R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 ( l ) : 4 5 - 5 0 , j a n - m a r , 1 9 9 2
A N Á L I S E Q U A N T IT A T IV A D E M A S T Ó C IT O S E D E
G R A N U L Ó C IT O S E O S IN Ó F IL O S N O M IO C Á R D IO D E
R A T O S W IS T A R C R O N IC A M E N T E IN F E C T A D O S P E L O
T R Y P A N O S O M A C R U Z 1 . C O N T R IB U IÇ Ã O A O
C O N H E C IM E N T O D A F IB R O S E M IO C Á R D IA
M aria da Conceição Nascimento Pinheiro, Paulo Sérgio Siebra Beraldo, Luiz
Fernando Junqueira Júnior, Edison Reis Lopes e Edm undo Chapadeiro
F o i f e i t o o e s t u d o q u a n ti ta t iv o d e m a s tó c i to s e d e g r a n u l ó c i t o s e o s i n ó f il o s n o m i o c á r d i o d e 4 0 r a t o s a lb i n o s W istar. T r in ta a n im a is e n c o n tr a v a m - s e n a f a s e t a r d i a d a in f e c ç ã o (8 o ' m ê s ) p r o d u z i d a p e l a s c e p a s S ã o F e lip e , Y e C o lo m b ia n a d o T ryp an osom a cru zi, e a p r e s e n t a v a m g r a u s v a r i á v e i s d e m i o c a r d i t e c r ô n i c a ; 1 0 r a t o s s e r v i r a m c o m o c o n tr o le s . M i o c a r d i t e c r ô n i c a f i b r o s a n t e ( f ib r o s e ) o c o r r e u e m 4 0 % d o s a n im a is in f e c ta d o s e d e t e c t o u - s e a u m e n to d o n ú m e r o d e m a s t ó c i t o s n o s a n im a is , c h a g á s i c o s , o q u a l s e a s s o c i o u à in f e c ç ã o m a s n ã o à f i b r o s e m i o c á r d i c a . N ã o s e c o n s t a to u a u m e n to d o n ú m e r o d e e o s in ó f ilo s .
P a la v r a s - c h a v e s : D o e n ç a d e C h a g a s . F ib r o s e m i o c á r d i c a . M a s t ó c i t o s . G r a n u ló c i to s e o s in ó f ilo s .
Tem -se atribuído à fibrose m iocárdica papel im portante na insuficiência cardíaca da doença de C hagas, a qual resultaria de um a contínua produção de colágeno no foco inflam atório4 9. D e modo sim ilar adm item alguns9 25 que a fibrose das m usculares próprias do tubo digestivo poderia ser tam b ém um dos fa to re s p a to g e n é tic o s do m egaesôfago e do megacólon observados na mesma doença.
N a tr ip a n o s o m ía s e c r u z i, h u m a n a e experim ental, tanto no coração comb no esôfago, tem sido relatado aumento do núm ero de mastócitos, ligado ou não ao processo inflam atório121221 23 25. Quanto à participação dos eosinófilos, em bora não e x is tin d o e s tu d o s q u a n tita tiv o s , tra b a lh o s identificam sua presença tanto no coração como no esôfago de chagásicos crônicos18 1° u 13 14151617
21 22 24 25 _
C onstata-se, p o rtan to , não estar clara a participação dos m astócitos e dos eosinófilos na fibrose que acom panha a m iocardite e a inflam ação da m usculatura do tubo digestivo na doença de
T ra b a lh o d o C u rs o d e P ó s-G ra d u a ç ã o e m P a to lo g ia H u m an a da F a c u ld a d e d e M e d ic in a d o T riâ n g u lo M in e iro , U b e ra b a , M G e d o D e p a rta m e n to d e C lín ic a M é d ic a d a F a c u ld a d e de C iê n c ia s d a S a ú d e d a U n iv e rsid a d e d e B rasília, B rasília, D F . Endereço para correspondência: P r o f . E d m u n d o C h a p a d e iro , D e p to . d e P a to lo g ia , M e d ic in a L eg al e D e o n to lo g ia M é d ic a / F M T M , A v . G e tú lio G u a ritá 130, 3 8 0 2 5 -0 5 0 U b e ra b a , M G . R e c e b id o p a ra p u b lic a ç ã o e m 0 3 /0 9 /9 1 .
