no homem. A produção baseia-se num sistema de lote semente.
O método de produção é objecto de uma validação que permite demonstrar que o produto, quando aplicável, satisfaz ao ensaio de toxicidade anormal dos soros e vacinas para uso humano (2.6.9).
A preparação internacional de referência da vacina contra a varíola satisfaz como preparação de referência para a aferição do vírus.
SUBSTRATO PARA A MULTIPLICAÇÃO DO VÍRUS Animais utilizados na produção de vacinas de origem cutânea. Se a vacina for preparada na pele de animais, utilizam-se animais pertencentes a uma espécie aprovada pela Autoridade competente, saudáveis, mantidos em colónias fechadas ou sob vigilância intensiva e que nunca tenham servido para qualquer experiência. Apenas os animais sensíveis às infecções do vírus da vaccínia por inoculação dérmica são utilizados na produção da vacina.
Os animais são alojados em jaulas, colocadas tão
espaçadas quanto possível, num biotério bem construído e suficientemente arejado. Devem ser tomadas as precauções necessárias para evitar qualquer infecção cruzada de uma jaula para a outra. Por estábulo coloca-se, no máximo, 1 animal de grande porte. Colocam-se, no máximo, 2 animais de pequeno porte por jaula e evita-se qualquer troca de animais entre as jaulas. Antes de serem utilizados, os animais são mantidos no país de fabrico da vacina, em grupos de quarentena durante um período, no mínimo, de 6 semanas.
Se, em qualquer momento do período de quarentena, a taxa global de mortalidade do grupo atingir os 5 por cento, nenhum dos animais do grupo será utilizado na produção da vacina.
Mesmo após o final do período de quarentena, os grupos mantêm-se isolados permanecendo nas mesmas condições até ao momento da utilização dos animais. Quando for utilizado o último animal de um grupo, o local que serviu para alojar este grupo é cuidadosamente limpo e descontaminado antes de acolher um novo grupo.
Os animais destinados a receber o inóculo são anestesiados e cuidadosamente examinados. Para a preparação de um lote semente ou de uma vacina, não pode ser utilizado nenhum animal que apresente uma lesão patológica, assim como os restantes animais do respectivo grupo de quarentena, a menos que se prove que a sua utilização não compromete a inocuidade do produto.
As medidas profilácticas e de diagnóstico adoptadas para excluir a presença de doenças infecciosas devem ser aprovadas pela Autoridade competente. Estas medidas podem variar em função da espécie de animais utilizada e das doenças aos quais estes animais correm o risco de serem expostos no país de produção da vacina. O perigo de propagação de doenças aos países para os quais a vacina
é susceptível de ser enviada, deve também ser tido em consideração. As doenças como a febre aftosa, a brucelose, a febre Q, a tuberculose ou a dermatomicose devem sempre ser objecto de uma particular atenção, e pode também ser necessário considerar as doenças como o eritema contagioso (orf), o carbúnculo, a peste bovina, a septicemia hemorrágica, a febre do vale do Rift ou outras.
Ovos embrionados. Os ovos embrionados utilizados na produção são obtidos de bandos isentos de microrganismos patogénicos específicos (5.2.2).
Células diplóides humanas, linhas celulares contínuas. As células diplóides humanas e as linhas celulares contínuas satisfazem às exigências relativas aos substratos celulares (5.2.3).
Células primárias de embriões de galinha. As células primárias de embriões de galinha são provenientes de bandos de frangos isentos de microrganismos patogénicos específicos (5.2.2).
Células primárias de rins de coelho. Apenas são utilizados como origem os coelhos saudáveis provenientes de uma exploração fechada e aprovada pela Autoridade competente.
Os animais, de preferência com idades entre 2-4 semanas, são controlados de modo a garantir a ausência de microrganismos patogénicos específicos ou de anticorpos correspondentes.
