P. D. Mar sden* , S. K. K. Seah and H. Lecherman
í
Si n g l e o r ga n i sm s o f T r y p a n o so m a c r u z i o f t h e v i r u l e n t Pe r u st r a i n w er e i so l a t e d b y d i r e ct v i su a l i sa t i o n a n d w er e i n j e ct e d p e r i t o n e a l l y i n t o C F I m i ce. Si n gl e
t r y p a n o m a st i go t e s o f d i f f e r e n t m o r p h o l o g y a n d f r o m d i f f e r e n t so u r ce s (m o u se
b l o o d , i n v i t r o cu f t u r e a n d b u g f a e ce s) w e r e u sed . Si n g l e t r y p a n o m a st i go t e s f r om
m o u se b l o o d ca u se d p a r a si t a e m i a a n d f a t a i i t y i n a h i gh p e r ce n t a ge o f m i ce . T h i s w as t r u e i r r e sp e ct i v e o f t h e m o r p h o l o g y ( b r o a d o r n a r r o w f o r m ) o f t h e t r y p a n o m ast i go
t ec. Si n g l e o r ga n i sm s o f t h e cu l t u r e f o r m s w er e a l so ca p a b l e o f ca u si n g i n f e ct i o n , a l t h o u gh t h e se w e r e l e ss i n f e ct i o u s t h an si n gl e t r y p a n o m a st i go t e s o b t a i n e d f r o m m o u se b l o o d o r t h e r e d u v i i d b u g. T h e d i f f i cu l t i e s a t t e n d a n t o n t h e p e r f o r m a n ce o f
t he c i o n i n g t e ch n i q u e ar e d i sc u sse d a n d so m e i n d i ca t i o n i s gi v e n o f h o w t h ese p r o b l e m s ca n b e o ve r co m e .
I N T R O D U C T I O N
U si n g a Pe r u st r a i n o f T r y p a n o so m a c r u z i it h a s b e e n sh o w n t h a t t h e n u m b e r o f t r y p a n o m a st i go t e s i n o c u l a t e d i n f i u e n c e s t h e c ou r se o f i n f e c t i o n i n t h e m o u se h o st a s r egar ds su r v i v a l . A l so t h a t o n e o r g a n i sm o f t hi s st r a i n o b t a i n e d b y ser i al d i l u t i o n c o u l d i n d u ce a p at e n t , o f t e n l et hal , i n f e c t i o n i n a m o u se 6 . Si n c e su c h ser i al d i l u t i o n m a y b e at t e n d e d b y i n á c c u r a c i e s4 it w a s d e c i d e d t o d i r e c t l y v i su a l i se a n d i n o c u l a t e o n e f l age l l at e in a f u r t h e r se r i e s o f e x p e r i m e n t s t o st u d y t he i n f e c t i v e p o t e n t i a l o f i n d i v i d u a l f l age l l a- t es o f t h i s st r a i n .
M A T E R I A L A N D M E T H O D S
T h e v i r u l e n t Pe r u st r a i n o f T. c r u z i 9 w a s o o n t i n u o u sl y m a i n t a i n e d i n t h e l a b o r a t o r y b y w e e k l y sy r i n ge p assage i n C F I m i ce , in l i q ui d c u l t u r e m e d i u m ( b r i a n h e ar t i n f u si o n b r o t h w í t h 1 0 % h u m a n b l o o d ) a n d i n Rh o d -n i u s p r o l i x u s. Su i t a b l y d i l u t e d su sp e n si o n s o f f l a ge l l at e s f r o m t h e se so u r c e s w e r e p r e p
a-r e d i n a d i l u e n t o f h e p a a-r i n i se d ( 5 u n i t s/ m l ) n o r m a l sa l i n e p H 6. U si n g a f i n e p i p e t t e sm a l l d r o p s o f su sp e n si o n ( 1 - 2 m m d i am e t e r ) w e r e d r o p p e d o n t o c l e a n m i c r o sc o p e sl i d e s a n d sc a n n e d a t a m a g n i f i c a t i o n o f 5 0 0 X. If o n í y o n e f l a ge l l a t e w a s se e n t h i s w a s c on - f i r m e d b y a se c o n d o b se r v e r . Ep i m a st i g o t e s a n d t r y p a n o m a st i g o t e s c a n b e d i st i n gu i sh e d i n i so l a t e s ^ r o m b u g f ae ce s a n d c u l t u r e . T r y p a n o m a st i g o t e s ar e c h ar a c t e r i se d b y a p o st e r i o r t e r m i n a l k i n e t o p l a st a n d a r ap i d f l i c k e r i n g m o v e m e n t a c r o ss t h e f i e l d . Ep i m a st i go t e s a r e b r o ad e r , w i t h o u t a t e r m i n al k i n e t o p l a st a n d l e ssa c t i v e w i t h c l e a r l y d e f i n - ed se r p i g i n o u s m o v e m e n t s o f t h e f l age l l u m . A d i st i n c t i o n w a s m a d e b e t w e e n b r o a d an d n a r r o w b l o o d t r y p a n o m a st i go t e s. Dr o p s w h e r e o n l y o n e o r g a n i sm w a s vi su a l i se d w er e d r a w n i n t o a 1 m l p l a st i c sy r i n ge a l r e a d y c h a r ge d w i t h 0. 1 m l o f n o r m a l sal i n e t h r o u g h a f i n e need l e. A d i f f e r e n t sy r i n ge a n d n e e d l e w a s u se d f o r e ac h e x p e r i m e n t . T h e sy r i n ge c o n t e n t s w e r e i n o c u l a t e d i nt r a p e r i t o n e a l l y i n t o a 9 t o 1 2 g m m at e C F I m o u se . O n l y f u l l y m o t i l e f l age l l at e s w e r e i n o c u l at e d .
