JOYCE CAMILLA SALTORATO
EFEITO DO TRATAMENTO EM CONJUNTO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA E DO
DICLOFENACO SOBRE OS ASPECTOS
HISTOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E FUNCIONAIS, EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO
MUSCULAR POR TRAUMA EM RATOS DIABÉTICOS.
BAURU
2017
EFEITO DO TRATAMENTO EM CONJUNTO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA E DO
DICLOFENACO SOBRE OS ASPECTOS
HISTOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E FUNCIONAIS, EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO
MUSCULAR POR TRAUMA EM RATOS DIABÉTICOS.
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Fisioterapia, área de concentração: Saúde Funcional, sob orientação do Prof. Dr. Rodrigo Leal De Paiva Carvalho.
BAURU
2017
Saltorato, Joyce Camilla S179e
Efeito do tratamento em conjunto da laserterapia de baixa potência e do diclofenaco sobre os aspectos histológicos, morfométricos e funcionais, em modelo experimental de lesão muscular por trauma em ratos diabéticos / Joyce Camilla Saltorato.
-- 2017.
74f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Leal de Paiva Carvalho.
Dissertação (Mestrado em Fisioterapia) - Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP
1. Anti-inflamatórios não esteroides. 2. Terapia a laser de baixa potência. 3. Recuperação da função fisiológica. 4. Diabetes Mellitus. 5. Lesão. I. Carvalho, Rodrigo Leal de Paiva. II. Título.
Dedico a minha mãe Ivone e meu irmão Everton pelo apoio e incentivo. Por nunca faltarem nos momentos que mais precisei e pelo esforço que proporcionou minha
caminhada até aqui.
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Leal de Paiva Carvalho, pela demonstração de confiança, pela paciência, ensinamentos e por me incentivar desde a graduação a seguir neste caminho e não desistir.
A Ligiane Souza pela contribuição na execução deste projeto e pela amizade nesses meses de convivência, parceria nos projetos, companhia nos dias de laboratório, caronas e amizade.
A todos os colegas do mestrado em Fisioterapia da Universidade pelo apoio, companheirismo em aulas e momentos de descontração.
Em especial a Mariele pela amizade, parceria, risadas e desabafos, enfim, por poder compartilhar todos os momentos bons e de ansiedade durante todo o mestrado.
Aos professores do programa de Mestrado em Fisioterapia, pelos ensinamentos.
A funcionária Angélica do laboratório do programa de Mestrado em Fisioterapia pela atenção, conversas descontraídas e cafés.
Aos funcionários do Biotério desta Instituição, pelo suporte e disponibilidade quanto ao uso das dependências do mesmo.
A Capes pelo auxilio.
“Aqueles que passam por nós não vão sós. Deixam um pouco de si, levam um
pouco de nós. ” Antoine de Saint-Exupéry
prevenção e tratamento, melhorando o controle glicêmico e reduzindo fatores de risco. Lesões musculares relacionam-se à atividade física, gerando perda funcional e alterações morfológicas. Terapias não farmacológicas e farmacológicas, são empregadas no tratamento, como drogas anti-inflamatórias e a laserterapia de baixa potência (LBP). Pouco se sabe a respeito da recuperação do tecido muscular pós lesão. Objetivo deste estudo foi avaliar a recuperação dos aspectos histológicos, morfométricos e funcionais pós lesão muscular por trauma em ratos diabéticos. Um único trauma no membro pélvico direito foi realizado, por uma mini-guilhotina. A irradiação foi na região do trauma, 1 hora pós indução da lesão, com energia de 3 J, por 30s. O Diclofenaco foi aplicado uma 1 hora pós lesão, na dose de 11.6 mg g -1 topicamente; quando aplicados em conjunto a irradiação ocorreu cinco minutos antes da aplicação da droga. As analises funcional, histológicas e morfométricas do tecido muscular; foram nos tempos 06, 12 e 24 horas. Os resultados foram expressos como médias ± EPM, Shapiro Wilk testou normalidade, ANOVA, seguido do teste Tukey para múltiplas comparações. Considerando-se P<0,05. Resultados:
No Índice funcional do Ciático (ISF) com 12 horas, observou-se melhora dos grupos lesionados quando comparados ao grupo hígido e grupo diabetes com p<0,01. Em 24 horas, lesão+laser e lesão+laser+diclofenaco exibiu menor dificuldade de deambulação, comparados aos grupos lesão e lesão+diclofenaco com p<0,05 e p<0,01. Com 48 horas, todos os lesionados melhoraram. Não foi possível avaliar os aspectos morfométricos com 06 horas. Com 12 e 24 horas, todos os grupos tratados melhoraram em relação ao grupo lesão não tratado. Nos aspectos histológicos, evidenciaram que a LBP não evitou os sinais típicos de lesão, porém, no grupo tratado com a LBP, comparado aos demais ficou aparente uma redução das áreas e sinais das alterações teciduais. Conclui-se que em relação a funcionalidade da marcha com 12 e 24 horas; LBP associada ao diclofenaco foi efetivo na melhoria do padrão de marcha, nas análises histológicas e morfométricas com 06, 12 e 24 horas após a indução da lesão, a associação da LBP com o diclofenaco, não apresentou os melhores resultados.
Palavras-Chave: Terapia a laser de baixa potência. Lesões. Sistema Musculesquelético. Recuperação da função fisiológica. Histologia. Diabetes Mellitus.
Anti-Inflamatórios não Esteroides.
Diabetes Mellitus (DM) has become an epidemic physical exercises work on prevention and treatment, improving glycemic control and reducing risk factors.
Muscle injuries are related to physical activity, causing functional loss and morphological changes. Non-pharmacological therapies are used in treatment, such as anti-inflammatory drugs and low-power laser therapy (LBP). However little is known about the recovery of post-injury muscle tissue in DM. Aim was to evaluate the recovery of histological, morphometric and functional aspects after traumatic muscle injury in diabetic rats. A single trauma to the right pelvic limb was performed by a mini-guillotine. The irradiation was in the trauma region, 1 hour post induction of the lesion, with energy of 3 J, for 30s. Diclofenac was applied 1 hour post-injury at a dose of 11.6 mg g -1 topically; When applied together the irradiation occurred five minutes before the application of the drug. The Functional Sciatic Index (ISF) evaluated gait functionality, histological and morphometric analyzes of muscle tissue;
At times 06, 12 and 24 hours. Results were expressed as means ± SEM, Shapiro Wilk tested for normality, ANOVA, followed by the Tukey test for multiple comparisons. Considering P <0.05. Results: In the ISF at 12 hours, improvement of the injured groups was observed when compared to the healthy group and diabetes group with p <0.01. In 24 hours, lesion + laser and laser + diclofenac lesion showed less difficulty in ambulation, compared to the lesion and lesion + diclofenac groups with p <0.05 and p <0.01. With 48 hours, all the injured improved. It was not possible to evaluate the morphometric aspects at 06 hours. At 12 and 24 hours, all treated groups improved over the untreated lesion group. In the histological aspects, they showed that laser therapy did not prevent the appearance of typical signs of injury, but in the group treated with LBP, when compared to the others a reduction of the areas and signs of the tissue alterations was apparent. It was concluded that in relation to the functionality of gait with 12 and 24 hours; LBP associated with diclofenac was effective in improving the gait pattern, different from that expected in our histological and morphometric analyzes at 06, 12 and 24 hours after lesion induction, the association of LBP with diclofenac did not present the best Results.
