Células mesenquimais do estroma da medula óssea tratadas com extrato de tendão bovino adquirem o fenótipo de tenócitos maduros.

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Artigo

original

Células

mesenquimais

do

estroma

da

medula

óssea

tratadas

com

extrato

de

tendão

bovino

adquirem

o

fenótipo

de

tenócitos

maduros

夽

Lívia

Maria

Mendonc¸a

Augusto

_,

_Diego

_Pinheiro

_Aguiar,

_Danielle

_Cabral

_Bonfim,

Amanda

dos

Santos

Cavalcanti,

Priscila

Ladeira

Casado

e

Maria

Eugênia

Leite

Duarte

InstitutoNacionaldeTraumatologiaeOrtopedia,RiodeJaneiro,RJ,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem20deoutubrode2014

Aceitoem3defevereirode2015

On-lineem3deoutubrode2015

Palavras-chave: Tendão

Célulasmesenquimaisdoestroma

damedulaóssea

Tenócitos

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Oestudo avaliaa diferenciac¸ãoinvitro das célulasmesenquimais isoladasdo

estromadamedulaósseaemtenócitosapóstratamentocomextratodetendãobovino.

Métodos:Tendõesbovinosforamusadosparaconfecc¸ãodoextratoeestocadosa−80◦_C.

Célulasmesenquimaisdoestromadamedulaóssea(BMSCs)detrêsdoadoresforamusadas

paraostestesdecitotoxicidadeporMTTediferenciac¸ãocelularporqPCR.

Resultados:Osdadosmostramquecélulasmesenquimaisdoestromadamedulaóssea

tra-tadasporaté21diasempresenc¸adoextratodetendãobovinodiluídoemconcentrac¸ões

crescentes(1:10,1:50e1:250)promovemaativac¸ãodaexpressãodebiglican,colágenotipo

Iefibromodulina.

Conclusão:Nossosresultadosmostramqueoextratodetendãobovinoécapazdepromover

adiferenciac¸ãodasBMSCsemtenócitos.

©2015SociedadeBrasileiradeOrtopediaeTraumatologia.PublicadoporElsevierEditora

Ltda.Todososdireitosreservados.

Mesenchymal

stromal

cells

from

bone

marrow

treated

with

bovine

tendon

extract

acquire

the

phenotype

of

mature

tenocytes

Keywords: Tendon

Mesenchymalstromalcellsfrom

bonemarrow

Tenocytes

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective:Thisstudyevaluatedinvitrodifferentiationofmesenchymalstromalcellsisolated

frombonemarrow,intenocytesaftertreatmentwithbovinetendonextract.

Methods:Bovinetendonswereusedforpreparationoftheextractandwerestoredat−80◦C.

Mesenchymalstromalcellsfromthebonemarrowofthreedonorswereusedforcytotoxicity

testsbymeansofMTTandcelldifferentiationbymeansofqPCR.

Results:The data showed that mesenchymal stromal cells from bone marrow treated

for up to 21 days in the presence of bovine tendon extract diluted at diminishing

夽

TrabalhodesenvolvidonoInstitutoNacionaldeTraumatologiaeOrtopediaJamilHaddad(Into),RiodeJaneiro,RJ,Brasil.

∗ _{Autorparacorrespondência.}

E-mails:liviiaaugusto@gmail.com,liviaaugusto@hotmail.com(L.M.M.Augusto).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2015.02.006

concentrations(1:10,1:50and1:250)promotedactivationofbiglycan,collagentypeIand

fibromodulinexpression.

Conclusion: Ourresultsshowthatbovinetendonextractiscapableofpromoting

differenti-ationofbonemarrowstromalcellsintenocytes.

©2015SociedadeBrasileiradeOrtopediaeTraumatologia.PublishedbyElsevierEditora

Ltda.Allrightsreserved.