* D e p a r t m e n t o f Cl i n i c a i T r o p i c a l M e d i c i n e ; L o r t d o n Sc h o o l o f H y gi e n e a n d T r o p i c a l M e d i ci n e , L o n d o n Pr e t e n t a d d r a ss: N u d e o T r o p i c a l . F a c u l d a d e d e Ci ê n c i a s d a Sa ú d e ; U n iv e r sid a d e d e B r a sí l i a ; 7 0 . 0 0 0
Br a sf lí a , D F , Br a sil .
T o a sse ss if i n f e c t i o n h a d o c c u r r e d t h e t si l b l o o d o f m i c e w a s e x a m i n e d at 1 4 a n d 2 1 d a y s f o r t h e p r e se n c e o f t r y p a n o m a st i g o - t es. Re p e a t e d o b se r v a t i o n s i n o u r l a b o r a t o r y have sh o w n t h a t i n a l m o st al i a n i m a i s d e v e - l o p i n g p at e n t p a r a si t a e m i a i n f e c t i o n s ar e d e t e c t e d b y e x a m i n a t i o n at t h i s t i m e .
Fl a ge l l a t e s f r o m b u g s w e r e st u d i e d a t l east 3 0 d a y s af t e r g i v i n g t h e b u g s t h e i r i n f e c t i n g b l o o d m eai . Fl a ge l l a t e s f r o m c u l t u - re w e r e i so l a t e d at l east 7 d a y s af t e r i n n o - c u l a t i n g t h e c u l t u r e t o e n su r e t r y p a n o m a st i - go t e d i f f e r e n t i a t i o n h ad o c c u r r e d 2 . T o c h e c k t h e a c c u r a c y o f o u r c l o n i n g t e c h n i q u e a ser i e s o f e x p e r i m e n t s i n w h i c h " n e g a t i v e " d r o p s w e r e i n o c u l a t e d i n t o m i c e w e r e a l so d o n e in p ar al l el i n t w o se r i e s o f e x p e r i m e n t s.
O n e o f u s ( H . L ) u n d e r t o o k st u d i e s o f t h e m o r p h o l o g y o f f l a ge l l a t e p o p u l a t i o n sd e r i v e d f r o m t h e i n o c u l a t i o n o f a si n gl e t r y p a n o m a s- t i got e s. T h e n u m b e r o f t r y p a n o m a st i g o t e s per h i gh p o w e r f i e l d o f a w e t m o n o l a y e r f i l m o f t ai l b l o o d w a s c al c u l a t e d a f t e r e x a m i n i n g 1 0 0 su c h f i e l d s. A t t h e sam e t i m e a t h i c k b l o o d sm e ar i v a s st a i n e d w i t h Gi e m sa , e x a m i n e d u n d e r o
<.>
i m m e r si o n a n d 1 0 0 t r y p a n o m ast i go t e s c o u n t e d a n d d i f f e r e n t i a t e d i n t o b r oad , i n t e r m e d l a t e , a n d n a r r o w f o r m s. Me a - su r e m e n t s w i t h a n e y e p i e c e m i c r o m e t e r a n d c am e r a l u c i d a d r a w i n g s w e r e m a d e o f a l i m i t e d n u m b e r o f o r g a n i sm s ( 1 5 - 2 0 ) . W h i l e l e n gh t s w e r e v a r i a b l e t h e w i d t h s at n u c l e a r levei w e r e r e l a t i v e l y c o n si st e n t b e i n g f r o m 0 . 7 t o 1 . 0 m i c r o n f o r sl e n d e r , 1. 1 t o 1. 6 m i c r o n f o r i n t e r m e d i a t e a n d 1 . 7 t o 2. 1u c r o n f o r b r o a d t r y p a n o m a st i go t e s.