Chagas.
A finalidade deste trabalho é investigar a presença e o papel dos m astócitos e granulócitos eosinófilos, na fibrose m iocárdica, do rato chagásico crônico.
M A TER IA L E M ÉTO D O S
Consta de corações de 40 ratos albinos W istar, 30 na fase tardia (por volta de 8 meses) de infecção chagásica, produzida por via intraperitonial pelas cepas Y, São Felipe (12SF) e C olom biana (Col) do T r y p a n o s o m a c r u z i e 10 não infectados (grupo controle). Os ratos infectados foram divididos em 3 grupos de 10 anim ais, inoculados com baixo, médio e alto inoculo correspondendo, respectivam ente a 2000-3000, 4000-5000 e 6000 parasitas/g de peso corporal. F oi a seguinte a distribuição dos anim ais segundo a cepa e a intensidade do inóculo:
Inóculo C ep a Y C ep a 12S F C ep a C o l
baixo 3 3 3
m édio 5 4 7
alto 2 3
-T otal d e an im ais 10 10 10
Os anim ais do grupo controle possuíam as
P in h e iro M C N , B e ra ld o PSS, Ju n q u eira J ú n io r LF, L o p e s ER, C h a p a d eiro E. A n á lise q u a n tita tiv a d e m a stó c ito s e d e g ra n u ló c ito s e osin ó filo s n o m io c á rd io d e ra to s W istar cro n ica m en te in fecta d o s p e lo T rypanosoma cruzi. C o n tribu içã o a o c o n h e cim e n to d a f ib r o s e m io c á rd ic a. R ev ista d a S o cie d a d e B ra sile ira d e M e d ic in a T ro p ic a l 2 5 :4 5 -5 0 , ja n - m a r, 1 992.
peso dos infectados. Tanto os ratos controles como os infectados foram sacrificados na mesma época.
O coração de cada animal foi retirado durante a necropsia, e após análise m acroscópica, cortando em duas m etades; a seguir o m aterial foi fixado em form ol neutro a 10% e incluído em parafina. De
cada bloco foram obtidos quatro cortes de 5-7fxm de
espessura, próxim os entre si, que foram corados p e la h e m a to x ilin a -e o s in a (p a ra a n á lis e do com prom etim ento geral do m iocárdio), pelo Giemsa m odificado para tecido (visando a identificação e contagem de m astócitos e de eosinófilos) e pelos m étodos de A zan-H eidenhain e Sirius-red (para estudo da fibrose).
A contagem das células e a análise da fibrose foram realizadas em 10 campos m icroscópicos consecutivos de 200X na parede livre do terço m édio do ventrículo esquerdo de cada corte, correspondendo a um a área de 8mm2.
Os dados num éricos foram subm etidos à análise estatística através dos testes do qui-quadrado, M ann- W hitney e pela estatística de K ruskal-W allis7. Para fins de conclusão, em term os estatísticos, adotou-se o nível de significância de 0,05.
RESU LTA D O S
D os 30 anim ais infectados, 26 (86,66% ) apresentaram m iocardite crônica (Figuras 1 e 2) caracterizada por infiltrado de células mononucleares (m acrófagos e linfócitos) e fenômenos degenerativo- necróticos das fibrocélulas; fibrose ocorreu apenas em 12 dos 26 anim ais com m iocardite e foi identificada como áreas irregulares de neoform ação conjuntiva localizada no endo e perim ísio, coradas em azul pelo m étodo de A zan-H eidenhain e birrefringentes, alaranjadas, nas preparações coradas pelo Sirius-red, observadas à polarização. Três anim ais infectados com os diferentes inóculos da cepa 12SF e u m com baixo inóculo da cepa Y não desenvolveram m iocardite. Consideraram -se três tipos de fibroses: 1. focal, quando a área ou a soma das áreas coradas em azul alcançava até 25 % do cam po exam inado (Figura 3); 2. zonal, quando a som a dessas áreas com preendia 25 a 50 % (Figura 4) do campo m iocárdico; 3. difusa, quando as áreas coradas em azul ultrapassavam 50% dos campos exam inados (Figura 5).