Introduc¸ão

O tendão é um tecido especializado composto por

tendo-blastos etenócitosembebidos emumamatrizextracelular

compostamajoritariamenteporColágenotipoI.Ostenócitos

têmpotenciallimitadodeproliferac¸ãoeconferem,assim,uma

baixacapacidaderegenerativaaotendão.1,2

Aslesõestendíneasconstituemumgraveproblemana

prá-ticaortopédicaegeramaltos custosparaosistemapúblico

desaúde,alémdeimpactarnaqualidadedevidados

paci-entesafetados. Emboraostratamentosclínicosobjetivema

regenerac¸ão, osmétodos atualmentedisponíveisaindasão

ineficazes.Dessaforma,disfunc¸õesnotendãolevamà

inca-pacidadefísicadefinitiva.3-5

Ascélulasmesenquimaisisoladasdoestromadamedula

óssea (BMSCs, do inglês, Bone Marrow Stromal Cells) são

conhecidamente uma opc¸ão terapêutica promissora no

campo da terapia celular e bioengenharia de tecidos

musculoesqueléticos.5-8_{Nãoobstante,suaassociac¸ãoa}

bio-materiais sintéticos tem sido proposta como opc¸ão aos

tratamentosmodernos quevisamàreconstruc¸ãotendínea,

comoaenxertiaalógena,autógenaouxenógena.9,10_Ousode

BMSCsautólogasemenxertosbiossintéticosvisaamelhorar

osresultadosdecirurgiasconservadorasereduzirotempode

recuperac¸ãodaspropriedadesbiomecânicaspré-lesionais.11

Alémdisso,abaixaimunogenicidadedasBMSCspermiteseu

usoalogênicoeminimizaanecessidadedeimunossupressão

doreceptor.12

Apesarde seu significativo potencial terapêutico, pouco

aindasesabeacercadosmecanismosedasviasdesinalizac¸ão

envolvidos na determinac¸ão eprogressão da diferenciac¸ão

dasBMSCsparaavia tenogênica.ConsiderandoqueBMSCs

parecemresponderaestímulospresentesemextratosde

teci-dosmadurossadioseapresentamcaracterísticasfenotípicas

específicas,13,14 _{desenvolvemos a hipótese de que extratos}

detendãopudesseminduziradiferenciac¸ãodasBMSCsem

tenócitos. Dessaforma,o presente estudotem como

obje-tivoavaliarainfluênciadotratamento deBMSCshumanas

comdiferentesconcentrac¸õesdeextratodetendãobovinona

diferenciac¸ãoinvitroparaaviatenocítica.

Material

e

métodos

Isolamentoeexpansãodascélulasmesenquimais doestromadamedulaósseahumana

As BMSCs foram isoladas a partir de descartes cirúrgicos

de artroplastia de quadril obtidos de cinco pacientes (dois

homensetrêsmulheres)entre45-60anos,semcomorbidades.

Oconsentimentoinformadofoiobtidodetodososindivíduos

apósaaprovac¸ãodoprotocolodoestudopeloComitêdeÉtica

Institucional.Apósacoletanocentrocirúrgico,asamostras

foramarmazenadasemfrascosestéreiscomomeiodecultivo

deDulbeccomodificadoporIscove(IMDM;Iscove’sModified

Dulbecco’sMedium;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)

suplemen-tadocom20%desorofetalbovino(SFB;Gibco,GrandIsland,

NY)a4◦_{Cporaté18horas.Paraoisolamentodafrac¸ão}

celu-lartotal,asmedulasforamressuspensasemsoluc¸ãosalina

tamponada(PBS,PhosphateBufferSaline)emecanicamente

dissociadasde fragmentosósseos. Assuspensõescelulares

obtidasforamcoletadasemtubosde50mLecentrifugadas

por5mina836xga4◦_{C.Emseguida,ascélulasforam}

ressus-pensasem50mLdeIMDMsuplementadocom20%deSFBe

contadascomumacâmaradeNeubauer.Depois,6×105

célu-lasmononuclearesforamdistribuídasemfrascosdecultura

de75cm2_{em10mLdeIMDMcom20%deSFBe}

acondiciona-dasa37◦_Ce5%CO

2.Apóstrêsdias,afrac¸ãonãoaderentefoi

removidapormeiodelavagemcomPBSeomeiodecultivo

trocado.Após14dias,ascélulasforamremovidascomsoluc¸ão

deTripsina0,125%EDTA0,78mMeexpandidas.

Preparodoextratodetendãobovino

Foramobtidoscincotendõesdecalcâneobovino.Ostendões

foram macerados mecanicamente e em seguida triturados

com umhomogeneizadorelétricode20Watts depotência,

naproporc¸ãode1gdetecidopara2mldeIMDMsemSFB.15_O

extratodotecidofoicentrifugadoa836gporcincominutosa

8◦_{Ceposteriormenteacondicionadoa−80}◦_{Cpornomáximo}

doismeses.

