Immunoglobulin genes and T-cell receptors as molecular markers in children with acute lymphoblastic leukaemia

Гени за имуноглобулин и Т-ћелијски рецептор као

молекуларни маркери код деце с акутном

лимфобластном леукемијом

Jelena Lazić1_{, Lidija Dokmanović}1_{, Nada Krstovski}1_{, Jelica Predojević}2_{, Nataša Tošić}3_, Sowa Pavlović3_{, Dragana Janić}1

1_{Služba za hematologiju i onkologiju, Univerzitetska dečja klinika, Beograd, Srbija;} 2_{Dečja klinika, Kliničko­bolnički centar, Bawa Luka, Bosna i Hercegovina;} 3_{Institut za molekularnu genetiku i genetičko inžewerstvo, Beograd, Srbija}

UVOD

Akut­na­lim­fo­blast­na­le­u­ke­mi­ja­(ALL)­je­jed­no­ od­naj­če­šćih­ma­lig­ni­te­ta­deč­jeg­uz­ra­sta.­Na­sta­je­ klon­skom­pro­li­fe­ra­ci­jom­lim­fo­bla­sta,­ne­zre­ lih­pre­kur­sor­skih­će­li­ja­lim­fo­id­ne­lo­ze­ko­ji­su­ pret­hod­no­pod­le­gli­ma­lig­noj­tran­sfor­ma­ci­ji­[1].­ Za­hva­qu­ju­ći­sa­vre­me­nim­pro­to­ko­lima,­in­tra­te­ kal­noj­primeni­lekova­i­zračewu­cen­tral­nog­ner­ vnog­si­ste­ma­(CNS),­da­nas­se­kod­oko­80%­de­ce­s­ ALL­po­sti­že­du­go­traj­na­kli­nič­ka­re­mi­si­ja,­ko­ ja­je­de­fi­ni­sa­na­pri­su­stvom­ma­we­od­5%­bla­sta­u­ kost­noj­sr­ži.­Me­đu­tim,­s­ob­zi­rom­na­to­da­se­kod­ 10­15%­de­ce­raz­vi­je­re­ci­div­bo­le­sti,­sma­tra­se­ da­kon­ven­ci­o­nal­na­mor­fo­lo­ška­re­mi­si­ja­mo­že­ bi­ti­udru­že­na­s­re­zi­du­al­nim­bla­sti­ma,­ko­ji­su­ naj­če­šći­uzrok­ponovne­­ak­ti­va­ci­je­bo­le­sti­[2].

Ot­kri­va­we­i­pra­će­we­re­zi­du­al­nih­ma­lig­nih­ će­li­ja­se­na­zi­va­mi­ni­mal­na­re­zi­du­al­na­bo­lest­ (MRB)­i­pred­sta­vqa­naj­ni­ži­mer­qi­vi­ni­vo­bo­ le­sti­[2].­Kao­ne­za­vi­sni­prog­no­stič­ki­fak­tor,­ MRB­omo­gu­ća­va­stra­ti­fi­ka­ci­ju­no­vih­gru­pa­ri­ zi­ka­i­pru­ža­osno­vu­za­pot­pu­no­in­di­vi­du­al­ni­ te­ra­pij­ski­pri­stup­[3].­Oda­bir­bo­le­sni­ka­pre­ ma­ge­net­skom­pro­fi­lu­bo­le­sti­omo­gu­ća­va­po­de­lu­ na­gru­pu­ko­ja­zah­te­va­in­ten­zi­fi­ka­ci­ju­te­ra­pi­je­i­ na­gru­pu­gde­se­pri­me­wu­ju­stan­dard­ni­pro­to­ko­li­ le­če­wa­sa­sma­we­nim­do­za­ma,­či­me­se­ne­ugro­ža­va­ is­hod­le­če­wa,­a­iz­be­ga­va­se­iz­la­ga­we­mno­gim­tok­ sič­nim­dej­stvi­ma­ci­to­sta­ti­ka­[4].

To­kom­po­sled­we­dve­de­ce­ni­je­za­be­le­že­ni­su­po­ ku­ša­ji­da­se­raz­li­či­tim­me­to­da­ma­ot­kri­je­i­pra­ ti­MRB.­Me­to­da­iz­bo­ra­za­MRB­tre­ba­da­za­do­vo­qi­ ne­ko­li­ko­va­žnih­kri­te­ri­ju­ma:­sen­zi­tiv­nost­od­ naj­ma­we­10­3_{,­spo­sob­nost­raz­li­ko­va­wa­ma­lig­nih­}

od­nor­mal­nih­će­li­ja,­po­sto­ja­we­sta­bil­nih­le­u­ke­ mi­ja­–­spe­ci­fič­nih­mar­ke­ra,­la­ku­stan­dar­di­za­ci­ ju,­br­zo­do­bi­ja­we­re­zul­ta­ta­i­mo­guć­nost­kvan­ti­ fi­ka­ci­je­[5].­Jed­na­od­me­to­da­je­lan­ča­na­re­ak­ci­ja­ umno­ža­va­wa­DNK­(engl.­polyme ra se chain re ac tion – PCR).­PCR­esej­je­spo­so­ban­da­ot­kri­je­jed­nu­le­u­

ke­mij­ski­iz­me­we­nu­će­li­ju­me­đu­mi­lion­nor­mal­ nih­će­li­ja­[6].­Za­pra­će­we­MRB­ko­ri­ste­se­me­to­ de­kva­li­ta­tiv­na­RT-PCR­(engl.­re ver se tran scrip ta se PCR)­i­kvan­ti­ta­tiv­na­RQ-PCR­(engl.­real-ti me qu-an ti ta ti ve PCR),­za­sno­va­ne­na­ot­kri­va­wu­fu­zi­o­nih­

tran­skri­pa­ta­i­an­ti­gen­re­cep­tor­ge­na.

MRB­u­ALL­pod­ra­zu­me­va­ot­kri­va­we­i­pra­će­we­ struk­tur­nih­fu­zi­o­nih­abe­ra­ci­ja­i­re­a­ran­žma­na­ gen­skih­lo­ku­sa­imu­no­glo­bu­li­na­(IgH)­i­T­će­lij­

skog­re­cep­to­ra­(TCR).­Na­svo­joj­po­vr­ši­ni­B­lim­

fo­ci­ti­eks­pri­mi­ra­ju­imu­no­glo­bu­lin,­a­T­lim­fo­

ci ti TCR,­ko­ji­pre­po­zna­ju­an­ti­ge­ne.­Sva­ki­klon­

B­ili­T­lim­fo­ci­ta­no­si­re­cep­tor­je­din­stve­ne­ spe­ci­fič­no­sti­od­re­đe­ne­kom­bi­na­ci­jom­V­(engl.­ va ri a ble­–­pro­men­qiv),­D­(engl.­di ver sity­–­ra­zno­

vr­stan)­i­J­(engl.­jo i ning­–­spa­ja­ju­ći)­gen­skih­seg­

me­na­ta,­de­lo­vi­ma­lo­ku­sa,­ka­ko­za­imu­no­glo­bu­lin,­ ta­ko­i­za­TCR­za­an­ti­gen.­Ve­li­ki­re­per­to­ar­raz­

li­či­tih­spe­ci­fič­nih­me­sta­za­an­ti­gen­po­sti­že­

KRATAK SADRŽAJ

Uvod Akut na lim fo blast na le u ke mi ja (ALL) je ma lig na klo nal na bo lest i jed na od naj če šćih neo pla zmi deč jeg uz ra­ sta. Pri me nom sa vre me nih pro to ko la po sti žu se vi sok ste pen re mi si je i du go go di šwa sto pa pre ži vqa va wa. Uvo­ đe wem me to da mo le ku lar ne ge ne ti ke omo gu će ni su sub mi kro skop ska kla si fi ka ci ja i pra će we mi ni mal ne re zi du­ al ne bo le sti (MRB), od go vor ne za na sta nak re ci di va.

Ciq ra da Ciq ra da je bi lo is pi ti va we uče sta lo sti re a ran žma na gen skih lo ku sa za te ške lan ce imu no glo bu li na (IgH) i T­će lij ski re cep tor (TCR) i wi ho va ko re la ci ja s kli nič kim pa ra me tri ma.

Me to de ra da Is pi ta no je 41 de te obo le lo od ALL ko ji ma je na di jag no zi ra đe na mo le ku lar na de tek ci ja re a ran žma­ na gen skih lo ku sa za IgH i TCR me to dom lan ča nog umno ža va wa DNK (PCR). Po sma tra we raz vo ja MRB je ra đe no u in duk­ ci o noj fa zi le če wa, ka da se oče ku je mor fo lo ški od go vor na te ra pi ju.