R E S U L T S
T a b l e 1 sh o w s t h e r e su l t s o f 3 se t s o f e x p e r i m e n t s u si n g m o u se b l o o d t r y p a n o m a s t i g o t e s o f t h e Pe r u st r a i n i so l a t e d f r o m d i f f e r e n t m o u se p a ssa ge s. O n l y o r g a n i sm s o f d e f i n i t e b r o a d o r n a r r o w m o r p h o l o g y w e r e se l e c t e d f o r i n o c u l a t i o n . T h e r e su l t s sh o w t h a t b o t h m o r p h o l o g i c a l f o r m s w e r e m o r e o r l ess e q u a l l y i n f e c t i o u s, a ssu m i n g t h a t i n a n y i n j e c t e d a n i m a l t h e si n g l e o r g a n i sm w a s
p i a c e d i n t o t h e p e r i t o n e u m . Si n g l e o r g a n i sm o f t h e n a r r o w f o r m i n f e c t e d 4 6 % o f t h e m i ce w i t h 4 0 . 5 % m o r t a l i t y ; a n d si n g l e o r g a n i sm s o f t h e b r o a d f o r m c a u se d p a t e n t i n f e c t i o n s i n 4 1 . 7 % o f t h e m i c e w i t h si m i l a r p e r c e n t age o f m o r t a l i t y .
T a b l e 2 e x p l o r e s t h e c o m p a r a t i v e i n f ec t i - v i t y t o m i c e o f t r y p a n o m a st i g o t e s d e r i ve d f r o m t w o p assage l eveis. T h e r e i s n o d i f f e r e n - ce i n i n f e c t i v i t y b e t w e e n i so l at e s o f t h e Pe r u st r a i n k e p t i n m i c e f o r o v e r 1 0 0 p assage s w h e n c o m p a r e d w i t h a n i so l at e t h a t w a s p e sse d t h r o u g h b u g s a n d o n l y c y c l e d i n m i ce t h r o u g h t w o p a ssa ge s b e f o r e d o i n g t h e e x p e r i m e n t a
T a b l e 3 sh o w s t h a t w h e n si n gl e t r y p a n o m a st i go t e s f r o m d i f f e r e n t so u r c e s a r e c o m - p ar e d t h e r e d o e s se e m t o b e a d i f f e r e n c e in t h e i r c o m p a r a t i v e i n f e c t i v i t y . A l t h o u g h t h e r e su l t s d o n o t r e ac h a st a t i st i c a l l y a n a l y sa b l e l evei t h o se f r o m c u l t u r e h ave t h e l ow e st i n f e c t i v i t y a n d t h o se f r o m m o u se b l o o d t he h i gh e st , w h i l e t h o se f r o m b u g f ae c e s o c c u p y a n i n t e r m e d i a t e p o si t i o n .
T a b l e 4 sh o w s a se r i e s o f e x p e r i m e n t s i n i t i a t e d o v e r t h r e e d a y s i n w h i c h t h e i n f e c t i v i t y o f d r o p s o o r r t a i n i n g o n e t r y p a n o m a st i - go t e w e r e c o m p a r e d w i t h t h o se c o n t a i n i n g o n e e p i m a st i g o t e a n d d r o p s i n w h i c h no o r g a n i sm w a s v i su a l i se d . T h e so u r c e w a sb u g f aeces. T h e r e su l t o f t h i s e x p e r i m e n t su ggç st s t h a t t f i e e p i m a st i g o t e s h av e a l o w i n f e c t i v i t y .
T a b l e 5 sh o w s a f u r t h e r e x p e r i m e n t inves- t i g a t i n g t h e i n f e c t i v i t y o f t r y p a n o m a st i g o t e s i n b l o o d at t h e 121 p assage l evei. U si n g t he " n e g a t i v e " d r o p t e c h n i q u e t o c h e c k o u r r e su l t s w e d e t e c t e d a f a i l u r e o f o u r c l o n i n g t e c h n i q u e . O n e o u t o f 2 0 m i c e i n j ec t e d w i t h d r o p s w h e r e n o o r g a n i sm w a s v i su al i se d d e v e l o p e d p ar asi t ae m i a.