Key-words: Laser therapy. Low-level. Injury. Musculoskeletal system. Recovery of function. Histology. Diabetes Mellitus. Non-steroidal anti-inflammatory
Figura 1 - Gráfico que demonstra que o diclofenaco foi clinicamente relevante no alívio da dor na osteoartrite de joelho dentres os AINES tópicos. ... 26
Figura 2 - Miniguilhotina utilizada para realizar o trauma. ... 33
Figura 3 – Divisão dos grupos experimentais. ... 34
Figura 4 - (A) Medição dos parâmetros numa pegada de um rato normal. (B) Face plantar do pé de um rato para ilustrar a correspondência anatômica dos parâmetros avaliados. PL = Comprimento da Pegada; TS; = Largura da Pegada; e ITS = Largura Intermédia da Pegada. (C) Teste Funcional. (D) Teste Funcional. ... 36
Figura 5 - Equipamento Laser utilizado para irradiações dos animais. ... 38
Figura 6 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Hígido (Hi):
06 horas. ... 45
Figura 7 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabético (DM); 06 horas. ... 45
Figura 8 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabetes + Lesão (DML): 06 horas. ... 46
Figura 9 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Diclo (Di): 06 horas. ... 46
Figura 10 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser + Diclo (LaDi): 06 horas. ... 47
Figura 11 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser (La): 06 horas. ... 47
Figura 12 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Hígido (Hi): 12 horas. ... 48
Figura 14 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabetes + Lesão (DML): 12 horas. ... 49
Figura 15 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular Lesão + Diclo (Di): 12 horas: ... 49
Figura 16 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser + Diclo (LaDi): 12 horas. ... 50
Figura 17 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser (La): 12 horas. ... 50
Figura 18 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Hígido (Hi): 24 horas. ... 51
Figura 19 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabético (DM): 24 horas. ... 51
Figura 20 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Diabetes + Lesão (DML): 24 horas. ... 52
Figura 21 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Diclo (Di): 24 horas. ... 52
Figura 22 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser + Diclo (LaDi): 24 horas. ... 53
Figura 23 - Fotomicrografia de aspectos morfológicos no tecido muscular; Lesão + Laser (La): 24 horas. ... 53
Tabela 1 - Parâmetros do equipamento de Laser de Baixa Potência (LBP). ... 38
Gráfico 2 - VARIAÇÃO DE MASSA CORPORAL ... 41 Gráfico 3 - Comparativo entre as diferenças das médias do índice funcional obtido no teste walking track. com 6 horas: ... 41 Gráfico 4 - Comparativo entre as diferenças das médias do índice funcional - 12 horas ... 42 Gráfico 5 - Comparativo entre as diferenças das médias do índice funcional obtido no teste walking track. - 24 Horas. ... 43 Gráfico 6 – Gráfico de área das fibras musculares no tempo de 12 horas. ... 44 Gráfico 7 – Gráfico demonstra o menor diâmetro das fibras musculares. ... 44
AINES Anti-inflamatório não Esteroidal ANOVA Análise de Variância
AO Osteortrite do joelho ATP Adenosina Trifosfato
COX Ciclo-Oxigenase
D.IM Diclofenaco Intramuscular D.T. Diclofenaco Tópico
DM Diabetes Mellitus EPM Erro Padrão Médio H.E. Hematoxilina-Eosina
Hz Hertz
I.P Via Intraperitoneal
IL-1 Interleucina 1 IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8
IM Intramuscular
IPL Intensed Pulsed Light
ITS Intermediary Toe Spready
J Joules
LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LBP Laser de Baixa Potência
Mg/kg Miligrama por Kilo
Nm Nanômetros
PL Print Length
RNA Ácido Ribonucléico
RT PCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real SBD Sociedade brasileira de Diabetes
SFI Sciatic function index STZ Estreptozotocina
TNF Fator de Necrose Tumoral
TS Toe Spready
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 17
2.1 DIABETES MELLITUS... 17
2.2 LESÃO MUSCULAR ... 19
2.3 LESÃO E RECUPERAÇÃO MUSCULAR ... 22
2.4 DICLOFENACO ... 23
2.5 LASER DE BAIXA POTÊNCIA ... 27
3 OBJETIVO ... 31
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 32
4.1 ANIMAIS ... 32
4.2 MODELO DE LESÃO MUSCULAR POR CONTUSÃO ... 32
4.3 ESQUEMA DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 34
4.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA: MICROSCOPIA DE LUZ (ÓPTICA) ... 34
4.5 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ... 35
4.6 AVALIAÇÃO FUNCIONAL ... 35
4.7 TERAPIA LASER DE BAIXA INTENSIDADE ... 37
4.7.1 Parâmetros do Laser de Baixa Potência ... 38
4.8 TERAPIA FARMACOLÓGICA (AINE): DICLOFENACO ... 38
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 39
5 RESULTADOS ... 40
5.1 GLICEMIA ... 40
5. 2 VARIAÇÃO DE MASSA CORPORAL. ... 40
5.3 AVALIAÇÃO FUNCIONAL ... 41
5.4 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ... 43
5.5 ANÁLISE HISTOLÓGICA. ... 45
6 DISCUSSÃO ... 54
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 61
REFERENCIA1 ... 62
1 INTRODUÇÃO
O diabetes mellitus (DM) é um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos que apresentam em comum a hiperglicemia, caracterizado por resposta secretória inadequada de insulina, resultado de defeitos na ação da insulina, ou ambos (SBD, 2015). A crescente prevalência da doença representa uma preocupação significativa para a saúde pública, devido às suas numerosas e muitas vezes, graves complicações. Dentre as quais podemos destacar a nefropatia, retinopatia, neuropatia e doenças cardiovasculares (Soskolne e Klinger, 2001).
Segundo a Sociedade brasileira de Diabetes-SBD (2015) a DM está em ascensão. Atualmente, estima-se que a população mundial com diabetes seja da ordem de 387 milhões e que alcance 471 milhões em 2035.
A DM traz também, uma característica onerosa para seus portadores e suas famílias, mas também para o sistema de saúde devido sua natureza crônica e a gravidade das complicações e a dificuldade para controlá-las. Estima-se que nos EUA, o custo dos cuidados de saúde para um indivíduo com diabetes atinja duas vezes mais o valor do cidadão sem nenhuma doença, e no Brasil os gastos diretos variam entre 2,5 e 15% do orçamento anual da saúde do país. Com isso, os custos do DM afetam o indivíduo, a família e a sociedade, tanto nos aspectos econômicos quanto nos intangíveis como, por exemplo, dor, ansiedade e perda de qualidade de vida, gerando um impacto difícil de quantificar (SBD, 2015). Todavia, a maior parte dos custos diretos do diabetes relacionam-se com as suas complicações, que muitas vezes podem ser reduzidas, retardadas ou, em certos casos, evitadas (Pace, 2002).