Re zul ta ti Re a ran žman gen skog lo ku sa za IgH za be le žen je kod 82,9%, a za TCR kod 56,1% is pi ta ni ka. Po sle 33 da na in­ duk ci o ne te ra pi je re a ran žma ni za IgH gen ski lo kus su zabeleženi kod 39%, a za TCR kod 36,5% de ce.

Za kqu čak Ot kri va we ge net skih abe ra ci ja na mo le ku lar nom ni vou i wi ho va ko re la ci ja sa stan dard nim prog no­ stič kim pa ra me tri ma uka za la je na zna čaj no ve stra ti fi ka ci je ri zič nih gru pa, ko je zah te va ju pro me nu in ten zi te ta he mi o te ra pi je. Pra će we MRB se po ka za lo pre ci znim pre dik tiv nim fak to rom u na stan ku re ci di va bo le sti.

se­to­kom­sa­zre­va­wa­lim­fo­ci­ta­kom­bi­na­ci­jom­po­jed­ nog­ge­na­iz­V, D i J­re­gi­o­na.­Va­ri­ja­bil­nost­se­do­dat­

no­uve­ća­va­de­le­ci­jom­i­in­ser­ci­jom­nu­kle­o­ti­da­na­me­ stu­spa­ja­wa,­či­me­na­sta­je­se­kven­ca­je­din­stve­na­za­sva­ ki­B­i­T­lim­fo­cit­ni­klon­[7].

To­kom­sa­zre­va­wa­B­i­T­lim­fo­ci­ta­od­i­gra­va­se­pro­ ces­so­mat­skih­re­kom­bi­na­ci­ja,­pri­če­mu­se­se­kven­ce­od­ re­đe­nog­ti­pa­kom­bi­nu­ju­i­stva­ra­ju­gen­sa­ko­jeg­se­pre­ pi­su­je­in­for­ma­ci­ja­za­sin­te­zu­od­go­va­ra­ju­ćeg­lan­ca­ [8].­Na­ovaj­na­čin­ge­ne­ri­še­se­ogro­man­di­ver­zi­tet­an­ ti­gen­skih­re­cep­to­ra,­ko­ji­se­ogle­da­u­po­sto­ja­wu­vi­še­ od­bi­lion­(1012_{)­raz­li­či­tih­klo­no­va­B­i­T­lim­fo­ci­}

ta,­sva­ki­s­re­cep­to­rom­raz­li­či­te­spe­ci­fič­no­sti­[9]. Klon­spe­ci­fič­ni­IgH i TCR­re­a­ran­žma­ni­su­mar­

ke­ri­spe­ci­fič­ni­za­tu­mor­i­bo­le­sni­ka,­ko­ji­se­mo­gu­ pre­po­zna­ti­na­di­jag­no­zi­vi­še­od­95%­pa­ci­je­na­ta­s­ lim­fo­pro­li­fe­ra­tiv­nim­bo­le­sti­ma.­Raz­li­či­ti­klo­ nal­ni­imu­no­glo­bu­lin­ski­i­TCR­re­a­ran­žma­ni­mo­ra­ju­

bi­ti­tač­no­de­fi­ni­sa­ni,­da­bi­se­raz­li­ko­va­li­od­slič­ nih­po­li­klo­nal­nih,­ko­ji­se­isto­vre­me­no­s­wi­ma­am­ pli­fi­ku­ju.­Re­a­ran­žma­ni­ima­ju­po­se­ban­zna­čaj­kao­me­ te­spe­ci­fič­ne­za­bo­le­sni­ka­za­ot­kri­va­we­i­pra­će­we­ re­zi­du­al­ne­bo­le­sti­de­ce­bez­hro­mo­zom­skih­abe­ra­ci­ ja.­Kod­zdra­vih­oso­ba­lim­fo­cit­ni­re­per­to­ar­je­sta­bi­ lan­i­po­li­klo­na­lan.­Re­kom­bi­na­ci­je­se­u­lim­fo­id­nim­ pro­ge­ni­to­ri­ma­od­i­gra­va­ju­po­od­re­đe­nom­hi­je­rar­hij­ skom­re­do­sle­du,­zbog­če­ga­se­u­vi­še­od­95%­B­pre­kur­ sor­skih­ALL­mo­že­ot­kri­ti­IgH­re­a­ran­žman.

Pot­pu­no­re­a­ran­ži­ra­ni­IgH­lo­ku­si­ni­su­od­li­ka­is­

kqu­či­vo­B­le­u­ke­mi­ja,­kao­što­se­ni­TCRγ­re­a­ran­žma­

ni­ne­ot­kri­va­ju­is­kqu­či­vo­kod­T­ma­lig­ni­te­ta.­Zna­tan­ pro­ce­nat­B­i­T­le­u­ke­mi­ja­se­od­li­ku­je­isto­vre­me­nom­ eks­pre­si­jom­oba­re­a­ran­ži­ra­na­lo­ku­sa­[10].

Ana­li­zom­IgH­re­per­to­a­ra­na­di­jag­no­zi­se­u­30­40%­

B­pre­kur­sor­skih­ALL­mo­že­ot­kri­ti­vi­še­od­jed­ne­klo­ nal­ne­po­pu­la­ci­je­le­u­ke­mij­skih­će­li­ja.­Oli­go­klo­nal­ nost­se­ta­ko­đe­mo­že­ot­kri­ti­s­fre­kven­ci­jom­od­oko­ 10%­za­imu­no­glo­bu­lin­i­pri­bli­žno­20%­za­TCR­gen­

ske­lo­ku­se.­Ka­da­su­u­pi­ta­wu­T­ALL,­oli­go­klo­nal­nost­

TCR­lo­ku­sa­se­ja­vqa­kod­ma­we­od­5%,­dok­je­IgH­uzo­rak­

oli­go­klo­na­lan­kod­27%­bo­le­sni­ka­[11].

Klo­nal­na­evo­lu­ci­ja­je­mo­di­fi­ka­ci­ja­po­sto­je­ćih­re­ a­ran­žma­na­ko­jom­le­u­ke­mij­ski­klon­da­je­vi­še­po­pu­la­ ci­ja­sub­klo­no­va.­Po­re­đe­we­she­me­imu­no­glo­bu­li­na­i­

TCR­re­a­ran­žma­na­na­di­jag­no­zi­i­u­re­ci­di­vu­bo­le­sti­

uka­zu­ju­na­pro­me­nu,­za­vi­sno­od­ti­pa­le­u­ke­mi­je,­ste­pe­ na­sa­zre­va­wa­i­vr­ste­sa­mog­re­a­ran­žma­na.­Zbog­mo­gu­će­ po­ja­ve­la­žno­ne­ga­tiv­nih­re­zul­ta­ta,­sta­bil­nost­ovih­ re­a­ran­žma­na­se­mo­ra­uze­ti­u­ob­zir­ka­da­se­oni­ko­ri­ ste­kao­mar­ke­ri­za­po­sma­tra­we­na­pre­do­va­wa­bo­le­sti.­ Ka­ko­bar­je­dan­re­a­ran­ži­ran­IgH, TCRγ, od no sno TCRδ

alel­osta­je­sta­bi­lan­u­75­90%­B­ALL,­od­no­sno­90%­ T­ALL,­pre­po­ru­ču­je­se­po­sma­tra­we­bar­dva­mar­ke­ra,­ ko­li­ko­je­i­do­stup­no­kod­ve­ći­ne­bo­le­sni­ka­s­ALL­[12].