T a b l e 1. In f e c t i v i t y o f si n gle T r y p a n o m a st i go t e s iaolat ad f r o m m o u m b l o o d a f t e r 4 0 o r m o r a p assage s in t nice
Pa ssa ge s in m i c e b a f o r e e x p e r im e n t
M o r p h o l o gy o f t r y p ar t o -m a st igo t e s
N o . o f m i c a i n j e ct ad
N o . o f m i c a i h o w i n g p ar asi
t a e m ia ( %)
N o . w it h p ar asi t ae m i a
d e a d b y 4 0 d a y s ( %)
4 0 N a r r o w 1 6 8 ( 5 0 %) 8
4 0 Br o a d 8 3 ( 3 7 . 5 %) 3
4 3 N a r r o w 11 2 ( 1 8 . 2 %) 1
4 3 Br o a d 8 3 ( 3 7 . 5 %) 3
5 0 N a r r o w 1 0 7 ( 7 0 %) 6
5 0 Br o a d 8 4 ( 5 0 %) 4
T o t a l N a r r o w 3 7 1 7 ( 4 6 %) 1 5 ( 4 0 . 5 %) Br o a d 2 4 1 0 ( 4 1 . 7 %) 1 0 ( 4 1 . 7 %)
T a b l a 2 . In f e c t i v i t y o f si n gle t r y p a n o m a st i go t e s isol at e d f r o m m o u se b l o o d a f t e r v a r y i n g p assage s in m i c a
Pa ssa ge s in m i c a N o . o f m i c a N o . o f m i c e N o . w it h b e f o r e in j e ct ad w i t h p ar asi p ar asit a e m ia e x p o su r e t a e m i a ( %) d a a d b y 4 0
d a y s ( %)
1 0 7 * 1 9 5 ( 2 8 %) 4 ( 2 1 %)
2 2 5 6 ( 2 4 %) 5 ( 2 0 %)
T a b l e 3 . Co m p a r a t i v e In f e c t i v i t y o f Si n gl e T r y p a n o m a st i go t e s T.
f r o m d i f f e r e n t so u r ce s
cruzi
So u r c a s N o . o f N o . o f m i c e N o . o f m ice m i c e w i t h p ar a t i d e ad in in j e ct e d t a e m i a ( %) on e m o n t h ( %)
M o u se
b l o o d 1 7 11 ( 6 4 . 6 %) 8 ( 4 7 . 0 %)
R e d u v i i d
b u g 21 7 ( 3 3 . 0 %) 7 ( 3 3 . 0 %)
Cu l t u r e 1 6 2 ( 1 2 . 5 %) 1 ( 6 . 2 %)
T a b l e 4 . I n f e c t i v i t y o f D r o p s p r e p ar e d f r o m b u g f ae ce s
Co n t e n t o f d r o p s
N o . o f m i ce in j e ct e d
N o . a n d % o f m i c e w i t h p ar a sit a e m ia
N o . a n d % o f m i c e d e ad in 4 0 d a y s
1 t r y p a n o m a st i go t e 2 1 7 ( 3 3 %) ' 7 ( 3 3 %) 1 e p i m a st i go t e 3 2 4 ( 1 2 . 5 %) 3 ( 9 . 5 %)
T a b l e 5 . In f e c t i v i t y o f d r o p s p r e p a r e d f r o m n o . 1 2 1 p assa ge in m i c e
F o r m o f N o . o f m i c e N o . a n d % N o . a n d %
T. cruzi inj e ct e d o f m i c e w it h o f m i c e w it h
p ar a si t a e m ia p a r a si t a e m ia d e ad in 4 0 d a y s
T r y p a n o m a st i go t e » 1 5 3 ( 2 0 %) 3 ( 2 0 %)
N o o r ga n ism 2 0 1 ( 5 %) 1 ( 5 %)
St u d i e s o f d e v e l o p m e n t o f p a r a si t a e m i a i n e i ght m i c e i n f e c t e d b y t h i s t e c h n i q u e sh o w e d t h e f o l l o w i n g r esul t s» T h e p r e p a t e n t p e r i o d w a s a b o u t t w i c e a s l o n g a s i n i n f e c - t i o n s i n d u c e d w i t h 1- 2 x 1 0 o r g a n i sm s, b e i n g 12 d a y s a s c o m p a r e d w i t h 6 d a y s i n i n f e c t i o n s i n d u c e d b y l ar ge n u m b e r s o f o r g a n i sm o Cl o n e d e r i v e d i n f e c t i o n s t e n d e d t o b e c h a r a c t e r i se d i n i t i a l l y b y a b l o o d p ar asi t ae m i a i n w h i c h sl e n d e r t r y p a n o m a st i go t e s p r e d o m i n a t e d , t h e b r o a d f o r m sa p p e a - r i n g