Se forem introduzidos animais novos numa exploração, estes são mantidos em quarentena, no mínimo, durante 2 meses e verifica-se que estão isentos de microrganismos patogénicos específicos. Os animais destinados a fornecer os rins, nunca serviram em qualquer experiência, nomeadamente aquelas que implicam a utilização de agentes infecciosos. Efectua-se na colónia com intervalos regulares uma pesquisa de vírus de zoonoses e de marcadores de contaminação.
No momento do estabelecimento da colónia, todos os animais são controlados a fim de se determinar a ausência de anticorpos dirigidos contra os possíveis contaminantes víricos conhecidos pela sua capacidade em infectar os humanos ou pela sua capacidade em se replicar «in vitro» em células de origem humana. Efectua-se um ensaio de pesquisa de retrovirus por um método sensível de transcrição inversa, seguida da reacção de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) Podem igualmente ser utilizados ensaios de pesquisa de retrovirus pelas técnicas de amplificação dos ácidos nucleicos (2.6.21).
Uma vez estabelecida a colónia, controla-se efectuando ensaios num grupo representativo, no mínimo, de 5 por cento dos animais, que são sangrados em intervalos apropriados (por exemplo, todos os meses). Adicionalmente controla-se a colónia para detectar a presença de
microrganismos patogénicos, como as micobactérias, as leveduras, os bolores e os micoplasmas. Estabelece-se um programa de controlo de modo a garantir que todos os animais são verificados com intervalos regulares.
Qualquer animal que morra é examinado para determinar a causa da morte. Se for estabelecida a presença de um agente infeccioso responsável pela morte no seio da colónia, a produção da vacina contra a varíola é interrompida.
No momento da colheita dos rins, os animais são examinados a fim de detectar a presença de anomalias e, no caso de resultado positivo, os animais não são utilizados para a produção da vacina.
Vacinas
Vacina viva contra a varíola
Cada uma das culturas controlo resultantes dum mesmo grupo de animais utilizados para produzir uma colheita única de vírus deve permanecer identificável, até ao fim de todos os ensaios, nomeadamente os ensaios dos agentes estranhos.
LOTE SEMENTE
A identidade do isolado do vírus da vaccínia utilizado para o lote semente primário é atestada por documentos que indiquem nomeadamente a sua origem e os ensaios utilizados para a sua caracterização.
Os vírus provenientes do lote semente de trabalho devem apresentar as mesmas características que a estirpe utilizada para preparar o lote semente primário. O número de passagens exigidas para produzir as colheitas únicas a partir do isolado de origem deve ser limitada e aprovada pela Autoridade competente. A vacina deve ser produzida a partir do lote semente de trabalho, com um número mínimo de passagens intermediárias.
Podendo a produção de culturas celulares e a selecção clonal (por exemplo, purificação em placa) levar a uma alteração das características do vírus, o vírus da semente primária deve ser também completamente caracterizado, quanto possível, comparando, por exemplo, o perfil de inocuidade e as características biológicas da estirpe com os do isolado parental. A caracterização deve incluir as etapas seguintes:
– análises antigénicas com soros e/ou anticorpos monoclonais,
– estudos biológicos como a determinação do título infeccioso, o doseamento em membrana corio-alantóide (doseamento MAC), o rendimento «in vitro» e as características do crescimento «in vitro» num modelo animal apropriado,
– análises genéticas como a cartografia de restrição/e transferência de ADN (técnica de Southern), análises por PCR e estudos de sequenciação limitadas,
– a estabilidade fenotípica e genética durante a passagem no substrato,
– ensaios de neurovirulência e estudos do poder imunogénico.
São igualmente efectuados ensaios de caracterização em cada lote semente de trabalho e em 3 lotes de vacina resultantes do primeiro lote semente de trabalho, para verificar a estabilidade genética da estirpe da vacina.
Para a multiplicação do vírus só pode ser utilizado uma semente vírica que satisfaça às exigências seguintes.
Identificação. Cada semente de trabalho identifica-se como semente do vírus da vaccínia com anticorpos específicos e por ensaios moleculares. Efectuam-se ensaios apropriados para excluir a presença do vírus da varíola e de outros ortopoxvírus.