Conform e indicado na Tabela 1, o núm ero m édio de m astócitos encontrado no m iocárdio dos grupos de anim ais infectados com diferentes cepas do T r y p a n o s o m a c r u z i, foi significativam ente maior (3 a 5 vezes) que no grupo controle (Figuras 6A e B). C om parando-se as médias nos três grupos infectados entre si, através da estatística de K ruskal- W allis (H = 3,682; gl = 2; p = 0,158638), não se pode rejeitar a hipótese de igualdade; contudo não se deve deixar de lado a m agnitude do poder estatístico desta decisão (erro B > 90 %), devido ao pequeno núm ero de observações.
T a b e la 1 - M é d i a e d e s v i o - p a d r ã o d o n ú m e r o d e
m a s t ó c i t o s n o m i o c á r d i o v e n tr ic u la r
e s q u e r d o d o s r a t o s , s e g u n d o a s c e p a s d e T. cruzi.
Grupos M édia D esvio-padrão
Controle 6,50 4,04
Y 21,00 11,57
12SF 18,90 7,91
COL 29,10 14,08
Estatística de Kruskal-Wallis = 21,196 p = 0,00096
E ntre os corações estudados, a fibrose ocorreu em 12 (40% ) dos ratos infectados e em 10% dos controles, com o indica a Tabela 2. N a Tabela 3,
T abela 2 - F ibrose no m io c á rd io v e n tric u la r e sq u e rd o d e
ra to s c o n tro le s e in fec ta d os p e lo T. cruzi.
Fibrose
Grupos Sim Não Total
N° % N° % N° %
Controle 1 10,0 9 90,0 10 100,0
Chagásico 12 40,0 18 60,0 30 100,0
Total 13 32,5 27 67,5 40 100,0
P i n h e i r o M C N , B e r a l d o P S S , J u n q u e ir a J ú n io r L F , L o p e s E R , C h a p a d e ir o E . A n á li s e q u a n ti ta t iv a d e m a s t ó c i t o s e d e g r a n u l ó c i t o s e o s i n ó f il o s n o m i o c á r d i o d e r a t o s W is ta r c r o n i c a m e n t e in f e c ta d o s p e l o T ryp an osom a cru zi. C o n tr i b u iç ã o a o c o n h e c im e n to d a f i b r o s e m i o c á r d i c a . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i le i r a d e M e d i c in a T r o p i c a l 2 5 : 4 5 - 5 0 , j a n - m a r , 1 9 9 2 .
F ig u r a 1 - R a to c h a g á s i c o . M i o c a r d i t e c r ô n i c a c o m n in h o d e a m a s ti g o ta s d o T . cru zi ( s e ta ) n o in t e r i o r d e m i o c é lu l a s . H E 4 0 0 x .
F ig u r a 2 - R a to c h a g á s i c o . M i o c a r d i t e c r ô n i c a f i b r o s a n t e c o m in te n s o in f iltr a d o m o n o n u c l e a r . H E 4 0 0 x . F ig u r a 3 - R a t o c h a g á s i c o . M i o c a r d i t e c r ô n i c a c o m f i b r ö s e f o c a l . T r ic r ô m i c o d e H e i d e n h a in lO O x . F ig u r a 4 - R a t o c h a g á s i c o . M i o c a r d i t e c r ô n i c a c o m f i b r ö s e z o n a l . T r ic r ô m i c o d e H e i d e n h a in lO O x . F ig u r a 5 - R a t o c h a g á s i c o . M i o c a r d i t e c r ô n i c a c o m á r e a d e f i b r ö s e d if u s a . T r ic ô m ic o d e H e i d e n h a in lO O x . F ig u r a s 6 A e 6 B - M a s t ó c i t o s ( s e ta s ) n o m i o c á r d i o d e r a t o s n ã o c h a g á s i c o (6 A ) e c h a g á s i c o c r ô n i c o (6 B ). O b s e r v a r
P in h e i r o M C N , B e r a l d o P S S , J u n q u e ir a J ú n i o r L F , L o p e s E R , C h a p a d e ir o E . A n á li s e q u a n t i t a t i v a d e m a s t ó c i t o s e d e g r a n u l ó c i t o s e o s i n ó f il o s n o m i o c á r d i o d e r a t o s W is ta r c r o n i c a m e n t e in f e c ta d o s p e l o T rypan osom a cru zi. C o n tr i b u iç ã o a o c o n h e c im e n to d a f i b r o s e m i o c á r d i c a . R e v is t a d a S o c i e d a d e B r a s i le i r a d e M e d i c in a T r o p i c a l 2 5 : 4 5 - 5 0 , j a n - m a r , 1 9 9 2 .