A diabetes mellitus tipo 2, vêm aumentando de forma exponencial, estando ligada com a estrutura da dieta da população em geral, na falta de atividades físicas e o consequente aumento da prevalência da obesidade neste processo. Os programas de prevenção primária da diabetes baseiam-se nas intervenções desses fatores preditos (Sartorelli e Franco, 2003). Além do controle desses fatores, condutas farmacológicas e não farmacológicas, têm sido prescritas para a prevenção e tratamento do paciente diabético. Dentre as condutas não farmacológicas o exercício físico é sem dúvida de grande importância. Sabe-se que em um curto espaço de tempo o exercício físico tanto o aeróbio quanto de resistência gera diversos benefícios; dentre eles o aumento no consumo de glicose
como combustível por parte do músculo controlando a glicemia. Estudos demonstram que o controle de peso e aumento da atividade física diminui a resistência à insulina, diminuindo as chances de se desenvolver o diabetes mellitus (Oshida et al., 1989; Albright et al., 2000; Peluso et al., 2001).
As lesões musculares geralmente são precipitadas por trauma e estas, são frequentes na prática desportiva, podendo causar na maioria das vezes, dor e incapacidade, levando a um comprometimento tanto nas atividades ocupacionais quanto nas atividades de lazer. Em pacientes diabéticos, esse quadro pode se complicar através de uma infecção, pelo atraso do processo de regeneração tecidual, podendo terminar em amputação quando não for instituído um tratamento precoce e adequado. Contudo, pouco se sabe a respeito do processo histológico, morfométrico e da recuperação funcional após uma lesão musculoesquelética no quadro de diabetes. (Kirkendall e Garrett, 2002; Pace, 2003; Ada, 2016)
As lesões musculares muitas vezes levam um longo tempo de imobilização, retirando do paciente a possibilidade de realizar atividades físicas e interrompendo assim, o tratamento. Devido aos grandes períodos de inatividade, ocasionado por lesões musculares, os anti-inflamatórios acabam sendo largamente utilizados, podendo provocar efeitos adversos secundários como aumento nos números de fibras colágenas bem como diminuição da quantidade de fibras musculares, contribuindo para alterações nas propriedades biomecânicas do músculo (Jarvinen et al, 2002).
A cicatrização ou reparo tecidual de lesões musculares segue um padrão razoavelmente similar em indivíduos normais, independente dos diferentes mecanismos indutores da lesão (contusão, estiramento ou ruptura) (Jarvinen et al., 2005). Contudo, em um quadro diabético a lesão muscular pode apresentar características diferentes. Em trabalho caracterizando a lesão muscular em ratos diabéticos, de Godoi (2011) sugeriu que o DM é um estado pró-inflamatório, com persistente expressão de TNF-α e elevada expressão de miostatina. Observou ainda, em teste de caminhada, que a recuperação desses animais se mostrou retardada.
A Laserterapia de Baixa Potência (LBP) e terapias farmacológicas como anti- inflamatórios não esteroides (AINEs) (diclofenaco, miloxicam, Ibuprofeno) são rotineiramente utilizadas no tratamento e recuperação de lesões do musculoesquelético.
Entre os medicamentos mais comumente prescritos em todo o mundo os AINEs estão sendo indicados para pacientes com doença reumática e outras doenças musculoesqueléticas. Os AINEs tópicos são administrados para o tratamento de diversas condições e sua administração tópica oferece como benefício menor incidência de efeitos adversos sistêmicos. (José, 2014)
A maioria dos efeitos anti-inflamatórios do Diclofenaco sódico são devidos à inibição da síntese de prostaglandinas, sendo considerado um potente inibidor da ciclooxigenase in vivo e in vitro, além de diminuir a síntese de tromboxano e prostaciclina. (Muller, 2004).
Já a LBP como uma terapia não-farmacológica tem como alguns dos seus principais efeitos fisiológicos relacionados ao metabolismo em tecidos moles, ao aumento da microcirculação, à estimulação da cadeia respiratória mitocondrial e da função mitocondrial (Tulberg et al., 2003; Xu et al., 2008; Silveira et al., 2009).
Diminuições na liberação de espécies reativas de oxigênio (EROS) na atividade da creatinofosfoquinase e o aumento da produção de antioxidantes e proteínas de choque térmico também foram relatados como mecanismo de ação em estudos prévios (Avni et al., 2005; Rizzi et al., 2006).
Nos últimos anos, inúmeros estudos clínicos randomizados, placebo-controle tem sido realizados e publicados, fazendo com que a LBP já seja considerada como alternativa terapêutica para várias disfunções osteomusculares. Esses estudos avaliaram diversos parâmetros no reparo da lesão muscular, demonstrando resultados positivos sobre menor tempo de resolução do processo inflamatório em lesões do tecido muscular, reparo tecidual do tecido musculoesquelético em um menor tempo e aumento da absorção do Diclofenaco após lesão musculoesquelética, utilizando uma dose de 3 J em uma única sessão de tratamento (Ramos et al., 2012; de Paiva Carvalho et al., 2013), caracterização do processo inflamatório, modulação da atividade mitocondrial de macrófagos (Souza et al., 2015), formação de novas fibras musculares (Rodrigues et al., 2014). A LBP também vem demonstrando resultados positivos em disfunções no sistema osteomuscular como melhora em tendinopatias e dor (Haslerud et al, 2015), angiogênese e aumento da síntese de colágeno para promover a cicatrização de feridas (Chen et al, 2015; Brassolatti et al, 2016).
Entretanto, pouco se conhece a respeito da recuperação muscular por trauma em animais diabéticos, utilizando terapias não farmacológicas e farmacológicas como a LBP, atuando de forma conjunta.
Tendo em vista os dados apresentados anteriormente, se mostra extremamente necessário o entendimento do processo de recuperação muscular, culminando em sua fase funcional, visando melhorar o retardo relatado nesses processos, em ambiente com quadro hiperglicêmico. Ainda, a importância da utilização de terapias não medicamentosas pode representar um fator altamente relevante para o sistema de saúde brasileiro, especialmente em países subdesenvolvidos, visando diminuir custos financeiros com a aplicação de tratamentos somente com AINES. No entanto, o estabelecimento de parâmetros clínicos para a utilização desta técnica se faz ainda extremamente necessário.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 DIABETES MELLITUS
Diabetes mellitus (DM) não é uma única doença, mas um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos, com ascensão em virtude do crescimento e do envelhecimento populacional, da maior urbanização, da progressiva prevalência de obesidade e sedentarismo. Estimar o predomínio atual de DM e o número de pessoas com diabetes no futuro é importante, pois possibilita planejar e alocar recursos de maneira racional. Em 2014, estimou-se que existiriam 11,9 milhões de pessoas, na faixa etária de 20 a 79 anos, com diabetes no Brasil, podendo alcançar 19,2 milhões em 2035 (IDF, 2014).
O exercício físico é sem dúvida de grande importância para o portador de DM;
sabe-se que em um curto espaço de tempo gera diversos benefícios; dentre eles o aumento no consumo de glicose. Sabe-se que o controle de peso e aumento da atividade física diminui a resistência à insulina (Peluso et al, 2001).
A atividade física como terapia no diabetes pode reduzir o estresse oxidativo e os danos nas células β, ainda atua aumentando o conteúdo de insulina e também a secreção basal de insulina. Os mesmos autores relatam em seu estudo que o
exercício físico aumenta a viabilidade das células β pancreáticas, através da sinalização da interleucina-6 (IL). (Paula et al., 2015).