i n i n c r e a si n g n u m b e r s a s t h e i n f e c t i o n p r ogr e ssed . In t w o m i c e h o w e v e r , b r o a d f o r m s w e r e in p r o m i n e n c e at t h e b e g i n i n g o f t h e i n f e c t i o n a n d i n o n e m o u se a f t e r d e c l i n - i n g t h e sl e n d e r f o r m r e t u r n e d i n h i g h n u m b e r j u st b e f o r e d e a t h 3 8 d a y s af t e r i n f e c t i o n . T h i s p a t t e r n w a s t h e r e f o r e v a r i a b l e as w a s t h e d e gr e e o f p a r a si t a e m i a a n d t h e o u t c o m e o f t h e i n f e c t i o n . O f t h e e i gh t i n f e ct e d m i c e st u d i e d d e a t h o c c u r r e d f r o m 15 t o 3 9 d a y s a n d o n e m o u se su r v i v e d .
D I SC U SSI O N
A l t h o u g h , t h e se e x p e r i m e n t s w e r e d o n e in 1 9 6 7 - 1 9 6 8 t h e y h av e o n l y b e e n r e p o r t e d in t h e l i t e r a t u r e i n a b st r a c t f o r m 7 . Ca m p o s an d Br e n e r 3 r e p o r t e d e x p e r i m e n t s c l o n i n g
T.
cruzi
i n t o c u l t u r e s a n d M i l e s8 a c h i e v e d success i n c l o n i n g i n t o c u l t u r e w i t h t w oT.
cruzi
st r ai n s, o n e b e i n g t h e Pe r u st r a i n u se d in t h i s w o r k . Br i e f m e n t i o n o f e ar l i er w o r k car r i ed o u t in t h i s l a b o r a t o r y w a s m a d e in t he p ap er b y Ro se n b e r get
a/ 1 0 . Si l v a 11 st u d i e d p o p u l a t i o n s o f t r y p a n o m a st i g o t e s d er i ve d f r o m c l o n e i n f e c t i o n s a n d n o t e d t h a t p o l y m o r p h i sm w a s p r e se n t i n su c h p o p u l a t i on s.T h e a d v a n t a ge o f a t e c h n i q u e su c h a s t h e o n e w e u se d i s t o i n v e st i ga t e t h e p o t e n t i a l
i n f e c t i v i t y o f i n d i v i d u a l m e m b e r s o f a f l agel - l at e p o p u l a t i o n . A s p o i n t e d o u t b y Lam - b r e c h t 5 su c h a p o p u l a t i o n m a y c o n si st of se ve r al a n t i g e n i c a n d b i o l o gi c a l v a r i a n t s an d o n e a sp e c t o f b i o l o g i c a l v a r i a t i o n c o u l d be d i f f e r e n c e s i n i n f e c t i v i t y . T h i s p o ssi b i l i t y st i m u l a t e d t h i s w o r k .
U n f o r t u n a t e l y t h e t e c h n i q u e is f r a u gh t w i t h d i f f i c u l t i e s a n d t h e se ar e o f sever al
t y p e s: *
1. T h e d r y i n g o f t h e sal i n e d r o p r e n d e r i n g it l e ss i so t o n i c a n d k i l l i n g t h e o r g a n i sm . Fo r t h i s r e a so n o n l y f u l l y m o t i l e f l a ge l l a t e s w er e i n o c u l a t e d . W a l k e r 12 h a s r e v i e w e d m e t h o d s o f o v e r c o m i n g t h i sd i f f i c u l t y i n c l u d i n g sp ot t - i n g u n d e r v i sc o u s si l c o n e w h i c h w e f o u n d u n sa t i sf a c t o r y d u e t o t h e d i f f i c u l t y o f d r aw - i n g u p t h e o r g a n i sm i n t o t h e sy r i n ge . In o u r e x p e r i m e n t w e w o r k e d a s q u i c k l y as p o ssi b l e i n a h i g h h u m i d i t y t o m i n i m i se e v a p o r a t i o n .