Concentração em vírus. Determinada pelo doseamento na MAC ou por uma aferição «in vitro» validada apropriada (aferição pelo método de placas ou aferição da DICC50).
A concentração em vírus constitui a base a partir da qual é fixada a quantidade de vírus utilizado no ensaio de neurovirulência.
Agentes estranhos (2.6.16). Se o lote semente de trabalho for produzido em ovos embrionados, em células diplóides
ou numa linha celular contínua, satisfaz às exigências relativas aos lotes semente para vacinas víricas. Os lotes semente produzidos em ovos embrionados e os lotes semente produzidos em culturas celulares primárias satisfazem às exigências descritas a seguir.
Se os ensaios prescritos não puderem ser efectuados porque não é possível a neutralização completa do vírus semente, o lote semente pode ser diluído, segundo um factor de diluição idêntico ao que foi utilizado nos inóculos para a produção da vacina antes da pesquisa dos vírus estranhos. Podem ser encarados os ensaios específicos suplementares para a pesquisa de vírus estranhos, utilizando técnicas validadas de amplificação dos ácidos nucleicos (2.6.21) ou métodos imunoquímicos (2.7.1). Se não se puder efectuar o método de epifluorescência em cultura celular, substitui-se por um ensaio de amplificação dos ácidos nucleicos.
Para além disso, os lotes semente destinados a uma produção em ovos embrionados ou em cultura celular devem ser controlados a fim de pesquisar qualquer transferência de potenciais agentes estranhos a partir da semente de origem.
Sendo certo que é pouco provável que seja conhecido o detalhe completo de todas as passagens sofridas pela semente original e que é possível que tenham sido utilizadas várias espécies, estes ensaios suplementares devem, no mínimo, cobrir os agentes estranhos mais problemáticos.
A contaminação dos lotes semente primário e de trabalho preparados na pele dos animais deve ser limitada pelo controlo rigoroso das instalações, do pessoal, dos animais utilizados na produção e através de ensaios específicos nas sementes. Entretanto, pode ser difícil garantir que os lotes semente preparados na pele dos animais sejam totalmente isentos de agentes estranhos e devem encarar-se os processos da produção, permitindo eliminá-los ou reduzi-los. Tais lotes devem satisfazer às exigências indicadas a seguir. A ausência de agentes patogénicos humanos específicos deve ser confirmada por ensaios suplementares, como, por exemplo, culturas bacterianas ou fúngicas, cultura vírica, ensaios de agentes víricos por amplificação dos ácidos nucleicos (2.6.21).
Neurovirulência. Avalia-se a neurovirulência dos lotes semente primário e de trabalho utilizando um modelo animal apropriado, por exemplo, em macacos ou em murganhos. O isolado parental utiliza-se como semente testemunha. Se o isolado de origem não está disponível para este efeito, podem ser utilizadas materiais equivalentes.
MULTIPLICAÇÃO E COLHEITA
VACINA PRODUZIDA EM ANIMAIS VIVOS
Antes da inoculação, os animais devem ser limpos e mantidos em seguida nas jaulas em perfeitas condições até à colheita da vacina. Nos 5 dias que antecedem a inoculação e durante a incubação, os animais devem ser mantidos sob vigilância veterinária, não devem apresentar nenhum sinal de doença e regista-se diariamente a sua temperatura rectal. Em caso de subida anormal da temperatura ou de se verificar algum sinal clínico de doença, a produção da vacina a partir desse grupo de animais deve ser suspensa até à determinação da causa.
A inoculação do vírus semente faz-se nas partes do animal que não correm o risco de ser conspurcadas pela urina ou excrementos. A área utilizada para a inoculação deve ser rapada e limpa de modo a obter condições tão próximas quanto possível da assepsia cirúrgica. Se for utilizada uma
Vacinas
Vacina viva contra a varíola
substância anti-séptica nociva ao vírus durante a limpeza, deve ser eliminada através de uma cuidadosa lavagem com água estéril antes da inoculação. Durante a inoculação a área exposta do animal não utilizada para a inoculação deve ser coberta com uma capa estéril. A experiência demonstra que a área ventral de fêmeas é apropriada para a inoculação e que é mais apropriado inocular nos flancos dos machos.