Por outro lado, tanto no diabetes mellitus tipo 1 (DM1) quanto no diabetes mellitus tipo 2 (DM2), o exercício físico pode requerer cuidados especiais. Assim, é papel de todo profissional de saúde encorajar, insistir, estimular e capacitar as pessoas com diabetes, de todas as idades, a praticar exercícios físicos regularmente, de maneira constante, progressiva e segura. Nos portadores de DM o problema mais frequente pós lesões são as úlceras acompanhadas geralmente de gangrena e infecção, demonstrando que, a combinação de isquemia e infecção é preponderante, ressaltando que é uma complicação comum entre essa população, chegando a ser a maior causa de hospitalização, morbidade e mortalidade (Pedrosa, 1999).
Modelos experimentais de DM têm sido utilizados há um longo tempo permitindo uma avaliação mais profunda das causas e consequências da doença, que são de grande importância para uma melhor compreensão do problema (Rossini, 2004). Os ratos são considerados excelentes modelos experimentais para a espécie humana, devido a sua semelhança anatômica e fisiológica essa similaridade possibilita que as informações obtidas em pesquisas envolvendo diferentes tecidos e órgãos, possam ser utilizadas para o tratamento de afecções que afetam o homem além de demonstrarem a eficácia da terapia que possam ser extrapolados para os seres humanos. Adicionalmente, a resistência desses animais em comparação com outras espécies é um aspecto positivo a ser considerado em estudos dessa natureza. (Souza e Silva, 2016)
Sabe-se que na medicina esportiva o DM está relacionado com infecções, atraso no processo de reparo tecidual e falha cirúrgica. Ainda, durante o processo cicatricial pode atrasar o fechamento e contração da lesão tecidual, atuar negativamente nos granulócitos, sobre a quimiotaxia de leucócitos e macrófagos, afetar o metabolismo do colágeno, as células vermelhas do sangue e as características biomecânicas (Wolfson et al., 2013; Minossi et al., 2014). Pode também, causar no paciente, a neuropatia diabética além de problemas em arteríolas periféricas (Andrews et al., 2015).
Pimazoni, Rodbard e Zanella (2011) afirmar que níveis elevados de glicemia promovem o desenvolvimento de lesões orgânicas extensas e irreversíveis, afetando a retina, os rins, os nervos e os vasos sanguíneos grandes e pequenos. A
hiperglicemia continuada é tóxica para o organismo por três mecanismos distintos:
promoção da glicação de proteínas, hiperosmoralidade e aumento dos níveis de sorbitol intracelular. Gerando diversos problemas sistêmicos, dentre eles o retardo do reparo do tecido musculoesquelético.
2.2 LESÃO MUSCULAR
Uma grande parte dos profissionais da saúde defende a utilização de exercícios físicos como forma de prevenção, controle e procedimento terapêutico empregado em inúmeras doenças humanas. (Assunção e Ursine, 2008).
Porém, com esse crescente estímulo a prática de atividade física por diversos profissionais da saúde, as lesões musculares traumáticas podem surgir proporcionalmente (Garrett Jr., 1990; Crisco et al., 1994).
Nos centros de reabilitação são comumente encontradas lesões musculoesqueléticas que na maioria dos casos são responsáveis pela redução significativa na capacidade funcional do paciente, caracterizadas ainda por um lento processo de recuperação e as vezes parcial, levando ao aumento da probabilidade de formação de tecido cicatricial, recidiva da lesão, atrofia contratura e incapacidade crônica. (Huard, 2002; Jarvinen, 2005).
As lesões musculares podem ser classificadas em: diretas e indiretas, traumáticas e atraumáticas, parciais ou totais. (Baoge et al; 2012)
Lesões diretas são decorrentes das situações de impacto, geradas durante as quedas ou traumatismos de contato, já as lesões indiretas ocorrem na ausência de contato e são observadas mais frequentemente nas modalidades esportivas que exigem potência na realização dos movimentos (Desmett, 2000; Verrall et al, 2003).
Lesões traumáticas são representadas pelas contusões, lacerações e o estiramento muscular, enquanto as lesões atraumáticas são representadas pelas cãibras e pela dor muscular tardia (Merrick 2002; Liu et al., 2009).
Lesões parciais acometem apenas uma parte do músculo já as lesões totais abrangem a totalidade do músculo e acarretam deformidade aparente (o ventre muscular encurta-se no sentido da sua origem óssea durante a contração muscular), causa assimetria e perda da movimentação ativa (Markert et al, 2005).
A contusão muscular é considerada uma lesão traumática direta que corresponde a 60 - 70% das lesões decorrentes de atividades físicas, causando
atrito e lesão dos tecidos subjacentes, bem como, o rompimento de capilares, levando ao aparecimento de hematoma intermuscular e hemorragia da fáscia muscular, que podem desencadear equimose distal ou hematoma intramuscular.
Sendo esta uma lesão de restituição mais lenta e associada à miosite ossificante e contratura da musculatura (Yeung et al, 2002; McBrier et al, 2009).
Após a lesão é comum sinais e sintomas de dor localizada na realização de movimentos ativos e passivos, ocorre a formação de edema devido ao resultado de sangramento intersticial e limitação de movimento, que geralmente é evidente. Nas contusões consideradas leves, a mobilidade articular não é comprometida, ocorre sensibilidade local, mas sem alteração funcional (Merrick, 2002, Iyomasa et al, 2009).
Como consequência da contusão moderada, a agressão atinge tanto a pele quanto tecido subcutâneo, com vasos sanguíneos e fibras musculares podendo sofrer pequenas rupturas em diferentes graus de intensidade, e consequentemente gerando desde um simples extravasamento sanguíneo na pele, como até um hematoma significativo. Neste tipo de contusão as dores são intensas e localizadas, mas com sinais de difusão, edema na região acometida, postura antálgica e comprometimento de 25% ou mais da função muscular (Charge, 2004; Jarvinen et al, 2002).
Entretanto, nas contusões mais profundas ou graves/severas, que atingem os tecidos musculares, o sangramento pode não ser evidente durante muitas horas, podendo apenas haver intumescimento e hipersensibilidade do local, como já citado a respeito das lesões leves e ocasionando perda igual ou maior que 50% da função muscular. Poucas horas após a lesão, dependendo do grau de comprometimento dos tecidos musculares, desenvolve-se um intenso processo de resposta inflamatória em que células inflamatórias substituem o hematoma inicial para a eliminação do tecido lesado (Iwata et al, 2010; Marques et al, 2009).
Após uma contusão, os segmentos íntegros e adjacentes ao segmento lesado, retraem-se fazendo com que um espaço seja formado entre eles. Devido à lesão de capilares existentes no músculo, que é ricamente vascularizado, ocorre infiltração de sangue no sitio da lesão, que posteriormente será substituído por tecido cicatricial frouxo. Este tecido de granulação é necessário para manter os segmentos unidos, o que permitirá posteriormente a regeneração muscular.
Entretanto, quando a formação dele é excessiva, ele impedirá tanto a regeneração quanto a inervação das miofibrilas (Crisco et al, 1994, McBrier et al, 2007).