2. D o u b t a s t o w h e t h e r t h e o r g a n i sm w as t r a n sf e r r e d t o t h e m o u se p e r i t o n e u m . It c o u l d e i t h e r f a i l t o b e d r a w n i n t o t h e sy r i n ge o r f a i l t o l eave it o n i n o c u l a t i o n . O n e w a y t o o v e r c o m e t h i s w o u l d b e t o i n t r o d u c e t he d r o p o n a c o v e r sl i p f r a gm e n t d i r e c t l y t o t he a b d o m i n a l c a v i t y o f t h e m o u se t h r o u g h a su r gi c a l i n c i si o n . W e d i d n o t t o t h i s o w i n g t o t h e p r o b l e m o f d r y i n g o f t h e d r o p w i t h t he d e l a y .
4. Ex a m i n a t i o n o f t ai l b l o o d at 1 4 a n d 21 d ays d e t e c t s 9 5 % o f m i c e t h a t sh o w b l o o d p ar asi t aem i a i n o u r l a b o r a t o r y w i t h t h i s st rain. H o w e v e r , it c o u l d b e t h a t m i c e becom e i n f e c t e d a n d n e ve r sh o w d e t e c t a b l e par asi t aem i a. N u m e r o u s o b se r v a t i o n s o r se- r o l o gy o f su c h a n i m a i s b y o u r se l v e s a n d in c o l l a b o r a t i o n w i t h o t h e r se r o l o g i st s h av e f ailed t o gi v e r e p r o d u c i b l e r e su l t s. T o d a t e t here is n o r e a l i a b l e se r o l o g y ( w h e t h e r C F T , F A T o r I H A ) f o r t h e m o u se m o d e l . Re c e n t w o r k i n Br a z i i i a ( A l v a r e n ga a n d M a r sd e n , u n p u sb l i sh e d ) u si n g r e c h a l l e n ge w i t h a l e t h al dose o f Pe r u t r y p a n o m a st i g o t e s su gge st su r - vi vor s ( t h a t i s m i c e w i t h i m m u n i t y an d t her ef or e su r v i v i n g su c h c h a l l e n ge ) a r e l ess t han 5 %.
5. T h e p sy c h o l o g i c a l st r e ss a n d l a b o u r o f such c l o n i n g sh o u l d b e m e n t i o n e d . W e su g gest a m i n i m u m o f t h r e e w o r k e r s i s n e c e s- sar y an d f r e q ü e n t c h a n g e s b e m a d e in a w eek l y sc h e d u l e t o a m o r e v a r i e d r e sea r c h act ivit y. It i s a d v i sa b l e t o w o r k a s a t e a m o f t w o in o r d e r t h a t b o t h c a n c o n f i r m t h e m i c r osc o p e f i e l d a n d m o u se i n o c u l a t i o n c a n be e f f e ct ed r a p i d l y .
Si n c e t h e se t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s a r e c o m - m on t o al i e x p e r i m e n t s w e h ad t o a b a n d o n our o r i gi n a l p r o t o c o l a n d r e p o r t h e r e c o m p a - rat ive d at a. It a p p e a r s t h a t b l o o d st r a i n t r y p a n o so m e s o f b o t h b r o a d a n d n a r r o w m o r p h o l o gy c a n i n i t i a t e a f a t al i n f e c t i o n . Al so t h a t in t h i s st r a i n w i t h a l o n g h i st o r y o f m ouse a n d c u l t u r e p assage si n c e 1 9 6 3 , r e cent p assage t h r o u g h t h e b u g d o e s n o t d r am a t i c a l l y al t e r t h e n u m b e r o f t r y p a n o m ast i got e s i n su b se q u e n t m o u se p assage s w hi ch h ave t h e c a p a c i t y t o i n d u c e i n f e c t i o n .
T a b l e 3 su gge st s d i f f e r e n c e s i n t h e c a p a cit y o f t r y p a n o m a st i g o t e s d e r i v e d f r o m b u g, cul t ur e o r m o u se so u r c e s t o i n f e c t m i c e b u t t he n u m b e r s ar e sm al l . It i s d i f f i c u l t t o isol at e t r y p a n o m a st i g o t e s f r o m c u l t u r e si n c e t he vast m a j o r i t y ar e e p i m a st i go t e f o r m s. The l ow e r i n f e c t i v e p o t e n t i a l o f b u g d e r i v e d * t r y p a n o m a st i go t e s is b o r n e o u t b y a n o t h e r series o f e x p e r i m e n t s w h e r e o n l y 4 o f 2 8
si n gl e b u g t r y p a n o m a st i g o t e s p r o d u c e d d e t e c t a b l e i n f e c t i o n s i n t h e m i c e ( 1 5 %) .