Antes da colheita do vírus da vaccínia, deve ser eliminado qualquer antibiótico e a zona inoculada deve ser limpa. As áreas não inoculadas devem ser cobertas com uma capa estéril. Antes da colheita, os animais devem ser anestesiados e sangrados para evitar importantes misturas da vaccínia com o sangue. O material da vaccínia de cada animal deve ser retirado separadamente tomando as devidas precauções de assepsia. Todos os animais utilizados na produção da vacina devem ser autopsiados. Se além da varíola, é evidenciada uma doença sistémica ou generalizada, a vacina proveniente desse animal deve ser destruída. Se a doença for considerada como transmissível, a colheita resultante do conjunto do grupo de animais expostos deve ser destruída, salvo excepção justificada e autorizada.
VACINA PRODUZIDA EM OVOS
Qualquer manipulação de ovos embrionados é feita em condições de assepsia num local onde não são manipulados ao mesmo tempo células ou outros agentes infecciosos.
Após inoculação e incubação a uma temperatura controlada, apenas são retirados os embriões de galinha vivos e apropriados. A idade dos embriões no momento da colheita do vírus é calculada a partir da introdução inicial do ovo na incubadora e não deve ultrapassar 12 dias. Após homogeneização e clarificação por centrifugação, o extracto da polpa embrionária é controlado segundo as especificações descritas a seguir e mantido a uma temperatura inferior ou igual a –70°C até à próxima manipulação. As colheitas víricas que satisfazem aos ensaios prescritos podem ser misturadas.
Em nenhuma fase da produção é adicionada uma proteína humana à suspensão vírica. Se são adicionados estabilizantes, demonstra-se que não têm nenhuma propriedade antigénica nem sensibilizante para o homem.
Na preparação do granel final só pode ser utilizada uma colheita única que satisfaça aos ensaios descritos a seguir.
Ovos testemunha. Os ovos testemunha satisfazem aos ensaios dos agentes estranhos (2.6.16). Uma amostra de 2 por cento dos ovos embrionados não inoculados (no mínimo, 20 e, no máximo, 50) de cada um dos lotes utilizados para a produção da vacina é incubada nas mesmas condições que os ovos inoculados. No momento da colheita vírica, os ovos não inoculados sofrem o mesmo tratamento que os ovos inoculados.
Esterilidade (2.6.1). A colheita vírica satisfaz ao ensaio de esterilidade. Utilize 10 ml por cada meio.
VACINA PRODUZIDA EM CULTURAS CELULARES (CÉLULAS PRIMÁRIAS DE EMBRIÕES DE GALINHA, CÉLULAS PRIMÁRIAS DE RIM DE COELHO, CÉLULAS DIPLÓIDES HUMANAS OU LINHAS CELULARES CONTÍNUAS)
Todas as manipulações efectuadas no banco de células e as culturas celulares que daí resultam são feitas em condições
de assepsia num local onde não são manipuladas outras células ao mesmo tempo. Na composição dos meios de cultura pode ser utilizado um soro animal aprovado (com excepção do soro humano), mas o meio final utilizado para manter a viabilidade celular durante a multiplicação vírica não deve conter soro animal. Verifica-se a ausência de agentes estranhos no soro e na tripsina, utilizados para a preparação das suspensões celulares e dos meios. Os meios de cultura celular podem conter um indicador de pH, como o vermelho de fenol e antibióticos aprovados na concentração correspondente ao limiar mínimo de eficácia.
Durante a produção é preferível utilizar um substrato isento de antibióticos. No dia da inoculação com o lote semente de trabalho do vírus conserve, no mínimo, 5 por cento ou 1000 ml, escolhendo a quantidade menor, das culturas celulares utilizadas na produção da vacina, como culturas celulares não infectadas (células testemunhas); as exigências particulares dadas a seguir aplicam-se às células testemunha se a vacina for produzida em células primárias de rim de coelho.