Re­zul­ta­ti­mno­gih­stu­di­ja­su­po­ka­za­li­da­se­she­ma­ imu­no­glo­bu­lin­skih­i­TCR­re­a­ran­žma­na­me­wa­s­na­

pret­kom­bo­le­sti.­S­ob­zi­rom­na­to­da­je­kon­fi­gu­ra­ci­ ja­gen­skih­lo­ku­sa­spe­ci­fi­čan­mar­ker­le­u­ke­mij­ske­će­ li­je,­po­mo­ću­ko­jeg­se­ona­mo­že­po­sma­tra­ti,­pro­me­na­te­ kon­fi­gu­ra­ci­je­u­vre­me­nu­mo­že­da­uka­že­i­na­pro­me­nu­

sa­me­ma­lig­ne­će­li­je­i­we­nih­bi­o­lo­ških­od­li­ka.­Od­ vi­ja­we­re­kom­bi­na­ci­ja­na­do­stup­nim­imu­no­glo­bu­lin­ skim­i­TCR­lo­ku­si­ma­uka­zu­je­na­to­da­je­re­kom­bi­na­

tor­ni­si­stem­ak­ti­van,­a­me­ha­ni­zmi­za­tva­ra­wa­hro­ma­ ti­na­ne­funk­ci­o­ni­šu­kao­kod­nor­mal­nih­će­li­ja.­Sto­ ga­je­mo­gu­će­pret­po­sta­vi­ti­da­i­ne­ki­dru­gi­de­lo­vi­ge­ no­ma­mo­gu­bi­ti­otvo­re­ni­za­pri­stup­re­kom­bi­na­ci­ji,­ usled­če­ga­mo­že­do­ći­do­na­go­mi­la­va­wa­mu­ta­ci­ja.­Ne­ ke­od­wih­mo­gu­bi­ti­uzrok­pro­me­ne­fe­no­ti­pa­le­u­ke­ mij­skog­klo­na,­što­na­vo­di­na­za­kqu­čak­da­je­klo­nal­na­ evo­lu­ci­ja,­pra­će­na­kroz­re­a­ran­žma­ne­imu­no­glo­bu­li­

na i TCR,­mo­del­na­pret­ka­bo­le­sti­[13].

CIQ RADA

Ciq­ra­da­je­bio­da­se­utvr­de­fre­kven­ci­ja­i­klo­nal­ nost­re­a­ran­žma­na­u­ge­ni­ma­za­IgH i TCR­u­tre­nut­

ku­po­sta­vqa­wa­di­jag­no­ze­i­wi­ho­va­ko­re­la­ci­ja­s­kli­ nič­kim­i­stan­dard­nim­prog­no­stič­kim­pa­ra­me­tri­ ma­bo­le­sti­kod­de­ce­obo­le­le­od­ALL.­Po­sma­tra­ni­su­ i­raz­voj­MRB­33.­da­na­in­duk­ci­o­nog­le­če­wa­i­ko­re­la­ ci­ja­ge­ne­tič­kih­mar­ke­ra­s­po­ja­vom­re­ci­di­va­i­smrt­ nim­is­ho­dom.

METODE RADA

Is­tra­ži­va­we­je­ob­u­hva­ti­lo­41­de­te­obo­le­lo­od­ALL­ (22­de­ča­ka­i­19­de­voj­či­ca),­uz­ra­sta­od­1,9­do­16,5­go­di­na­ (me­di­ja­na­šest­go­di­na),­kod­ko­jih­je­di­jag­no­za­obo­qe­ wa­po­sta­vqe­na­iz­me­đu­1.­de­cem­bra­2002.­i­1.­ju­la­2005.­ go­di­ne,­a­nad­gle­da­na­su­do­1.­av­gu­sta­2007.­go­di­ne.­Na­ Uni­ver­zi­tet­skoj­deč­joj­kli­ni­ci­(UDK)­u­Be­o­gra­du­su­ di­jag­no­sti­ko­va­na­i­le­če­na­32­bo­le­sni­ka,­dok­je­kod­de­ ve­to­ro­de­ce­di­jag­no­za­po­sta­vqe­na­na­UDK,­ali­su­ona­ le­če­na­na­Deč­joj­kli­ni­ci­Kli­nič­ko­bol­nič­kog­cen­ tra­u­Ba­wa­Lu­ci.­Is­pi­ta­ni­ci­su­u­pro­se­ku­nad­gle­da­ ni­dve­go­di­ne­i­tri­me­se­ca­(ras­pon­0,7­53,7­me­se­ci).

Di­jag­no­za­je­po­sta­vqe­na­na­osno­vu­stan­dard­nih­ ci­to­mor­fo­lo­ških,­ci­to­he­mij­skih­i­imu­no­fe­no­tip­ skih­kri­te­ri­ju­ma.

Le­če­we­je­iz­ve­de­no­pre­ma­ak­tu­el­nom­pro­to­ko­lu­ALL IC-BFM 2002,­ko­ji­se­sa­sto­ji­od­uobi­ča­je­nih­fa­za­le­

če­wa:­in­duk­ci­je,­kon­so­li­da­ci­je,­re­in­duk­ci­je­(de­ter­ mi­ni­sa­na­ran­do­mi­za­ci­jom)­i­fa­ze­odr­ža­va­wa.­Pro­ to­kol­na­la­že­stra­ti­fi­ka­ci­ju­ri­zi­ka­u­od­no­su­na­uz­ rast,­ini­ci­jal­ni­broj­le­u­ko­ci­ta,­po­zi­ti­van­ci­to­ge­ net­ski­na­laz­t(9;22) i t(4;11),­pri­su­stvo­fu­zi­o­nih­ge­

na BCR/ABL i MLL/AF4,­od­go­vor­na­pro­ni­zon­osmog­

da­na,­od­no­sno­pro­ce­nat­bla­sta­u­kost­noj­sr­ži­15.­i­ 33.­da­na­le­če­wa.

Ma­te­ri­jal­za­PCR­ana­li­zu­re­a­ran­žma­na­gen­skih­

lo­ku­sa­(IgH i TCR)­uzet­je­stan­dard­nom­aspi­ra­ci­jom­

kost­ne­sr­ži­u­tre­nut­ku­po­sta­vqa­wa­di­jag­no­ze­i­33.­da­ na­le­če­wa,­ka­da­pro­to­kol­pred­vi­đa­ula­zak­bo­le­sni­ka­ u­mor­fo­lo­šku­re­mi­si­ju.

ne­sr­ži­stan­dard­nom­fe­nol­hlo­ro­form­izo­a­mi­lal­ ko­hol­nom­me­to­dom.

Ot­kri­va­we­IgH­gen­skih­re­a­ran­žma­na­vr­še­no­je­me­

to­domPCR.­Praj­me­ri­su­kom­ple­men­tar­ni­se­kven­ca­ma­

ko­je­ogra­ni­ča­va­ju­tri­hi­per­va­ri­ja­bil­na­re­gi­o­na­(CDR)­

eg­zo­na,­ko­ji­ko­di­ra­va­ri­ja­bil­ni­do­men­te­škog­lan­ca,­i­ de­le­vi­sok­ste­pen­ho­mo­lo­gi­je­iz­me­đu­raz­li­či­tih­V,­od­

no sno J­seg­me­na­ta.­Na­ovaj­na­čin­omo­gu­će­no­je­umno­ža­

va­we­kom­plet­nog­IgH­re­per­to­a­ra.­Nor­ma­lan­po­li­klo­

na­lan­uzo­rak­zdra­vih­in­di­vi­dua­ot­kri­va­se­kao­„smir”­ na­du­ži­ni­iz­me­đu­100­i­200­bp­i­pred­sta­vqa­ve­li­ki­

broj­tra­ka­raz­li­či­te­du­ži­ne­ko­je­po­ti­ču­od­raz­li­či­ tih­lim­fo­ci­ta.­Po­ja­va­jed­ne­do­mi­nant­ne­tra­ke­ili­ vi­še­wih­uka­zu­je­na­po­sto­ja­we­klo­nal­nih­po­pu­la­ci­ ja­će­li­ja­s­iden­tič­nim­re­a­ran­žma­nom,­tj.­VDJH­kom­

bi­na­ci­jom­gen­skih­seg­me­na­ta­(Sli­ka­1).­Ko­ri­šće­na­su­ dva­pa­ra­praj­me­ra,­jer­se­PCR­am­pli­fi­ka­ci­ja­ra­di­u­

dva­ko­ra­ka­(engl.­ne sted PCR):­FR1 (5’-(G/C)AGGT(A/G) CAGCTG(G/C/T)(AT)G(GC)AGTC(G/A/T/C)G-3’) i J1H (5’-AC CTGAG GA GACGGTGAC CAGGGT-3’)­–­pr­vi­par­

praj­me­ra;­FR1 (5’-(G/C)AGGT(A/G)CAGCTG(G/C/T)(AT)

G(GC)AGTC(G/A/T/C)G-3’) i FR3A (5’-ACACGGC(C/T) (C/G)TGTAT TACTGT-3’)­–­dru­gi­par­praj­me­ra­[11].

Uslo­vi­am­pli­fi­ka­ci­je­su:­de­na­tu­ra­ci­ja­na­94°C­(10­

mi­nu­ta),­po­sle­ko­je­sle­di­35­ci­klu­sa­de­na­tu­ra­ci­je­ta­ ko­đe­na­94°C­(15­se­kun­di),­ani­lin­ga­na­55°C­(20­se­kun­

di)­i­elon­ga­ci­je­na­72°C­(30­se­kun­di).­Re­ak­ci­ja­se­za­

vr­ša­va­fi­nal­nom­elon­ga­ci­jom­na­72°C­(pet­mi­nu­ta).­

Ot­kri­va­we­pro­iz­vo­da­PCR­vr­še­no­je­elek­tro­fo­re­zom­

DNK­na­po­li­a­kri­la­mid­nom­ge­lu.