T a b e la 3 - D i s t r i b u i ç ã o d a f i b r o s e , e m d o z e r a t o s , d e a c o r d o c o m a c e p a e a i n t e n s i d a d e d o in o c u lo . C ep as
Inoculo Y 12-S F C O L N ú m ero
N ° % N ° % N ° % T otal
M éd io 4 6 6 ,6 6 1 5 0 ,0 0 4 1 0 0 ,0 0 9
A lto 2 3 3 ,3 3 1 5 0 ,0 0 - - 3
T otal 6 1 0 0 ,0 0 2 1 0 0 ,0 0 4 1 0 0 ,0 0 12
constata-se que os 12 anim ais que apresentaram fibrose receberam alto e m édio inoculo e que 6 deles haviam sido inoculados com a cepa Y, 2 com a 12SF e 4 com a C o l. E m nenhum rato infectado com baixo inoculo desenvolveu-se fibrose miocárdica.
A Tabela 4, m ostra que a m édia e o desvio- padrão do núm ero de m astócitos nos anim ais infectados que apresentaram fibrose foram próximos daqueles sem fibrose. D e acordo com o teste de M ann-W hitney = 0,004 p = 0,9427, não houve diferença significativa entre essas médias.
T a b e la 4 - M é d i a e d e s v i o p a d r ã o d o n ú m e ro d e m a s t ó c i t o s n o s a n im a is in f e c ta d o s c o m
e s e m f i b r o s e m io c á r d ic a .
Fibrose M édia Desvio-padrâo
Sim 22,33 11,21
N ão 22,88 12,55
E sta tística d e M ann-W hitney = 0 ,0 0 4 p = 0 ,9 4 2 7
A pesquisa dos eosinófilos revelou-se negativa no m iocárdio dos dez corações controles e positiva em sete dos trinta corações dos anim ais infectados. N estes últim os, o núm ero de células variou de 1 a 4 . Os dados não perm item análise estatística.
DISCUSSÃ O
N ossas observações sugerem que o aum ento do núm ero dos m astócitos no m iocárdio dos ratos chagásicos p o r nós estudados, está associado
fundamentalmente à infecção pelo T r y p a n o s o m a
c ru z i e não à m iocardite crônica fibrosante. A técnica histológica que em pregam os não identifica m astócitos degranulados, mas é válida p ara casos em que se constata aum ento do núm ero destas células.
Pelo fato de não term os observado relação entre a fibrose m iocárdica e o aum ento do núm ero de m astócitos poder-se-ia questionar se o aum ento do núm ero destas células é realm ente um dos fatores responsáveis pelo caráter fibrosante da lesão m iocárdica e pela fibrose das m usculares do esôfago e/ou intestino no hom em , com o alguns sugerem 2 21 25. Deve-se, entretanto, realçar a diversidade das condições hum anas e experim entais e a existência de outras Variáveis (como p o r exem plo tipos de cepas, intensidade do inoculo, etc.) entre os diversos trabalhos citados.
D os anim ais infectados, 40% desenvolveram fibrose m iocárdica e é im portante realçar que esta só foi constatada nos anim ais infectados com m édio e alto inóculos, não ocorrendo em nenhum dos nove que receberam baixo inoculo, independentem ente da cepa inoculada. P or outro lado, 60 % dos anim ais infectados com a cepa Y desenvolveram fibrose, a qual ocorreu em som ente 40 % dos ratos infectados com a cepa Col e em 20 % daqueles inoculados com a cepa 12SF. D iante do pequeno núm ero de casos, não foi possível análise estatística. E ntretanto, os dados dispostos na Tabela 3 sugerem que a m aioria dos casos com fibrose está relacionada ao inoculo médio e à cepa Y. Não temos elem entos para explicar a fibrose m iocárdica observada em um dos animais controle.