A n o t h e r a sp e c t w o r t h y o f n o t e i s t h a t b l o o d t r y p a n o m a st i g o t e s t h e m se l v e s sh o w w i d e v a r i a t i o n i n t h e i r i n f e c t i v i t y . Co m p a - r i n g t h e d a t a i n t a b l e s 1, 2 , 3 a n d 5 i n f e c t i v i t y r at e s v a r y b e t w e e n 2 0 % a n d 6 4 . 6 %. W h a t is r e sp o n si b l e f o r su c h var i a- t i o n s i s n o t cl e ar si n c e c o n d i t i o n s w e r e si m i l a r i n al i e x p e r i m e n t s, b u t a si m i l a r si t u a t i o n h a s b e e n n o t e d i n c l o n e s o f
Trypa-nosoma bruceii 2 .
T a b l e 4 r a i se s a c o n t r o v e r si a l p o i n t i n t h at w e se e m t o h av e d e m o n st r a t e d a l o w i n f e c t i v i t y f o r e p i m a st i go t e s w h i c h ar e n o r m a l l y r e gar d e d a s a n o n - i n f e c t i o u s f o r m . W e al so h a v e so m e d a t a o n c r i t h i d i a d e r i ve d f r o m c u l t u r e s w h e r e i n 3 5 c l o n e e x p e r i m e n t s o f e p i m a st i go t e s t h r e e m i c e su b se q u e n t l y d eve- l o p e d p a r a si t a e m i a ( 9 %) . W h i l e w e w o u l d b e c a u t i o u s i n i n t e r p r e t i n g t h e se r e su l t s as f i n a l i n v i e w o f t h e t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s a l r e a d y r e f e r r e d t o , t h e p o ssi b i l i t y o f a t r y p a n o m a s t i go t e s b e i n g p r e se n t a n d u n d e t e c t e d in al i p o si t i v e e x p e r i m e n t s se e m s r e m ot e. It sh o u l d b e n o t e d t h a t B a k e r 1 h a s su gge st e d i n a v i a n t r y p a n o so m e s t h a t a n i n t e r m e d i a t e p r e - t r y - p a n o so m e f o r m m a y h av e a l o w i n f e c t i v i t y . Su c h a f o r m c o u l d e x i st i n
T. cruzi
an d in t h e u n st a i n e d St at e w e c o u l d n o t r e c o gn i seit.
A s r e ga r d s t h e c o u r se o f t h e p ar asi t ae m i a a n d l o n g e v i t y o f m i c e i n f e c t e d w i t h si n gl e o r g a n i sm s t h i s sh o w s a s m u c h v a r i a t i o n as t h o se i n d u c e d w i t h a st a n d a r d i n o c u l u m . A s m i gh t b e e x p e c t e d t h e p r e p a t e n t p e r i o d is p r o l o n g e d b u t t h e d u r a t i o n o f p ar asi t ae m i a, p r o p o r t i o n o f v a r i o u s m o r p h o l o gi c a l f o r m s a n d m o r t a l i t y t i m e s ar e var i ab l e . A s i n e x p e r i m e n t a l A f r i c a n t r y p a n o m i a si s t h e t h i n n a r r o w f o r m s t e n d t o a p p e a r f i r st b u t so m e e x c e p t i o n s w e r e n ot ed .
Acknowledgement s —
W e w i sh t o t h a n k Pr o f e sso r A. W . W o o d r u f f f o r t h e f a c i l i t i e s p r o v i d e d in h i s d e p a r t m e n t a n d Mr . L E . Pe t t i t t f o r t e c h n i c a l assi st a nce.S U M Á R I O
camundon-go s, cu l t u r a i n v i t r o e f e ze s d e t r i a t o m m e o ) f o r a m u sa d o s. T r y p a n o m a st i g o t a s
ú n i c o s d e sa n gu e d e c a m u n d o n g o s ca u sa r a m p a r a si t e m i a e m o r t a l i d a d e e m al t a p e r ce n t age m d e ca m u n d o n go s. Ist o o co r r e u i n d e p e n d e n t e m e n t e d a m o r f o l o g i a
( f o r m a s l ar gas e d e l ga d a s) d o s T r y p a n o m a st i go t a s. O r g a n i sm o s ú n i c o s d e f o r m a s d e cu l t u r a f o r a m t a m b é m ca p a ze s d e ca u sa r i n f e cçã o , e m b o r a f o sse m m e n o s
i n f e cci o so s q u e u m sô t r y p a n o m a st i go t a o b t i d o d e sa n gu e d e c a m u n d o n g o o u d e
t r i at om f n e o. Sã o d i scu t i d a s a s d i f i cu l d a d e s p r e se n t e s n a e x e cu çã o d a t ó cn i ca d e
" c l o n i n g " e é d a d a o r i e n t a çã o d e c o m o e st e s p r o b l e m a s p o d e m se r su p e r a d o s.