Ot­kri­va­we­TCRγ­gen­skih­re­a­ran­žma­na­vr­še­no­je­

me­to­dom­PCR,­praj­me­ri­ma­ko­ji­omo­gu­ća­va­ju­umno­ža­

va­we­naj­ve­ćeg­de­la­TCRγ­re­per­to­a­ra.­Nor­ma­lan­po­li­

klo­na­lan­uzo­rak­zdra­vih­in­di­vi­dua­ot­kri­va­se­kao­ „smir”­na­du­ži­ni­iz­me­đu­400­i­500­bp. Po ja va jed ne

do­mi­nant­ne­tra­ke­ili­vi­še­wih­uka­zu­je­na­po­sto­ja­we­ klo­nal­nih­po­pu­la­ci­ja­će­li­ja­s­iden­tič­nim­re­a­ran­žma­ nom,­tj.­VDJγ­kom­bi­na­ci­jom­gen­skih­seg­me­na­ta­(Sli­

ka­2).­Is­pi­ta­ni­ci­sa­do­mi­nant­nom­tra­kom­ozna­če­ni­ su­kao­po­zi­tiv­ni,­i­to:­s­jed­nom­kao­mo­no­klo­nal­ni,­sa­ dve­bi­klo­nal­ni,­sa­tri­tri­klo­nal­ni,­a­sa­vi­še­od­tri­ kao­oli­go­klo­nal­ni.­Ko­ri­šće­na­su­dva­pa­ra­praj­me­ra:­

TCRγ1­(5’-CTGTGA CA A CA AGTGTTGTTCCAC-3’) i

TCRγ2 (5’-GTGCTTCTAGCTTTCCTGTCTC-3’)­–­pr­vi­

par­praj­me­ra;­TCRγ3 (5’-GAG TACGCTGCCTA CA GA-GAGG-3’) i TCRγ4 (5’-CCACTGCCA A A GAGTTTCTT-3’)

–­dru­gi­par­praj­me­ra­[14].

Uslo­vi­am­pli­fi­ka­ci­je­bi­li­su:­de­na­tu­ra­ci­ja­na­ 94°C­(10­mi­nu­ta),­po­sle­ko­je­sle­di­35­ci­klu­sa­de­na­tu­

ra­ci­je­na­ta­ko­đe­94°C­(45­se­kun­di),­ani­lin­ga­na­65°C

(30­se­kun­di)­i­elon­ga­ci­je­na­72°C­(60­se­kun­di).­Re­ak­

ci­ja­se­za­vr­ša­va­fi­nal­nom­elon­ga­ci­jom­na­72°C­(pet­

mi­nu­ta).­Ot­kri­va­we­pro­iz­vo­da­PCR­vr­še­no­je­elek­

tro­fo­re­zom­DNK­na­po­li­a­kri­la­mid­nom­ge­lu.

REZULTATI

Kod­70­de­ce­je­ra­đe­no­ini­ci­jal­no­ot­kri­va­we­mo­le­ku­ lar­nih­re­a­ran­žma­na­za­IgH i TCR­me­to­domPCR,­a­raz­

voj­MRB­je­po­sma­tran­ra­di­be­le­že­wa­od­go­vo­ra­na­pri­ me­we­no­le­če­we­i­ko­re­la­ci­je­s­kli­nič­kim­prog­no­stič­ kim­fak­to­ri­ma.­Kod­is­pi­ta­nih­bo­le­sni­ka­broj­le­u­ko­ ci­ta­(Le)­u­krv­noj­sli­ci­na­di­jag­no­zi­je­bio­u­pro­se­

ku­15400/mm3­(op­seg­1300­406400/_mm3).­CNS­sta­tus­1­

(iz­o­sta­nak­bla­sta­u­li­kvo­ru­i­kli­nič­kih­zna­ko­va­bo­ le­sti­CNS)­usta­no­vqen­je­kod­37­de­ce­(90,3%),­CNS­ sta­tus­2­(ne­tra­u­mat­ska­lum­bal­na­punk­ci­ja­sa­ma­we­od­ pet­će­li­ja­po­mi­kro­li­tru­u­ce­re­bro­spi­nal­noj­teč­no­ sti)­utvr­đen­je­kod­dva­de­te­ta­(4,9%),­dok­je­CNS­sta­ Сли ка 2. Ана ли за TCRγ-PCR про из во да на осмо по стот ном по ли-а кри лли-а мид ном ге лу

Figure 2. TCRγ-PCR analyzed products on 8% polyacrilamid gel 1 – здрав испитаник; 2 – пацијент са моноклоналним TCRγ; 3 – контрола PCR реакције; 4 – ДНК маркер (лествица од по 100 bp) 1 – healthy individual; 2 – patient with monoclonal TCRγ rearrangement; 3 – PCR reaction control; 4 – DNA marker (100 bp scale)

Сли ка 1. Ана ли за IgH-PCR про из во да на осмо про цент ном по ли-а кри лли-а мид ном ге лу

Figure 1. IgH-PCR analyzed products on 8% polyacrilamid gel 1 – здрав испитаник; 2 – ДНК маркер (лествица од по 100 bp); 3 – пацијент са моноклоналним IgH; 4 – пацијент са биклоналним IgH 1 – healthy individual; 2 – DNA marker (100 bp scale);

3 – patient with monoclonal IgH rearrangement; 4 – patient with biclonal IgH rearrangement

Re­a­ran­žma­ni­oba­gen­ska­lo­ku­sa­isto­vre­me­no­utvr­ đe­na­su­kod­19­is­pi­ta­ni­ka­(43,9%).­U­gru­pi­bo­le­sni­ka­

sa IgH­re­a­ran­žma­nom­11­de­ce­(26,8%)­je­stra­ti­fi­ko­va­

no­u­stan­dard­ni­ri­zik,­18­(43,9%)­u­in­ter­me­di­jar­ni,­a­ pe­to­ro­(12,2%)­u­vi­so­ki­ri­zik.­Me­đu­is­pi­ta­ni­ci­ma­sa­

TCRγ­re­a­ran­žma­nom­u­gru­pi­in­ter­me­di­jar­noj­ri­zi­

ka­bi­lo­je­14­de­ce­(65,2%),­dok­su­u­gru­pi­stan­dard­nog­ i­vi­so­kog­ri­zi­ka­bi­la­po­če­ti­ri­is­pi­ta­ni­ka­(17,4%).­ Po­zi­tiv­nost­na­BCR/ABL­ot­kri­ve­na­je­kod­če­ti­ri­is­

pi­ta­ni­ka­(11,8%)­s­re­a­ran­žma­ni­ma­IgH­gen­skog­lo­ku­

sa­i­pet­is­pi­ta­ni­ka­(21,7%)­sa­TCRγ­re­a­ran­žma­ni­ma.

Na­kon­Ia­fa­ze­in­duk­ci­o­nog­le­če­wa,­kod­15­de­ce­(39%)­

s IgH­re­a­ran­žma­nom­ot­kri­ve­na­je­MRB:­mo­no­klo­nal­

nost­je­za­be­le­že­na­kod­šest­is­pi­ta­ni­ka­(14,6%),­a­bi­ klo­nal­nost­i­oli­go­klo­nal­nost­kod­po­tri­(7,3%).­U­ gru­pi­bo­le­sni­ka­sa­TCRγ­re­a­ran­žma­nom,­kod­15­de­ce­

(65,2%)­je­33.­da­na­le­če­wa­uočen­re­zi­du­al­ni­ma­lig­ni­ klon.­Mo­no­klo­nal­nost­je­za­be­le­že­na­kod­11­is­pi­ta­ ni­ka­(47,8%),­a­bi­klo­nal­nost,­tri­klo­nal­nost­i­oli­go­ klo­nal­nost­kod­po­jed­nog­de­te­ta­(4,3%)­(Gra­fi­kon­1). Kli­nič­ka­re­mi­si­ja­je­po­stig­nu­ta­kod­97,6%­is­pi­ ta­ni­ka,­a­jed­na­de­voj­či­ca­je­umr­la­usled­sep­se­pre­pro­ ce­ne­re­mi­si­je­33.­da­na­le­če­wa.­Ra­ni­me­du­lar­ni­re­ci­ div­je­di­jag­no­sti­ko­van­kod­če­tvo­ro­de­ce­(9,4%).­Smrt­ je­na­stu­pi­la­kod­ta­ko­đe­če­ti­ri­is­pi­ta­ni­ka­(9,4%):­kod­ jed­nog­de­ča­ka­na­kon­re­ci­di­va­bo­le­sti,­a­kod­tri­de­ te­ta­usled­sep­se.­Tran­splan­ta­ci­ja­ma­tič­ne­će­li­je­he­ ma­to­po­e­ze­je­ura­đe­na­kod­jed­nog­de­te­ta,­kod­ko­jeg­je­ot­ kri­ven­BCR/ABL­fu­zi­o­ni­tran­skript,­ko­ji­je­sa­da­u­

pot­pu­noj­re­mi­si­ji.