Nesta fase de necrose tecidual, que é iniciada pelo aumento do influxo de cálcio gerado pelos danos provocados no sarcoplasma da fibra, segue-se uma resposta inflamatória iniciada por meio das células inflamatórias que invadem a área lesionada, assim como por enzimas quimiotáxicas liberadas pelas fibras necrosadas (Nosaka et al, 2001; Wilkin et al, 2004).
Após uma lesão muscular, ocorre ruptura de capilares e consequente chegada de células inflamatórias e citocinas no local da lesão (Merrick, 2002, Tidball, 2005). Posteriormente, as substâncias liberadas das partes necrosadas das fibras musculares atuam como quimiotáticos e aumentam ainda mais o extravasamento de células inflamatórias. Macrófagos e fibroblastos também são ativados e fornecem mais sinais quimiotáticos (por exemplo, fatores de crescimento) para células inflamatórias (Tidball, 1995).
Na resposta inicial à lesão musculoesquelética, fatores quimiotáticos estimulam a infiltração de neutrófilos, incluindo prostaglandinas, TNF-α e as interleucinas IL-1ß e IL-6. Na fase aguda, os neutrófilos são as células mais abundantes no sítio da lesão, mas dentro das primeiras 24 horas, o número de neutrófilos começa a decair e a quantidade de macrófagos aumenta (Tidball, 2005).
Estas células produzem enzimas proteolíticas que realizam a fagocitose do material necrótico e reparo do tecido lesionado, porém, esta resposta não é específica, podendo acarretar lesão de células normais adjacentes ao local lesionado (Hong et al., 2009). Apesar do declínio, os neutrófilos permanecem funcionalmente ativos e sua quantidade no sítio de lesão ainda se mantém elevada comparada ao nível basal, por aproximadamente cinco dias, após os quais sua atividade retorna gradualmente aos níveis pré-lesão (Shephard e Shek, 1998; Bunn et al., 2004).
Notavelmente, a lâmina basal que circunda as partes necrosadas das fibras musculares é resistente ao ataque dos macrófagos, que permanece intacta e serve como um arcabouço dentro do qual as células satélites viáveis começam a formação de novas fibras musculares (Hurme e Kalimo, 1992).
Minamoto e colaboradores (1999 e 2001) traçaram anteriormente o perfil estrutural do tecido muscular após a lesão por contusão através de análise histológica. Seus estudos identificaram uma intensa presença de infiltrado celular e um estágio severo de necrose das fibras musculares na região que pode, mais
especificamente, ser segmentada intercalando áreas de musculatura íntegra, fibra já em processo regenerativo e área ainda lesionada.
Alguns fatores podem ser considerados predisponentes às lesões musculares, embora ainda sejam discutidos amplamente na literatura, como as deficiências de flexibilidade, os desequilíbrios de força entre músculos de ações opostas (agonistas e antagonistas), as lesões musculares pregressas, os distúrbios nutricionais, os distúrbios hormonais, as alterações anatômicas, as infecções e doenças instaladas como a diabetes mellitus (DM). (Haussinger et al., 1993; Crook et al., 2007).
2.3 LESÃO E RECUPERAÇÃO MUSCULAR
O indivíduo portador de DM tipo 1 apresenta um declínio na força muscular das articulações do tornozelo e joelho podendo ser explicado, em parte, pela atrofia secundária à neuropatia diabética, tornando o paciente diabético durante sua prática de atividade física mais susceptível a um episódio de lesão muscular (Andersen, 1998).
A regeneração muscular envolve vários processos moleculares e celulares altamente organizados responsáveis por conduzir a recuperação estrutural e funcional do músculo lesionado. Este processo é coordenado por diversos fatores que contribuem para a progressão da resposta do tecido muscular à lesão, entre eles destacam-se a expressão de genes musculares específicos, as células tronco, fatores tróficos, fatores glicoproteicos produzidos pela matriz extracelular e as células satélites. Na lesão muscular causada pelo exercício físico ocorre rompimento dos filamentos estruturais e organelas do músculo (Souza et al, 2015).
A lesão muscular decorrente da atividade física é muito comum em indivíduos ativos, causando na maioria das vezes dor e incapacidade, levando a um comprometimento tanto nas tarefas ocupacionais quanto nas atividades de lazer (Kirkendall e Garrett, 2002). A cicatrização ou reparo tecidual de lesões musculares segue um padrão razoavelmente similar em indivíduos normais, independente dos diferentes mecanismos indutores da lesão (contusão, estiramento ou ruptura) (Järvinen et al., 2005). Este processo é composto por três fases (Hurme et al., 1991):
1) Destruição: caracterizada pela ruptura e necrose subsequente de fibras musculares, formação de hematoma entre as fibras rompidas e uma reação de células inflamatórias.
2) Reparo: é constituída por fagocitose do tecido necrosado, regeneração de fibras musculares e produção concomitante de uma cicatriz de tecido conjuntivo bem como revascularização com surgimento de capilares na área lesada.
3) Remodelamento: período durante o qual ocorre a maturação de fibras musculares regeneradas, a contração e reorganização do tecido cicatricial e a recuperação da capacidade funcional do músculo. Quando ocorre a formação de cicatriz fibrótica, subsequente a dano tecidual, ela está associada a uma recuperação lenta e incompleta da força muscular (Foster et al., 2003). Alguns estudos sugerem que a fibrose ocasionada após lesão, pode ser a causa de rupturas musculares recorrentes (Greco et al., 1991; Kujala et al., 1997). Há muito tempo é investigado se a diminuição na quantidade de macrófagos (como na fase tardia da inflamação) teria consequências negativas sobre o processo de cicatrização, incluindo a redução da reparação muscular, da diferenciação de células satélite e do crescimento de fibras musculares (Tidball e Wehling-Henricks, 2007).
A DM é caracterizada por glicemia e micro e macro-angiopatia, que são fatores de risco para retardo no processo de cicatrização de feridas e prevalência de lesões crônicas, os principais defeitos de cicatrização de feridas diabéticas são prejudiciais, tais quais a reepitelização e estagnação de granulação do tecido em formação. Embora o tecido musculoesquelético tenha a capacidade de regeneração, o processo é lento e muitas vezes resultam em algum grau de comprometimento funcional e aumento da susceptibilidade a uma maior injuria tecidual (Ada, 2016).
Portanto, abordagens terapêuticas padronizadas que podem acelerar ou melhorar o processo de reparação muscular são extremamente importantes. Nos últimos anos, a terapia com laser de baixa potência (LBP) surgiu como uma alternativa eficaz para o tratamento de lesões musculares e tornou-se cada vez mais comum na prática clínica.
2.4 DICLOFENACO
Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) são rotineiramente usados com efeitos benéficos em curto prazo, enquanto que, cronicamente, podem induzir
respostas negativas sobre a regeneração muscular. Os AINEs são comumente prescritos para tratar lesões musculares, pois inibem a ação das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2), que são enzimas que a partir de sucessivas reações do ácido araquidônico, sintetizam prostaglandinas. (Beiner, 2001; Mackey, 2013).
A cicatrização dos tecidos musculoesqueléticos ocorre por meio de resposta tecidual distinguidos três estádios: Destruição e fase inflamatória (1 a 3 dias), a reparação Fase (3 a 4 semanas) e a fase de remodelação (3 a 6 semanas) sendo que as duas últimas fases tendem a sobrepor-se (Baoge et al, 2012).