AnálisedaviabilidadecelularpelométododeMTT

BMSCsforamcultivadasemplacasde24poc¸os,nadensidade

de 2,5×104 células/poc¸o etratadas com extratode tendão

bovinodiluídonasproporc¸õesde1:10,1:50ou1:250v/vem

meioIMDMsuplementadocom10%desorofetalbovino(SFB).

Aviabilidadecelularfoiavaliadaapós24,72,120e168horas

após otratamento,napresenc¸adeMTT(thiazolylblue

tetra-zoliumbromide,SigmaAldrich)naconcentrac¸ãode25mg/ml.

Concentrac¸õesiguaisdedimetilsulfóxido(DMSO)foram

usa-dascomocontrolenegativo.Aavaliac¸ãocolorimétricafoifeita

emcomprimentodeondade550nm,comoleitorSIRIOSSEAC

(Burladingen,Alemanha).

AnálisedaexpressãogênicaporqPCR

BMSCsforamcultivadassobasdiferentescondic¸ões

Tabela1–Genesalvosedesenhosdosprimersusadosnaanálisedeexpressãogênica

Genealvo Númerodeacesso Sequencia(5′_-3′_{) Produto(pb)}

COL1A1 NM000088.3 Senso GTGCTCCTGGTATTGCTGGT 150

antissenso GCTCTCCCTTAGCACCAGTGT

BGN NM001711.4 Senso TGAAGTCTGTGCCCAAAGAGA 157

antissenso GCCTTCTCATGGATCTTGGA

FMOD NM002023.4 Senso CAACACCTTCAATTCCAGCA 178

antissenso CTGCAGCTTGGAGAAGTTCA

ACTB NM 001101.3 Senso TACAATGAGCTGCGTGTGG 165

antissenso AGAGGCGTACAGGGATAGCA

COL1A1,colágeno1A;BGN,biglican;FMOD,fibrododulina;ACTB,betaactina;pb,tamanhodoprodutoamplificadoemparesdebases.

sete, 14 e21 dias. Emseguida, as células foram lavadas e oRNAtotalfoiextraído pelométododoTrizol® _(Invitrogen

Corp., Carlsbad, CA, USA) etratado com DNase (Ambion®

DNA-freeTM_{DNaseTreatment(LifeTechnologies),conforme}

asinstruc¸õesdofabricante.Aintegridadeeaquantidadedo RNAforamavaliadasporeletroforeseemgeldesnaturantee pormeio doespectrofotômetroNanodropTM1000(Thermo FisherScientificInc).Atranscric¸ãoreversaparaasíntesedo DNA complementar (cDNA) foi feita emduplicata, apartir de1,0␮gdeRNA,comosistemaImProm-IITM_Reverse

Trans-criptionSystem(Promega)conformeprotocolodofabricante. AqPCRfoifeitacomosistemadedetecc¸ãoPowerSybrGreen MasterMIX®_{(AppliedBiosystems,MolecularProbes,Inc)no}

equipamentoStepOne(AppliedBiosystems,Molecular Pro-bes,Inc).Foramusadosprimersdosgenesconstitutivos(rDNA 28Seactina)comocontroledoexperimento.Aexpressãodos genesdecolágenotipoI,BiglicaneFibromodulinafoi norma-lizadaemrelac¸ãoàexpressãodogeneconstitutivo␤-actina (tabela1).Ométodo2−C

T13foiusadoparaanáliseda

expres-são gênica dos genes alvo do estudo em relac¸ão ao gene

constitutivo.Osvaloresexpostosdaexpressãorelativa

consi-deramcomoreferênciaovalor1.0,fixoparaogrupocontrole

(calibrador).

Resultados

Comoobjetivodeavaliaratoxicidadedoextratodetendão

bovinosobreasBMSCs,fez-seoensaiodeMTT.Os

resulta-dosmostramqueoextratodetendãobovinoemnenhuma

dasconcentrac¸õestestadasnãoalteraaviabilidadedasBMSCs

(fig.1).Dessemodopodemosinferirqueoextratodetendão

bovinonãotemefeitocitotóxiconascélulas-tronco

mesen-quimais.