DISKUSIJA

U­le­če­wu­ALL­se­po­sti­že­vi­sok­ste­pen­kli­nič­ke­i­ mor­fo­lo­ške­re­mi­si­je­kod­vi­še­od­95%­de­ce,­a­du­go­ go­di­šwe­pre­ži­vqa­va­we­bez­zna­ka­ak­ti­va­ci­je­bo­le­sti­ kod­oko­80%­[15].­Me­đu­tim,­i­po­red­pri­me­ne­sa­vre­me­ nih­pro­to­ko­la,­kod­oko­15%­bo­le­sni­ka­se­ja­vqa­re­ci­ div­bo­le­sti,­za­šta­se­sma­tra­od­go­vor­nom­MRB,­ko­ja­se­ ne­mo­že­ot­kri­ti­kon­ven­ci­o­nal­nim­mi­kro­skop­skim­ Табела 1. Клиничке одлике испитаника с откривеним генским

реаранжманима

Table 1. Clinical characteristics of patients with detected gene re-arrangements

Параметар Parameter

Генски реаранжмани

Gene rearrangements

IgH TCR

Укупан број испитаника

Total number of patients 34 23

Пол Sex

Мушки

Male 18 9

Женски

Female 16 14

Узраст (године) Age (years)

<6 19 9

≥6 15 14

Број леукоцита Number of leukocytes

<20000 23** 12

≥20000 11 11

Хепатомегалија Hepatomegaly

Да / Yes 21 12

Не / No 13 11

Спленомегалија Splenomegaly

Да / Yes 15 14

Не / No 19 9

Статус ЦНС CNS status

1 31 21

2 1 1

3 2 1

Имунофенотип Immunophenotype

B 26* 15

T 8 8

Морфологија бласта Morphology of blasts

L1 13 7

L2 21 16

Апсолутни број бласта 8. дана Absolute blast count on day 8

<1000 30 20

≥ 1000 4 3

Костна срж 15. дана Bone marrow on day 15

M1 25 17

M2 8 5

M3 1 1

Костна срж 33. дана Bone marrow on day 33

M1 32 22

M2 -

-M3 1 1

* p<0.05; ** p<0.01

36,5% 56,1%

39% 82,9% 40

35

30

25

20

15

10

5

0

IgH TCR

33. дан терапије Therapy day 33 Дијагноза On set

Графикон 1. Брзина елиминације малигног клона код деце са IgH и TCRγ реаранжманима

Graph 1. Speed of elimination of malignant clone in children with IgH and TCRγ rearrangements

tus­3­(kli­nič­ki­zna­ci­in­fil­tra­ci­je­CNS­i­ma­we­od­ pet­će­li­ja­po­mi­kro­li­tru­u­li­kvo­ru­sa­pre­do­mi­na­ci­ jom­bla­sta­na­ci­to­spi­nu)­ta­ko­đe­usta­no­vqen­kod­dva­ de­te­ta­(4,9%).­FAB­kla­si­fi­ka­ci­ja­je­po­ka­za­la­da­je­pod­

tip­L1­bio­za­stu­pqen­kod­16­de­ce­(39%),­dok­su­mor­

fo­lo­ške­od­li­ke­pod­ti­pa­L2­za­be­le­že­ne­kod­25­de­ce­

(61%).­Imu­no­fe­no­tip­ko­ji­od­go­va­ra­B­će­lij­skoj­li­ ni­ji­je­utvr­đen­kod­29­de­ce­(70,7%),­dok­je­kod­12­de­ ce­(29,3%)­za­be­le­že­na­eks­pre­si­ja­an­ti­ge­na­spe­ci­fič­ nih­za­T­će­lij­sku­li­ni­ju.­Pre­ma­pred­vi­đe­noj­stra­ti­ fi­ka­ci­ji­ri­zi­ka,­u­stan­dard­ni­ri­zik­(SR)­je­svr­sta­ no­12­de­ce­(29,3%),­u­in­ter­me­di­jar­ni­ri­zik­(IR)­22­ (53,7%),­a­u­vi­sok­ri­zik­(VR)­se­dam­is­pi­ta­ni­ka­(17%).

U­gru­pi­od­41­is­pi­ta­ni­ka­re­a­ran­žman­za­IgH­gen­ski­

lo­kus­je­za­be­le­žen­kod­34­de­te­ta­(82,9%):­mo­no­klo­nal­ nost­kod­17­de­ce­(41,5%),­bi­klo­nal­nost­kod­14­(34,1%),­ tri­klo­nal­nost­kod­jed­nog­de­te­ta­(2,4%)­i­oli­go­klo­ nal­nost­kod­tri­is­pi­ta­ni­ka­(7,3%).­U­is­toj­gru­pi­is­ pi­ta­ni­ka­re­a­ran­žman­za­TCRγ­gen­ski­lo­kus­je­za­be­le­

žen­kod­23­de­te­ta­(56,1%):­mo­no­klo­nal­nost­kod­20­is­ pi­ta­ni­ka­(48,8%),­bi­klo­nal­nost­kod­tri­(7,3%)­i­tri­ klo­na­lost­kod­jed­nog­de­te­ta.­Kli­nič­ke­od­li­ke­de­ce­sa­

me­to­da­ma­[16].­In­ten­zi­fi­ka­ci­ja­te­ra­pi­je­pre­ma­gru­pi­ ri­zi­ka­je­već­prin­cip­le­če­wa­u­mno­gim­pro­to­ko­li­ ma­na­ci­o­nal­nih­i­me­đu­na­rod­nih­ko­o­pe­ra­tiv­nih­gru­ pa­[17].­Mno­ge­stu­di­je­uka­zu­ju­na­to­da­se­usme­ra­va­wem­ le­če­wa­pre­ma­vi­še­stru­kim­prog­no­stič­kim­fak­to­ri­ ma­po­sti­že­po­zi­ti­van­is­hod­i­znat­no­sma­wu­je­tok­sič­ nost­te­ra­pi­je­[18].­Ot­kri­va­we­fu­zi­o­nih­ge­na,­kao­ne­ za­vi­snih­mo­le­ku­lar­nih­mar­ke­ra,­po­mo­gla­je­raz­u­me­ va­wu­na­stan­ka­le­u­ke­mi­ja­[19]­i­di­rekt­nom­usme­ra­va­ wu­le­če­wa.­Me­đu­tim,­s­ob­zi­rom­na­to­da­se­struk­tur­ ne­hro­mo­zom­ske­abe­ra­ci­je­ja­vqa­ju­kod­tre­ći­ne­de­ce­s­ ALL­[20],­ot­kri­va­we­i­pra­će­we­re­a­ran­ži­ra­nih­ge­na­ za­IgH i TCR­stva­ra­ju­uslo­ve­za­pre­ci­znu­stra­ti­fi­

ka­ci­ji­ri­zi­ka­kod­svih­bo­le­sni­ka.

Ana­li­zom­IgH­re­per­to­a­ra­na­di­jag­no­zi­se­u­30­40%­

B­pre­kur­sor­skih­ALL­mo­že­ot­kri­ti­vi­še­od­jed­ne­ klo­nal­ne­po­pu­la­ci­je­le­u­ke­mij­skih­će­li­ja.­Ka­da­su­u­ pi­ta­wu­T­ALL,­oli­go­klo­nal­nost­TCR­lo­ku­sa­se­ja­vqa­

kod­ma­we­od­5%,­a­IgH­lo­ku­sa­kod­27%­bo­le­sni­ka­[21].­

S­dru­ge­stra­ne,­TCR­re­a­ran­žma­ni­se­mo­gu­ot­kri­ti­kod­

30­80%­B­pre­kur­sor­skih­ALL.­Ova­fre­kven­ci­ja­je­u­ ve­zi­sa­ste­pe­nom­sa­zre­va­wa­ma­lig­ne­B­će­li­je,­jer­što­ je­ma­wa­zre­lost­ma­lig­no­al­te­ri­sa­ne­će­li­je,­ma­wi­je­i­ pro­ce­nat­ot­kri­va­wa,­dok­se­IgH­re­a­ran­žma­ni­ja­vqa­

ju­u­10­20%­T­ALL.