Após as células produtoras terem sido colocadas em contacto com o lote semente de trabalho do vírus, as culturas celulares infectadas são mantidas a uma determinada temperatura e a colheita do vírus é efectuada após um período de incubação apropriado.
Para a preparação da mistura de colheitas monovalentes, só pode ser utilizada uma colheita única que satisfaça às exigências descritas a seguir.
Células testemunha. As células testemunha da cultura celular de produção de que resulta a colheita vírica satisfazem a um ensaio de identificação e às exigências dos agentes estranhos (2.6.16), ou, se forem utilizadas as células primárias de rim de coelho, satisfazem aos ensaios específicos prescritos a seguir. O ensaio só é válido se a proporção de culturas celulares testemunhas rejeitadas antes do final do período de observação não exceder 20 por cento.
Agentes estranhos (2.6.16). A colheita única satisfaz às exigências dos agentes estranhos. Pode ser difícil conseguir a neutralização completa do vírus da vaccínia se a concentração em vírus for elevada. Neste caso, os ensaios específicos como os ensaios de amplificação dos ácidos nucleicos (2.6.21) ou os ensaios imunoquímicos (2.7.1) podem substituir-se por ensaios não específicos em cultura celular ou em ovos. Por razão de economia de reagentes biológicos, como os soros que neutralizam o vírus da vaccínia, os ensaios dos agentes estranhos em vez de serem efectuados nas colheitas únicas podem primeiro ser efectuados no granel final.
Vacina preparada em células primárias de embrião de galinha. A presença de adenovírus e de retrovírus aviários, como o vírus da leucose aviária, é pesquisada numa amostra de uma mistura de líquidos proveniente de culturas
testemunhas. Adicionalmente, um volume equivalente a 100 doses humanas de vacina ou 10 ml retirado de cada mistura de vírus neutralizado é submetido a um ensaio, num grupo de ovos embrionados, inoculados por via alantóide e uma amostra semelhante é submetida a um ensaio num grupo de ovos distinto, inoculados por via vitelina. Nestes dois casos, utilize 0,5 ml de inóculo por ovo. Decorridos 3-7 dias, a mistura do vírus satisfaz ao ensaio se não for detectado nenhum sinal da presença de qualquer agente estranho.
Vacina preparada em culturas celulares primárias de rim de coelho. As exigências particulares seguintes aplicam-se à multiplicação, à colheita e ao controlo do vírus. No dia da
Vacinas
Vacina viva contra a varíola
inoculação do vírus do lote semente de trabalho, retira-se das culturas celulares dos rins de cada grupo de animais utilizados uma amostra, no mínimo, de 30 ml da mistura dos líquidos que serviram para preparar a suspensão de células primárias.
A mistura de líquidos é introduzida em culturas celulares de modo que a diluição da mistura não ultrapasse 1/4. As culturas são incubadas a 34-36°C e mantidas em observação, no mínimo, durante 4 semanas. Durante este período e após, no mínimo, 2 semanas de incubação, efectua-se, no mínimo, 1 subcultura do líquido proveniente de cada uma destas culturas.
Estas subculturas são igualmente mantidas em observação durante 2 semanas. O ensaio só é válido se a proporção de culturas rejeitadas não exceder 20 por cento. Se for detectada a presença de um agente estranho, o conjunto das culturas celulares não é utilizado na produção da vacina.
– Culturas celulares testemunhas. Culturas preparadas no dia da inoculação do vírus do lote semente de trabalho a partir de 25 por cento das suspensões celulares provenientes dos rins de cada grupo de animais são conservadas como testemunhas. Estas culturas celulares testemunhas são incubadas nas mesmas condições que as culturas semeadas, no mínimo, durante 2 semanas.
O ensaio só é válido se a proporção de culturas celulares
O ensaio só é válido se a proporção de culturas celulares