As lesões musculares muitas vezes levam há um longo tempo de imobilização e com isso, os anti-inflamatórios são largamente utilizados, podendo provocar o aumento nos números de fibras colágenas bem como a diminuição da quantidade de fibras musculares, contribuindo para alterações nas propriedades biomecânicas do músculo (Jarvinen, 2002).
A resposta inflamatória é considerada indispensável ao processo de reparação. Sem a inflamação, os tecidos jamais cicatrizariam. Os AINES são frequentemente usados na prática clínica em pacientes com traumas, fraturas e pós- operatório, pelo efeito analgésico e antipirético, sendo que a maioria pode inibir a função plaquetária. É aceito que essas drogas exerçam efeitos farmacológicos pela inibição da ciclooxigenase, que modula a síntese de alguns mediadores da inflamação, como as prostaglandinas (Souza et al, 2015).
O diclofenaco faz parte da categoria de anti-inflamatórios não esteroidais;
sabe-se que a sua principal ação é a capacidade em reduzir a atividade das isoformas da enzima ciclooxigenase (COX-1 e COX-2), e consequente inibição da síntese de prostaglandinas. (Sato et al., 1997; Tognini et al., 1998; Rodríguez et al., 2007).
Intervenções farmacológicas como drogas anti-inflamatórias não esteroidais, assim como injeções de drogas esteroidais, tem sido amplamente utilizada como terapias para o alívio da dor em curto prazo. Os efeitos em curto prazo destas drogas têm sido exaustivamente estudados em culturas de células, modelos animais e estudos clínicos em humanos, e seus mecanismos se encontram hoje, bem entendidos (Assendelf et al., 2003).
Os AINEs administrados topicamente são absorvidos lentamente e em pequenas quantidades na circulação sistêmica; eles possuem biodisponibilidade e concentração plasmática máxima geralmente inferiores a 5% e 15%, quando
comparados aos de administração oral equivalente. Em comparação à administração oral, a aplicação tópica apresenta concentrações relativamente elevadas de AINEs na derme e no tecido muscular as concentrações variam, porém, mostram-se ainda mais equivalentes que as de administração oral (Klinge & Sawyer, 2013; Jose, 2014).
A eficácia da absorção do diclofenaco aplicado topicamente depende da facilidade em transpor os diferentes tecidos da pele (Stanos, 2007), possuir um baixo peso molecular (<500 Daltons) e ter características tanto hidrofílica quanto lipofíclica para atravessar a camada do stratum corneum (Vaile, 1998).
Bjornal et al (2004) publicaram uma importante meta-analise no British Medical Journal, analisaram mais de 13.000 pacientes com relação a patologias inflamatórias crônicas e utilização de drogas anti-inflamatórias não esteroidais, incluindo drogas de última geração como os coxibs. Neste estudo, os autores demonstraram que em patologias inflamatórias de longa duração, drogas anti- inflamatórias apresentaram efeito ligeiramente superior ao placebo, e que este fato não suporta o uso de tais drogas nas referidas patologias, principalmente se levados em conta os efeitos adversos apresentados pelas drogas anti-inflamatórias. Este artigo suscitou grande polêmica na comunidade científica e não científica, a respeito de novas terapias que possam ser utilizadas em patologias inflamatórias de longa duração, assim como, a comprovação de sua eficácia terapêutica. Mais recentemente, Bjordal et al (2007) demonstraram surpreendentemente, em outra meta-análise de estudos clínicos randomizados, duplo-cegos e placebo-controle, que o único AINE que apresentava eficácia clinicamente relevante no alívio da dor na osteoartrite de joelho era o diclofenaco aplicado topicamente (Figura 1).
Figura 1 - Gráfico que demonstra que o diclofenaco foi clinicamente relevante no alívio da dor na osteoartrite de joelho dentres os AINES tópicos.
Figura 1: Bjordal JM, Klovning A, Ljunggren AE, Slørdal L. Short-term efficacy of pharmacotherapeutic interventions in osteoarthritic knee pain: A meta-analysis of randomised placebo-controlled trials: Eur J Pain. 2007 Feb;11 (2):125-38.
Os AINEs aplicados topicamente têm perfil de segurança superior às formulações orais, pois ocorre uma grande desvantagem do uso por via oral dos anti-inflamatórios, como o diclofenaco, que são os efeitos adversos graves como hemorragia gastrointestinal, ulceração gástrica e as implicações de doenças renais, esses efeitos adversos secundários à aplicação tópica de AINEs ocorrem em aproximadamente 10% a 15% dos pacientes e são, principalmente, de natureza cutânea (erupção cutânea e prurido no local da aplicação). O diclofenaco tópico atua na redução da inflamação através da inibição da isoenzima COX 2. Reações adversas gastrointestinais são raras com a aplicação tópica, em comparação à incidência de 15% com AINEs orais. Dos AINEs tópicos aprovados nos EUA e no Brasil, o diclofenaco gel demonstrou eficácia no controle da dor na Osteortrite do joelho (OA) do joelho. Há muito tempo os AINEs veem sendo utilizados para diminuir episódios de dor em condições de osteortrite do joelho e lesões dos tecidos moles.
(Banning, 2008; José, 2014). Em uma patologia como a DM, ficou ainda mais estabelecido segundo Petrov; Alawi e Grave (2012) a associação desta com o desequilíbrio na inibição parcial da síntese e libertação de fatores de crescimento angiogênicos, na ativação e/ou inibição de enzimas proteolíticas, redução das taxas de proliferação celular e aumento da apoptose. Esse impacto deletério da DM no metabolismo tem motivado a busca por terapias alternativas para controlar ou
minimizar seus efeitos na reparação tais como novos medicamentos e a laserterapia de baixa potência (Renno, 2014).
2.5 LASER DE BAIXA POTÊNCIA
A laserterapia de baixa potência (LBP) é um recurso terapêutico utilizado no tratamento de lesões músculoesqueléticas em curto prazo. Mesmo que seu mecanismo biológico de ação não tenha sido totalmente esclarecido, necessitando de uma investigação mais aprofundada envolvendo modelos animais e ensaios clínicos humanos randomizados (Alves et al, 2014). Contudo, a LBP tem sido amplamente utilizada na reabilitação clínica e diversos estudos estão mostrando a ação positiva do LBP na regeneração muscular (Vatansever, 2012; De Almeida, 2013; Santos, 2014).
A luz laser pode ser absorvida no ciclo respiratório por componentes fotorreceptores aumentando a produção de ATP mitocondrial. Considerando que a absorção de luz fornece energia para a célula e que essa energia é absorvida pelo citocromo C, na mitocôndria, a célula pode utilizar essa energia no ciclo respiratório para produzir ATP. Estes dados em conjunto, estão de acordo com a nossa proposta de fornecer à célula a quantidade ideal de energia que irá atuar num determinado espectro para produção de energia pela célula (Karu, 1999).
A luz laser possui um comprimento de onda único com algumas características especiais, como unidirecionalidade, coerência e monocromaticidade.
(Karu et al., 1998).