U­na­šem­is­tra­ži­va­wu,­re­a­ran­žman­za­IgH­gen­ski­

lo­kus­je­za­be­le­žen­kod­82,9%­is­pi­ta­ni­ka,­i­to:­mo­no­ klo­nal­na­po­pu­la­ci­ja­le­u­ke­mij­ski­iz­me­we­nih­će­li­ ja­kod­41,5%,­bi­klo­nal­na­kod­34,1%,­tri­klo­nal­na­kod­ 2,4%,­a­oli­go­klo­nal­na­kod­7,3%.­Re­a­ran­žman­TCRγ­gen­

skog­lo­ku­sa­je­za­be­le­žen­kod­56,1%­de­ce,­od­če­ga­mo­no­ klo­nal­nost­kod­48,8%,­bi­klo­nal­nost­kod­7,3%,­a­tri­ klo­na­lost­kod­2,4%­bo­le­sni­ka.

Kao­što­se­za­struk­tur­ne­hro­mo­zom­ske­abe­ra­ci­je­ po­sta­vqa­pi­ta­we­raz­li­či­to­sti­u­od­no­su­na­et­nič­ku­ osno­vu,­ta­ko­se­ras­po­de­la­i­klo­nal­nost­IgH i TCR­re­

a­ran­žma­na­is­pi­tu­ju­u­od­no­su­na­ge­o­graf­sko­po­re­klo­ ili­so­ci­o­e­ko­nom­ske­uslo­ve­ži­vo­ta.­Skri­de­li­( Scri-de li)­i­To­ne­(To ne)­[22]­su­su­mi­ra­wem­re­zul­ta­ta­broj­

nih­mul­ti­cen­trič­nih­stu­di­ja­za­kqu­či­li­da­su­in­ci­ den­ci­ja­i­oso­bi­ne­ana­li­zi­ra­nih­re­a­ran­žma­na­raz­ li­či­ti­u­od­no­su­na­et­nič­ku­pri­pad­nost­i­so­ci­o­e­ko­ nom­ski­sta­tus.

Me­đu­is­pi­ta­ni­ci­ma­sa­IgH i TCR­re­a­ran­žma­ni­ma­

gen­skog­lo­ku­sa­kod­7,3%­de­ce­je­ot­kri­ven­BCR/ABL­fu­

zi­o­ni­tran­skript.­Ovaj­po­da­tak­je­od­su­štin­ske­va­ žno­sti,­jer­me­wa­kli­nič­ku­sli­ku­ovih­bo­le­sni­ka,­kao­ i­oče­ki­va­ni­od­go­vor­na­le­če­we­u­ko­rist­usta­no­vqe­ ne­tran­slo­ka­ci­je.­U­obe­gru­pe­de­ce­–­sa­IgH i TCR­re­

a­ran­žma­nom­–­vi­še­je­bi­lo­de­ča­ka,­ko­ji­su­u­pro­se­ku­ bi­li­uz­ra­sta­od­5,6­do­6,8­go­di­na,­s­tim­što­je­u­gru­ pi­is­pi­ta­ni­ka­sa­TCR­re­a­ran­žma­nom­bi­lo­vi­še­de­

ce­sta­ri­je­od­šest­go­di­na.

Kod­is­pi­ta­ni­ka­sa­TCR­re­a­ran­žma­nom­bi­la­je­oče­

ki­va­no­ve­ća­me­di­ja­na­bro­ja­le­u­ko­ci­ta,­jer­je­ini­ci­jal­ no­po­vi­še­na­vred­nost­le­u­ko­ci­ta­po­ve­za­na­sa­T­imu­ no­fe­no­ti­pom.

U­obe­gru­pe­is­pi­ta­ni­ka­bio­je­do­mi­nan­tan­mor­ fo­lo­ški­pod­tip­L2,­kao­i­B­imu­no­fe­no­tip­bla­sta­ (76,5%­pre­ma­65,2%),­što­do­ka­zu­je­da­pot­pu­no­re­a­ran­

ži­ra­ni­IgH­lo­ku­si­ni­su­od­li­ka­is­kqu­či­vo­B­le­u­ke­

mi­ja,­od­no­sno­TCR­re­a­ran­žma­ni­T­le­u­ke­mi­ja.­Van­der­

Vel­den­(Van der Vel den)­i­sa­rad­ni­ci­[23,­24]­su­po­tvr­

di­li­da­se­zna­tan­pro­ce­nat­B­i­T­le­u­ke­mi­ja­od­li­ku­je­ isto­vre­me­nom­eks­pre­si­jom­oba­re­a­ran­ži­ra­na­lo­ku­sa.

U­obe­gru­pe­na­ših­is­pi­ta­ni­ka­za­be­le­žen­je­loš­ od­go­vor­na­pro­ni­zon­osmog­da­na­le­če­wa­(11,8%­pre­ ma­13%),­ali­su,­iz­u­zev­jed­nog­de­te­ta,­to­bi­li­bo­le­sni­ ci­sa­tran­slo­ka­ci­jom­BCR/ABL.­Ta­ko­đe,­kod­jed­nog­de­

te­ta­je­iz­o­sta­la­kli­nič­ka­i­mor­fo­lo­ška­re­mi­si­ja­33.­ da­na­le­če­wa,­što­se­ob­ja­šwa­va­we­go­vom­Ph­po­zi­tiv­

no­šću­i­isto­vre­me­nim­ot­kri­va­wem­re­a­ran­žma­na­za­

IgH i TCRγ­gen­ski­lo­kus.

Po­re­đe­we­she­me­IgH i TCR­re­a­ran­žma­na­na­di­jag­

no­zi­to­kom­pra­će­wa­MRB­i­u­re­ci­di­vu­bo­le­sti­uka­ zu­ju­na­pro­me­ne,­i­to­za­vi­sno­od­ti­pa­le­u­ke­mi­je,­ste­ pe­na­sa­zre­va­wa­i­vr­ste­sa­mog­re­a­ran­žma­na.­Kam­pa­na­ (Cam pa na)­[25]­je­za­kqu­čio­da­je­ova­kav­re­zul­tat­po­

sle­di­ca­pro­me­ne­IgH i TCR­re­a­ran­žma­na­s­na­pre­do­

va­wem­bo­le­sti,­što­je­uoče­no­i­u­na­šem­is­tra­ži­va­wu.­ Kon­fi­gu­ra­ci­ja­gen­skih­lo­ku­sa­je­spe­ci­fi­čan­mar­ker­ le­u­ke­mij­ske­će­li­je,­te­sva­ka­pro­me­na­u­vre­me­nu­uka­zu­ je­i­na­pro­me­nu­sa­me­ma­lig­ne­će­li­je­i­we­nih­bi­o­lo­ ških­oso­bi­na­[26].

Klo­nal­na­evo­lu­ci­ja­je­va­žna­od­li­ka­agre­siv­nih­ B­pre­kur­sor­skih­le­u­ke­mi­ja,­jer­je­po­sma­tra­wem­raz­ vo­ja­MRB­to­kom­re­ci­di­va­bo­le­sti­uoče­no­da­je­zna­ čaj­no­vi­še­de­ce­kod­ko­je­je­na­početku­bolesti­usta­ no­vqe­na­oli­go­klo­nal­nost.­Van­Don­gen­(Van Don gen)­

i­sa­rad­ni­ci­[27]­u­svom­ra­du­ob­ja­vqe­nom­još­1998.­go­ di­ne­na­vo­de­da­su­de­ca­ko­ja­za­dr­ža­va­ju­oli­go­klo­nal­nu­ po­pu­la­ci­ju­će­li­ja­to­kom­le­če­wa­znat­no­kra­će­u­re­mi­ si­ji­bo­le­sti­i­da­je­kod­wih­ri­zik­od­na­stan­ka­smr­ ti­de­set­pu­ta­ve­ći,­što­se,­bez­ob­zi­ra­na­ma­wi­uzo­rak­ is­pi­ta­ni­ka,­mo­že­od­no­si­ti­i­na­bo­le­sni­ke­na­šeg­is­ tra­ži­va­wa.­Bjon­di­(Bi on di)­i­sa­rad­ni­ci­[28]­su­za­kqu­

či­li­da­pra­će­we­MRB­u­ra­nim­fa­za­ma­le­če­wa­uka­zu­ je­na­po­čet­ni­od­go­vor­na­te­ra­pi­ju,­he­mi­o­sen­zi­tiv­ nost­i­klo­nal­nost­pre­o­sta­lih­bla­sta,­što­je,­u­slu­ča­ ju­po­zi­tiv­nog­na­la­za,­pre­dik­tiv­ni­fak­tor­za­na­sta­ nak­re­ci­di­va;­to­je­po­tvr­đe­no­i­u­na­šoj­stu­di­ji.­Među­ na­šim­is­pi­ta­ni­cima­kod­ko­jih­je­ot­kri­ve­na­oli­go­ klo­nal­nost­IgH­re­a­ran­ži­ra­nih­lo­ku­sa,­kod­7,3%­wih­

je­do­šlo­do­re­ci­di­va­bo­le­sti,­a­11,8%­je­pre­mi­nu­lo,­ dok­je­me­đu­de­com­sa­TCRγ­re­a­ran­žma­nom­gen­skog­lo­

ku­sa­re­ci­div­di­jag­no­sti­ko­van­kod­13%,­a­smrt­ni­is­ hod­kod­17,4%­bo­le­sni­ka.