Uma vezque não houve efeito citotóxico, foi testado o

potencialdediferenciac¸ãodoextratodetendãobovinocom

ointuitode avaliarseosfatoresde crescimentopresentes

noextratoestimulamadiferenciac¸ãodascélulas

progenito-rasmesenquimais.Observamosqueextratoécapazdeativar

nasBMSCsaexpressãodosgenescolágenotipoI(fig.2),

bigli-can(fig.3)efibromodulina(fig.4)duranteoperíododesete,

14e21dias.Essesresultadosmostramqueoextratode

ten-dãobovinonãoécitotóxicoeécapazdeinduziraexpressão

dosgenesimplicadosnadiferenciac¸ãotenocíticaem

células--troncomesenquimais.Oextratoproteicodetendãopromove

aindaumainduc¸ãodemaneiradosedependenteeemfunc¸ão

dotempodeexposic¸ãoaoextrato.

24h 0

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

72h

Absorbância (U

.A.)

120h C 1:10 1:50 1:250 B

168h

Figura1–Avaliac¸ãodacitotoxicidadedoextratodetendão bovinonascélulasmesenquimaisdoestromadamedula óssea.Crepresentacondic¸ãocontrole,1:10,1:50e1:250 representamasdiluic¸õesdoextratodetendãobovinono meioIMDM,Brepresentaacondic¸ãocontroledatécnica ondenãohácélulas.Emtodasascondic¸õesfoiusadoo meioIMDMsuplementadocom1%deSFB.

1:10 0

10 20 30 40

1:50

Nív

eis relativ

osde e

xpressão do RNAm (colageno 1)

1:250

7 dias

14 dias

21 dias

1:10 0

10 20 30 40

1:50

Nív

eis relativ

o

sde e

xpressão do RNAm (biglican)

1:250 7 dias

14 dias

21 dias

Figura3–Avaliac¸ãodaexpressãodebiglicanporqPCRdas célulasmesenquimaisestromaistratadascom

concentrac¸õescrescentesdeextratodetendãobovino(1:10, 1:50e1:250).

1:10 0

10 20 30 40 50

1:50

Nív

eis relativ

osde e

x

pressão do RNAm (fibromodulina)

1:250 7 dias

14 dias

21 dias

Figura4–Avaliac¸ãodaexpressãodefibromodulinapor qPCRdascélulasmesenquimaisestromaistratadascom concentrac¸õescrescentesdeextratodetendãobovino(1:10, 1:50e1:250).

Discussão

Nosso estudo mostrou o potencial do extrato de tendão

bovino de induzir a diferenciac¸ão tenocítica das BMSCs e

que esse extrato não tem citotoxicidade em qualquer das

concentrac¸ões usadas. Em nossas análises, os resultados

mostraramque existeumajanelade tempoeespac¸o para

o sucesso na diferenciac¸ão das BMSCs em tenócitos.

Des-tacamosque para a eficiência doprocedimento as BMSCs

emconfluência de70% sejamtratadascom 1:50de extrato

de tendão por sete dias. Nesse momento observamos o

pico da expressão de biglican e fibromodulina,

marcado-resdetenócitos,16-21 _{o queindicao comprometimentodas}

BMSCscomalinhagemtenocítica.Oprotocolodetratamento

deveseguircomoaumentodaconcentrac¸ãodeextrato,que

deveserode1:10pormais10dias.IssofazcomqueasBMSCs

mantenhamaexpressãodeColágeno1eproporcionemuma

matriz extracelulareficiente para mantera viabilidade das

células.

Nossosresultadossugeremquenotendãoháfatoresde

crescimentoqueestimulamadiferenciac¸ãodecélulas

multi-potentesemcélulastendíneas,oqueabreumapossibilidade

para o campo da terapia celular no tratamento das

tendi-nopatias.Finalmente,opotencialfoiavaliadoemmodeloin

vitroehánecessidadedevalidac¸ãoemmodeloinvivopara

confirmac¸ão dosresultados.Ainda, levantamos a

possibili-dadede,futuramente,avaliaropotencialdoextratodetendão

provenientedetendõeshumanosdedoadores-cadáver.

Conclusões

O conjunto de resultados mostra que o tratamento das

BMSCs com extrato proteico de tendão bovino promove a

diferenciac¸ãoemtenócitos.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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c

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s

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