A Terapia Laser de Baixa Potência representa uma alternativa para o tratamento de lesões musculoesqueléticas, podendo apresentar efeitos inibitórios ou estimulatórios, dependendo dos parâmetros utilizados neste tratamento. Neste sentido, é comum a utilização do termo biomodulador para citar seus efeitos sobre tecidos biológicos. Os objetivos clínicos da utilização da Terapia Laser de Baixa Potência em situações de lesão muscular visam a redução de efeitos adversos do uso de drogas anti-inflamatórias, a diminuição do tempo de imobilização, e ainda, a inibição ou até mesmo a redução/aceleração da resolução do processo inflamatório bem como a reparação do tecido muscular, restabelecendo as características funcionais do tecido (Ramos, 2012).
Sua eficácia vai além da diminuição da dor, atuando na redução da inflamação após lesão, acelerando o processo de cicatrização dos tecidos moles e induzindo a angiogênese. Diversos tipos de laser vêm sendo testados com o objetivo de se estudar a facilitação da absorção e penetração de drogas através da SC de forma mais eficaz e sem causar danos teciduais como os Lasers de CO2, Nd: YAG, IPL (intensed pulsed light) e os diodos (Stumpp et al, 2005; Gomez 2008 e Liu 2010). No entanto, tais estudos não avaliam a biodisponibilidade plasmática dos fármacos utilizados.
Os lasers são classificados em alta e baixa potência; os primeiros geralmente aplicados para a remoção, corte e coagulação de tecidos, enquanto que os lasers de baixa potência são mais comumente aplicados em processos de reparação tecidual, tais como traumatismos musculares, articulares, nervosos, ósseos e cutâneos. Os efeitos fotobiológicos da radiação laser, convencionalmente, podem ser divididos em curto e longo prazo. As respostas em curto prazo são aquelas nas quais o efeito pode ser observado poucos segundos ou minutos após a irradiação. Já os efeitos observados em longo prazo são aqueles que ocorrem horas ou ainda dias após o final da irradiação e, usualmente, envolvem nova biossíntese celular, especialmente na fase proliferativa da inflamação (Andrade et al, 2014).
Entre outros benefícios resultantes da LBP podem ser citados o efeito analgésico em lesões ósseas, musculares e tendíneas agudas ou crônicas, vasodilatação e proliferação de micro vasos, com possível aumento da quantidade de oxigênio no tecido, proliferação epitelial, endotelial e fibroblástica, aumento da síntese de colágeno e da atividade fagocitária, levando a aceleração do processo de reparação, além da liberação de citocinas que irão reduzir a reação inflamatória. A resposta de bioestimulação depende diretamente do comprimento da onda, da densidade de energia (J/cm²), e da potência, além do tempo da aplicação. A penetração da radiação depende do comprimento de onda, da forma que, quanto maior o comprimento de onda maior será a sua penetração (Mickiley et al.,1988;
Villarroya-Aparicio, 1994).
Segundo Zanotti et al., doses excitatórias (até 8J/cm2) são indicadas quando o objetivo da intervenção inclui a potencialização da bomba sódio/ potássio; estímulo à produção de ATP; restabelecimento do potencial de membrana; aumento do metabolismo e proliferação celular. Conforme apresentado por Souza e Silva (2016) energias acima de 4 J estão associadas a redução da inflamação. Utilizando doses
de 1, 3, 6 e 9 J no tratamento de lesão muscular, Ramos et al. (2012) evidenciaram que ratos tratados com energia de 3 J apresentaram melhor evolução no aspecto funcional do músculo tibial anterior.
A LBP aplicada pré ou pós-lesão mostra-se eficaz sobre a reparação muscular, assim como na modulação do processo inflamatório, angiogênese, na remodelação do colágeno e na formação de novas fibras musculares. (Ribeiro et al, 2016).
A LBP incide sobre as reações não térmicas (atérmicas) da luz com o tecido ocasionando efeitos fotoquímicos (Yasukawa et al., 2007; Schaffer et al., 2000, Honmura, et al., 1993). Tais efeitos fotoquímicos ocorrem devido a presença de fotorreceptores especialmente sensíveis a determinados comprimentos de onda. A absorção desses fótons por biomoléculas intracelulares específicas produz estimulação ou inibição de funções biológicas como atividade enzimática por exemplo. Estas alterações determinarão mudanças fotodinâmicas em cadeias complexas e moléculas básicas de processos fisiológicos com conotações terapêuticas (Karu et al., 1987).
Acredita-se que a ação do LBP sobre o tecido está relacionada a possibilidade de inibir o aparecimento de fatores quimiotáticos nos estágios iniciais da inflamação (Campana et al., 1998, 1999); inibir a síntese das prostaglandinas (Sattayut et al., 2000; Vasseljen, 1992) além de inibir o esfíncter pré-capilar, através de mediadores químicos. Estudos adicionais sobre o efeito anti-inflamatório do laser de baixa potência ainda se fazem bastante necessários.
Estudos realizados em humanos confirmaram um fato que já havia sido relatado inúmeras vezes. Segundo Samoilova et al (2008), a irradiação com LBP foi capaz de aumentar em 32% após 2 minutos de irradiação, e em 45% após 20 minutos, o fluxo sanguíneo na microcirculação cutânea.
Nos últimos anos, inúmeros estudos clínicos randomizados, placebo-controle foram realizados, fazendo com que a LBP já seja considerada como alternativa terapêutica para várias doenças.
Recentemente, trabalhos experimentais e clínicos com a aplicação da LBP puderam caracterizar seu efeito em diversas situações como o aumento da absorção do diclofenaco em tecido musculoesquelético, menor tempo de resolução do processo inflamatório em lesões do tecido muscular, no retardo do processo de fadiga muscular, na recuperação do musculoesquelético em um menor tempo após
lesão por estiramento e por trauma, (de Paiva Carvalho et al., 2013; de Almeida et al., 2013; Leal Junior et al, 2009; Bjordal et al., 2008; Santos et al. 2014; Lopes- Martins et al., 2006 a e b; Lopes-Martins et al., 2005;).
Em trabalho caracterizando a lesão muscular em ratos diabéticos, de Godoi (2011) sugeriu que o DM é um estado pró-inflamatório, com persistente expressão de TNF-α e elevada expressão de miostatina. Observou ainda, em teste de caminhada, que a recuperação desses animais se apresenta retardada.
3 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho é avaliar o reparo muscular através dos aspectos histológicos e morfométricos, além da funcionalidade muscular, decorrente de lesão por contusão/trauma em ratos diabéticos após tratamento com a laserterapia, com diclofenaco e os tratamentos aplicados de forma conjunta.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos pesando aproximadamente 300g provenientes do biotério da Universidade Sagrado Coração - USC. Os animais foram mantidos em condições padrão; com temperatura (22-24ºC), umidade relativa (40- 60%), ciclo de 12 horas claro-escuro, com água e ração ad libitum. Os ratos foram randomizados e divididos em grupos de 6 animais.
A indução da DM foi realizada por meio da administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ), em dose única, na concentração de 50 mg/kg de peso corporal, diluída em tampão citrato 0,1M, pH 4,5 (Hebden et al., 1986; Ozdemir et al., 2005; Fernandes et al., 2010). Nos grupos controle foi administrado somente tampão citrato. Após 10 dias, as amostras de sangue foram colhidas através de punção caudal e a glicemia foi determinada através de glicosímetro (Medidor OneTouch® Ultra®, LifesCan, Johnson&Johnson). Considerou-se os animais diabéticos quando apresentado glicose acima de 220 mg/dL. (Babu e Srinivasan, 1999).