Pro­iz­vo­di­do­bi­je­ni­pri­me­nom­PCR­me­to­de­stva­

ra­ju­do­mi­nan­tan­sig­nal­u­klo­nal­noj­pro­li­fe­ra­ci­ji­ u­od­no­su­na­po­sto­je­ći,­ko­ji­po­ti­če­od­nor­mal­ne­po­li­ klo­nal­ne­po­pu­la­ci­je­lim­fo­ci­ta­[29].­Ose­tqi­vost­ot­ kri­va­wa­za­vi­si­od­ap­so­lut­nog­bro­ja­za­stu­pqe­nih­le­u­ ke­mij­skih­će­li­ja­i­ap­so­lut­nog­bro­ja­B­i­T­lim­fo­ci­ta­ u­kost­noj­sr­ži,­što­pred­sta­vqa­raz­log­za­kvan­ti­fi­ ka­ci­ju­PCR­pro­iz­vo­da,­jer­po­da­tak­o­klo­nal­no­sti­ni­

je­do­voq­no­sna­žan­pre­dik­tiv­ni­fak­tor­[30].­Mo­no­ klo­nal­ni­IgH i TCR­gen­ski­re­a­ran­žma­ni­mo­gu­se­ot­

kri­ti­sa­sen­zi­tiv­no­šću­od­0,5­1,5×10­1_{­iz­pe­ri­fer­ne­}

kr­vi,­od­no­sno­6×10­4­_{iz­aspi­ra­ta­ko­sne­sr­ži,­što­di­}

Re­zul­ta­ti­mno­gih­stu­di­ja­po­ka­zu­ju­da­se­kod­oko­50%­ de­ce­mo­že­ot­kri­ti­am­pli­fi­ko­van­PCR­pro­iz­vod­re­a­

ran­ži­ra­nih­IgH i TCR­gen­skih­lo­ku­sa­na­kra­ju­in­duk­

ci­je.­Ta­de­ca­su­si­gur­ni­kan­di­da­ti­za­na­sta­nak­re­ci­ di­va­bo­le­sti,­a­ri­zik­je­pro­por­ci­o­na­lan­iz­me­re­nom­ ni­vou­MRB­[32].­Stra­ti­fi­ka­ci­ja­ri­zi­ka­pre­ma­ova­ko­ usta­no­vqe­nim­ge­net­skim­mar­ke­ri­ma­omo­gu­ća­va­od­re­ đi­va­we­in­ten­zi­te­ta­te­ra­pi­je,­što­ih­či­ni­ne­za­vi­snim­ prog­no­stič­kim­fak­to­ri­ma.­In­di­vi­du­al­no­usme­ra­va­ we­te­ra­pi­je­omo­gu­ća­va­sma­we­we­tok­sič­no­sti­ci­to­stat­ skih­agen­sa­kod­de­ce­s­ra­nom­i­br­zom­ci­to­re­duk­ci­jom. Na­sta­nak­le­u­ke­mi­ja­je­di­na­mi­čan­pro­ces­ko­ji­uslo­ vqa­va­tok­bo­le­sti­stal­nim­pro­me­na­ma­u­po­pu­la­ci­ ji­ma­lig­nih­će­li­ja,­do­vo­de­ći­do­ge­ne­ri­sa­wa­klo­nal­ ne­fe­no­tip­ske­pro­men­qi­vo­sti,­či­me­di­rekt­no­uti­če­ na­is­hod­bo­le­sti­[33].­Za­hva­qu­ju­ći­uvo­đe­wu­mo­le­ku­ lar­ne­ge­ne­ti­ke­u­kli­nič­ku­di­jag­no­sti­ku,­ot­kri­va­se­i­ pra­ti­pro­men­qi­vost­ma­lig­nih­će­li­ja,­ko­ja­je­od­go­vor­ na­za­vi­so­ko­pro­li­fe­ra­tiv­ne,­agre­siv­ne­i­re­zi­stent­ ne­sub­klo­no­ve­[34,­35].

ZAKQUČAK

Re­a­ran­žman­IgH­gen­skog­lo­ku­sa­se­ot­kri­va­kod­če­ti­

ri­pe­ti­ne­bo­le­sni­ka,­a­TCRγ­ge­na­kod­vi­še­od­po­lo­

vi­ne.­U­obe­gru­pe­bo­le­sni­ka­do­mi­nant­na­je­mo­no­klo­ nal­na­po­pu­la­ci­ja­le­u­ke­mij­ski­iz­me­we­nih­će­li­ja­(kod­ sko­ro­50%­de­ce),­dok­je­oli­go­klo­nal­na­po­pu­la­ci­ja­naj­ ma­we­za­stu­pqe­na.­Oče­ki­va­no­ve­ća­me­di­ja­na­br­o­ja­le­ u­ko­ci­ta­se­be­le­ži­kod­de­ce­sa­TCRγ­re­a­ran­žma­nom­

zbog­ko­re­la­ci­je­sa­T­imu­no­fe­no­ti­pom.­Isto­vre­me­ na­eks­pre­si­ja­oba­re­a­ran­ži­ra­na­gen­ska­lo­ku­sa­je­bi­ la­če­šća­kod­de­ce­sa­B­imu­no­fe­no­ti­pom.­U­obe­gru­ pe­is­pi­ta­ni­ka­ne­po­vo­qan­is­hod­bo­le­sti­je­bio­pre­ do­mi­nan­tan­kod­de­ce­kod­ko­je­je­isto­vre­me­no­ot­kri­ ven­i­Fi­la­del­fi­ja­hr­o­mo­zom.­Iz­ra­zi­to­vi­sok­pr­o­ce­ nat­ula­ska­u­kli­nič­ku­re­mi­si­ju­je­za­be­le­žen­kod­svih­ is­pi­ta­ni­ka,­dok­je­pr­o­ce­nat­re­ci­di­va­i­smrt­nog­is­ ho­da­usled­re­ci­di­va­naj­ma­wi­kod­de­ce­bez­ge­net­skih­ mu­ta­ci­ja.­Ova­kav­re­zul­tat­ne­sum­wi­vo­uka­zu­je­na­zna­ čaj­po­čet­nog­ot­kri­va­wa­i­po­sma­tra­wa­mo­le­ku­lar­nih­ mar­ke­ra­to­kom­le­če­wa.

NAPOMENA

Ovaj­čla­nak­je­re­zul­tat­ra­da­na­pro­jek­tu­broj­143051­ Mi­ni­star­stva­za­na­u­ku­i­teh­no­lo­ški­raz­voj­Re­pu­ bli­ke­Sr­bi­je.

LITERATURA

1. Greaves M. Childhood leukaemia. BMJ. 2002; 342(7332):283-7. 2. Cazzaniga G, Biondi A. Molecular monitoring of minimal residual

disease. In: Pui CH. Treatment of Acute Leukemias. New Jersey: Humana Press; 2003. p.537-547.

3. Cave H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J, et al., for the European Organization for Research and Treatment of Cancer–Childhood Leukemia Cooperative Group. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 1998; 339(9):591-8. 4. Stock W, Estrov Z. Studies of minimal residual disease in acute

lymphocytic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2000; 14(6):1289-305.

5. Netto GJ, Saad RD, Dysert PA. Diagnostic molecular pathology: current techniques and clinical applications. BUMC proceedings 2003; 16:379-83.