P in h e i r o M C N , B e r a l d o P S S , J u n q u e ir a J ú n io r L F , L o p e s E R , C h a p a d e ir o E . A n á li s e q u a n ti ta t iv a d e m a s t ó c i t o s e d e g r a n u l ó c i t o s e o s i n ó f il o s n o m i o c á r d i o d e r a t o s W is ta r c r o n i c a m e n t e in f e c ta d o s p e l o T ryp an osom a cru zi. C o n tr i b u iç ã o a o c o n h e c im e n to d a f i b r o s e m i o c á r d i c a . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 : 4 5 - 5 0 , j a n - m a r , 1 9 9 2 .
tripanossom íase cruzi foi relatado em modelos experim entais em outras sedes que não o m iocárdio. M enezes e A lcântara12 descreveram nas áreas de reinoculação, na pele de cam undongos, m aior quantidade de mastócitos e admitem ser a inflamação produzida pelo inóculo a responsável pelo fenômeno. T rabalhando com cam undongos, cronicam ente infectados com a cepa “ A B C ” do T r y p a n o s o m a
c r u z i, T afurieB rener23 também constataram intenso
aum ento do núm ero de m astócitos, especialmente na m u scu lar do in te stin o . T afu ri e R aso25, confirm aram ocorrer m astocitose na doença de Chagas experim ental e lançaram a hipótese de que estaria relacionada com a gênese da fibrilopoiese. Entretanto, na fase aguda da infecção de ratos W istar, inoculados com as m esm as cepas do T r y p a n o s o m a c r u z i por nós utilizadas no presente estudo, C hapadeiro e cols5 se referem à falta ou escassez de m astócitos, em contraste com sua abundância nos anim ais controles.
C om relação aos granulócitos eosinófilos no m iocárdio não nos foi possível tirar conclusões, tendo em vista o núm ero pouco expressivo daquelas células nos ratos chagásicos e de não terem sido detectadas nos controles.
E m c o n c lu s ã o , são n e c e s s á ria s n o v a s investigações para procurar esclarecer o papel dos m astócitos e dos eosinófilos na gênese da fibrose m iocárdica da doença de Chagas, entre outras
razões, pelo fato de que nas inflam ações em geral, tem -se atribuído aos m astócitos3 6 18 20 e ao g ra n u ló c ito s e o s in ó f ilo s 19 p a r tic ip a ç ã o n a colanogênese do fenômeno produtivo reparativo.
SUM M ARY
W e d i d m a s t c e l l a n d e o s i n o p h i l g r a n u l o c y t e c o u n ts in th e m y o c a r d iu m o f f o r t y c h r o n i c c h a g a s i c W is ta r a lb i n o r a ts . W e u s e d 1 0 c o n t r o l s r a t s a n d 3 0 a n im a ls w it h la t e s t a g e ( 8 ^ m o n th ) in f e c tio n o f S ã o F e li p e , Y a n d C o lo m b ia n T ryp an osom a cru zi s t r a i n s , w ith v a r i a b l e d e g r e e o f c h r o n ic m y o c a r d it is . W e f o u n d c h r o n i c f i b r o s i n g m y o c a r d i t i s ( f ib r o s is ) in 4 0 % o f th e i n f e c te d a n im a ls . It w a s d e t e c t e d i n c r e a s e d m a s t c e l l c o u n t in th e c h a g a s i c r a t s a s s o c i a t e d w ith in f e c tio n a n d n o t r e l a t e d w it h m y o c a r d i a l f i b r o s i s . T h e r e w a s n o in c r e a s e in th e e o s i n o p h il c o u n ts .
K e y - w o r d s : C h a g a s ’d i s e a s e . M y o c a r d i a l f i b r o s i s . M a s t c e ll. E o s in o p h i l g r a n u l o c y te .
A G RA D ECIM EN TO S
Ao Prof. Euclides Ayres de Castilho e Raimundo Cam urça de M enezes pela orientação e execução da análise estatística.
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