R E F E R E N C E S
1. B A K E R , J . R. — St u d i e s o n T r y p a n o so -m a a v i u -m I V . T h e d e v e l o p m e n t o f i n f e c - t i v e m e t a c y c l i c t r y p a n o so m e s i n c u l t u r e s g r o w n i n v i t r o . Pa r a si t o l o gy . 5 6 : 15,
1 9 6 6 .
2. C A M A R G O , E. P. — G r o w t h a n d d i f f e - r e n t i a t i o n o f T r y p a n o so m a cr u zi . I. O r i - gi n o f m e t a c y c l i c t r y p a n o so m e s i n l i q u i d m e d i u m . Rev. In st . M e d . T r o p . Sã o Pau l o . 6 . 9 3 , 1 9 6 4 .
3. C A M P O S, D. & B R E N E R , Z. - T e n t a t i va d e o b t e n ç í o d e c l o n e s d e T r y p a n o so m a cr u zi . Ci ê n ci a e Cu l t u r a. 2 0 :6 4 2 , 1 9 6 7 .
4. C A N T R E L L , W. — M u t a t b n r at e a n d a n t i ge n i c v a r i a t i o n i n T r y p a n o so m a e q u i -p e r d u m . J. In f e ct . Di s. 103:2 6 3 , 1 9 5 8 . 5. L A M B R E C H T , F. L . — Bi o l o g i c a l v a r i a t i o n i n t r y p a n o so m e s a n d t h e i r r e l a t i o n t o t h e e p i d e m i o l o g y o r Ch a g a s' d i sease. Rev. In st . M ed . Tr op. Sã o Pau l o . 7 : 3 4 6 , 1 9 6 5 .
6. M A R SD E N , P. D. — T r y p a n o so m a c r u z i i n f e c t i o u s i n C F I m i ce. I. M o r t a l i t y w i t h d i f f e r e n t d o se s o f t r y p a n o so m e s. A n n . Tr op . M e d . Par asi t . 6 1 S I, 1 9 7 6 .
7. M A R SD E N , P. D. ; SE A H , S. K . K . & L E
-C H E f l M A N , H . — T h e i n f e c t i v i t y o f si n gl e o r g a n i sm s o f T r y p a n o so m a cr u zi . Pr o c e e d i n g t h i r d In t e r n a t i o n a l Co o gr e ss o f P r o t o z o o l o g y . Le n i n gr a d , p. 3 0 7 , 1 9 6 6 .
8 . M l L E S, M . A . — C l o n i n g T r y p a n o so m a cr u zi . T r en s. So c . T r o p . M e d . H yg.
6 8 / 25 6 , 1 9 7 4 .
9. N U SSE N Z W I E G , V. & G O B L E , F. C. - F u r t h e r st u d i e s o n t h e a n t i g e n i c c o n st i - t u t i o n o f st r a i n s o f T r y p a n o so m a ( Sc h i - z o t r y p a n u m ) c r u zi . Ex p . Par asi t . 18: 224, 1 9 6 6 .
10. R O SE N B E R G f , M . E. ; M A R S D E N , P. D. & P E T T I T , L . E. — T h e i n f e c t i v i t y o f c u l t u r al so u r c e o f a Pe r u st r a i n o f T r y p a n o so m a c r u z i f o r C F I m i c e a n d r e d u v i i d b u gs.
A n n . T r op . M e d . Par asi t . 6 3 :2 0 7 , 1 9 6 9 . 1 1 . S I L V A , L. H . P. - O b se r v a ç õ e s so b r e o
c i d o e v o l u t i v o d o T r y p a n o so m a cr u zi .
Rev. I n st T r op . M e d . Sã o Pau l o . 1:9 9 , 1 9 5 9 .