6. Gribben JG. Minimal residual leukemia. In: Nathan DG, Orkin SH, Ginsburg D, Look AT. Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood. Vol 2. Philadelphia: W.B. Saunders; 2003. p.1259-1273. 7. Virella G. Immunoglobulin structure. In: Virella G. Medical

Immunology. 6th ed. New York: Informa Healthcare; 2007. p.55-64. 8. Burmester GR, Pezzutto A. Color Atlas of Immunology. Stuttgart:

Thieme; 2003.

9. Kuby J. Antibodies – structure and function. In: Goldsby RA, et al. Immunology. 5th ed. New York: WH Freeman; 2002. p.76-88. 10. Szczepanski T, Beishuizen A, Pongers-Willemse MJ, Hählen K, van

Wering ER, Wijkhuijs AJ, et al. Cross-lineage T cell receptor gene rearrangements occur in more than ninety percent of childhood precursor-B acute lymphoblastic leukemias: alternative PCR targets for detection of minimal residual disease. Leukemia. 1999; 13:196-205.

11. Green E, McConville CM, Powell JE, Mann JR, Darbyshire PJ, Taylor AM, et al. Clonal diversity of Ig and T-cell receptor gene

rearrangements identifies a subset of childhood B-precursor acute lymphoblastic leukemia with increased risk of relapse. Blood. 1998; 92(3):952-8.

12. Szczepanski T, Willemse MJ, Brinkhof B, van Wering ER, van der Burg M, van Dongen JJ. Comparative analysis of Ig and TCR gene rearrangements at diagnosis and at relapse of childhood precursor-B-ALL provides improved strategies for selection of stable PCR

targets for monitoring of minimal residual disease. Blood. 2002; 99(7):2315-23.

13. Germano G, del Giudice L, Palatron S, Giarin E, Cazzaniga G, Biondi A, et al. Clonality profile in relapsed precursor-B-ALL children by GeneScan and sequencing analyses. Consequences on minimal residual disease monitoring. Leukemia. 2003; 17:1573-82. 14. Čolović M, Pavlović S, Kragujac N, Čolović N, Janković G, Sefer D, et

al. Acquired amegakaryocytic thrombocytopenia associated with proliferation of γ/δ TCR+ t-lymphocytes and a bcr-abl (p210) fusion transcript. Eur J Haematol. 2004; 73:372-5.

15. Pui CH, Sandlund JT, Pei D, Campana D, Rivera GK, Ribeiro RC, et al. Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: Results of total therapy study XIIIB at St Jude Children’s Research Hospital. Blood. 2004; 104(9):2690-6.

16. Lightfoot TJ, Roman E. Causes of childhood leukemia and lymphoma. Tox App Pharm. 2004; 199:104-17.

17. Schultz KR, Pullen DJ, Sather HN, Shuster JJ, Devidas M, Borowitz MJ, et al. Risk and response based classification of childhood B-precursor acute lymphoblastic leukemia: A combined analysis of prognostic markers from the Pediatric Oncology Group (POG) and Children’s Cancer Group (CCG). Blood. 2007; 109(3):926-35. 18. Arico M, Conter V, Valsecchi MG, Rizzari C, Boccalatte MF, Barisone E,

et al. Treatment reduction of highly selected standard-risk childhood acute lymphoblastic leukemia. The AIEOP ALL-9501 study. Haematologica. 2005; 90(9):1186-91.

19. Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer. 2007; 7(4):233-5.

20. Cazzaniga G, Rossi V, Biondi A. Monitoring minimal residual disease using chromosomal translocations in childhood ALL. Best Prac Res Clin Haematol. 2002; 15(1):21-35.

21. Meleshko AN, Belevtsev MV, Savitskaja TV, Potapnev MP. The incidence of T-cell receptor gene rearrangements in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia is related to

immunophenotype and fusion oncogene expression. Leuk Res. 2006; 30:795-800.

22. Scrideli CA, Tone LG. Ig and TCR gene rearrangements in childhood ALL: Is there ethnic and socio-economic diversity of

Dragana JANIĆ

Univerzitetska dečja klinika, Tiršova 10, 11000 Beograd, Srbija

Email: dr.janic@eunet.rs

23. Van der Velden VHJ, de Bie M, van Wering ER, van Dongen JJ. Immunoglobulin light chain gene rearrangements in precursor-B-acute lymphoblastic leukemia: Characteristics and applicability for the detection of minimal residual disease. Haematologica. 2006; 91:679-82.

24. Van der Velden VHJ, Szczepanski T, Wijkhuijs JM, Hart PG, Hoogeveen PG, Hop WC, et al. Age-related patterns of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in precursor-B-ALL: implications for detection of minimal residual disease. Leukemia. 2003; 17:1834-44.

25. Campana D. Minimal residual disease studies in acute leukemia. Am J Clin Pathol. 2004; 122(Suppl):S47-57.

26. Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K, D’Aniello E, Hop WC, Panzer-Grumayer ER, et al. Detection of minimal residual disease identifies differences in treatment response between T-ALL and precursor B-ALL. Blood. 2002; 99(12):4386-93.

27. van Dongen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, Biondi A, Pongers-Willemse MJ, Corral L, et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet. 1998, 352:1731-8.

28. Biondi A, Valsecchi MG, Seriu T, D’Aniello E, Willemse MJ, Fasching K, et al. Molecular detection of minimal residual disease is a strong predictive factor of relapse in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia with medium risk features. A case control study of the International BFM study group. Leukemia. 2000: 14:1939-43.

29. Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia? Leukemia. 2007; 21:622-6. 30. Neale GAM, Campana D, Pui CH. Minimal residual disease detection

in acute lymphoblastic leukemia: Real improvement with the real-time quantitative PCT method? J Pediatr Hematol Oncol. 2003; 25(2):100-2.

31. Van der Velden VHJ, Panzer-Grumayer ER, Cazzaniga G, Flohr T, Sutton R, Schrauder A, et al. Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multi-center setting. Leukemia. 2007; 21:706-13. 32. Zhou J, Goldwasser MA, Li A, Dahlberg SE, Neuberg D, Wang H, et

al. Quantitative analysis of minimal residual disease predicts relapse in children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia in DFCIALL Consortium Protocol 95-01. Blood. 2007; 110:1607-11. 33. Stanulla M, Cario G, Meissner B, Schrauder A, Moricke A, Riehm H,

et al. Integrating molecular information into treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia – A perspective from the BFM Study Group. Blood Cells Mol Disease. 2007; 39:160-3. 34. Apostolidou E, Swords R, Alvarado Y, Giles J. Treatment of acute

lymphoblastic leukaemia: a new era. Drugs. 2007; 67(15):2153-71. 35. Lazić J. Korelacija prisustva minimalne rezidualne bolesti i

prognostičkih parametara u toku lečenja dece sa akutnom limfoblastnom leukemijom [magistarska teza]. Beograd: Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu; 2007.

SUMMARY

Introduction Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is a malig-nant clonal disease, one of the most common malignancies in childhood. Contemporary protocols ensure high remission rate and long term free survival. The ability of molecular genetic methods help to establish submicroscopic classification and minimal residual disease (MRD) follow up, in major percent responsible for relapse.

Objective The aim of the study was to detect the frequency of IgH and TCR gene rearrangements and their correlation with clinical parameters.

Methods Forty-one children with ALL were enrolled in the study group, with initial diagnosis of IgH and TCR gene rear-rangements by polimerase chain reaction ( PCR). MRD follow-up

was performed in induction phase when morphological remis-sion was expected, and after intensive chemiotherapy. Results In the study group IgH rearrangement was detected in 82.9% of children at the diagnosis, while TCR rearrangement was seen in 56.1%. On induction day 33, clonal IgH rearrange-ments persisted in 39% and TCR rearrangerearrange-ments in 36.5% of children.

Conclusion Molecular analysis of genetic alterations and their correlation with standard prognostic parameters show the importance of risk stratification revision which leads to new therapy intensification approach. MRD stands out as a precise predictive factor for the relapse of disease.

Keywords: acute lymphoblast leukaemia; minimal residual disease; IgH and TCR gene rearrangements

Immunoglobulin Genes and T-Cell Receptors as Molecular Markers in

Children with Acute Lymphoblastic Leukaemia

Jelena Lazić1_{, Lidija Dokmanović}1_{, Nada Krstovski}1_{, Jelica Predojević}2_{, Nataša Tošić}3_, Sonja Pavlović3_{, Dragana Janić}1

1_{Department of Haematology and Oncology, University Children’s Hospital, Belgrade, Serbia;} 2_{Childrens Hospital, Clinical Centre, Banja Luka, Bosnia and Herzegovina;}