O experimento seguiu as recomendações das resoluções brasileiras sobre Bioética em Experimentos com Animais (Lei Federal nº. 11.794, de 08 de outubro de 2008, do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA). Foi aprovado, sob o registro nº 5686310315, pela Comissão de ética no uso de animais da Universidade do Sagrado Coração (CEUA-USC), reunião de 30/04/2015.
4.2 MODELO DE LESÃO MUSCULAR POR CONTUSÃO
Os ratos foram anestesiados com 75-100 mg/kg de cetamina (Dopalen;
Vetbrands, São Paulo, Brasil) e 10 mg/kg de xilazina (Anasedan; Vetbrands, São Paulo, Brasil). Todos os animais foram pesados no primeiro e último dia do experimento, para obtenção do peso corporal inicial e final.
O membro pélvico direito de cada animal foi posicionado com o joelho estendido e tornozelo em dorsiflexão 90º. Em seguida, um único trauma foi aplicado no músculo tibial anterior do membro pélvico, utilizando uma mini-guilhotina (figura 2), que compreende um bloco de peso de 200g, com uma ponta arredondada, que
foi deixado cair de uma altura de 20 cm, guiado por suportes (de Almeida et al., 2013).
Figura 2 - Miniguilhotina utilizada para realizar o trauma.
4.3 ESQUEMA DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Figura 3 – Divisão dos grupos experimentais.
Serão 6 grupos, com 36 animais, analisados em três tempos distintos (6, 12 e 24 horas). Grupo Hígido (Hi), Grupo diabético sem lesão (DM), Grupo Lesão diabéticos não tratados (DML), Grupo Lesão tratado com LBP (La), Grupo Lesão tratado com diclofenaco (Di), Grupo Lesão tratado com LBP e com diclofenaco (LaDi). As amostras do tecido muscular serão retiradas nos tempos: 06, 12 e 24 horas para as análises histológica, morfométrica após a avaliação funcional.
Totalizando 108 animais.
4.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA: MICROSCOPIA DE LUZ (ÓPTICA)
As amostras do tecido foram fixadas em formol 10% por um período de 72 horas. Posteriormente, as amostras foram desidratadas e submetidas a uma série gradativa de banhos de álcool, começando com 50% e progredindo até o álcool absoluto 100% (SYNTH). Em seguida os músculos foram diafanizados com Xilol por 4 horas (SYNTH) para impregnação (embebição) e inclusão em Paraplast ® das amostras. Em seguida, estas foram colocadas em recipientes de alumínio adequados, com Paraplast ® fundido por 4 horas. Após a impregnação, as amostras foram colocadas em um pequeno recipiente coberto com parafina fundida e deixadas para endurecer, formando um bloco contendo o tecido. Para a microtomia foram realizados cortes com 5 µm de espessura em micrótomo LEICA RM 2125 RT,
lavados e colocados em banho-maria. Uma vez precedido o preparo das amostras os cortes foram colocados em lâminas para serem corados, com o corante Hematoxilina-Eosina (H.E.). Após a coloração os cortes foram montados em lâminas permanentes para posterior análise ao microscópio óptico e fotografados através de sistema de microfotografia (Olympus System Microscope Model CX 41 – Olympus PM10SP Automatic Photomicrographic System). Após este protocolo foi realizado análise histológicas descritiva do músculo tibial anterior para os grupos sacrificados em 06, 12 e 24h. A captura das imagens foi realizada com auxílio de um microcomputador com software de captura e análise de imagem, acoplado a um microscópio óptico (Leica DMLS). Esta avaliação analisou os sinais típicos de lesão muscular normalmente observados como descontinuidade de acidofilia, rompimento de fibras, deslocamento nuclear para o centro da célula e desorganização celular.
4.5 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
A captura das imagens foi realizada com auxílio de um microcomputador, com software de captura e análise de imagem, acoplado a um microscópio óptico (Leica DMLS). Todas as imagens foram analisadas com auxílio do programa analisador de imagem Sigma Scan Pro 5.0.
Para análise dos músculos, foram mensuradas 220 fibras musculares, no local da lesão, por animal. As variáveis morfométricas estudadas foram: área e diâmetro mínimo da fibra muscular, nos tempos 06, 12 e 24 horas após a lesão.
Para a retirada do músculo tibial anterior, utilizados como amostras nas análises histológica e morfométrica, os animais foram anestesiados com cetamina/xilazina (75-100 e 10 mg/kg-1, respectivamente) e passaram por um procedimento cirúrgico. Sendo eutanasiados logo após esse procedimento, através de aprofundamento anestésico: Barbitúricos (Tiopental ou Barbital sódico)150mg/kg e Lidocaína (10mg/ml). Via IP.
4.6 AVALIAÇÃO FUNCIONAL
A avaliação funcional foi realizada utilizando a Walking track analysis, descrita por De Medinacelli, 1982. Nesta análise o animal foi colocado em um corredor de acrílico transparente com acesso a um ambiente escuro. Sob o corredor foi colocado
uma régua para calibração de medida (cm). As pegadas no assoalho foram registradas por uma filmadora, acoplada a um tripé, mantendo sempre a mesma distância do equipamento ao corredor de acrílico (Figura 4). As imagens foram analisadas através de um software de computador. Este procedimento foi repetido duas vezes com cada animal. Todos os ratos tiveram uma adaptação e exploração do local, bem como o registro da normalidade de cada animal, antes do procedimento de lesão.
As análises foram realizadas após o protocolo de contusão, antes do sacrifício nos tempos de 06, 12 e 24h. As seguintes medidas foram coletadas e analisadas através do software: 1) o espaço entre a segunda e a quarta falange distal (ITS intermediary toe spready); 2) o espaço entre a primeira e a quinta falange distal (TS toe spready) e 3) o espaço entre a borda proximal do pé e a terceira falange distal (PL print length). (Figura 4)
Após os valores encontrados nos testes de Walking Track foi realizado o cálculo do SFI (Sciatic Function Index), de acordo com a fórmula abaixo:
SFI = -38.3 x (EPL – NPL) + 109,5 x (ETS – NTS) + 13,3 x (EITS – NITS) – 8,8 NPL NTS NIT
As medidas serão identificadas pela letra E, para a pata em estudo, e pela letra N, para a pata normal. Para a interpretação dos resultados, serão subtraídas as médias pré lesão da pós lesão.
Os dados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico obedecendo ao índice de P<0,05 para todas as amostras.
Figura 4 - (A) Medição dos parâmetros numa pegada de um rato normal. (B) Face plantar do pé de um rato para ilustrar a correspondência anatômica dos parâmetros avaliados. PL = Comprimento da Pegada; TS; = Largura da Pegada; e ITS = Largura Intermédia da Pegada. (C) Teste Funcional. (D) Teste Funcional.
4.7 TERAPIA LASER DE BAIXA INTENSIDADE
Foi utilizado um laser de baixa potência do tipo Thera-lase (DMC®), (Figura 5), operando no comprimento de onda de 830 nm em modo contínuo, na energia de 3 Joules (Tabela 1).
A
B
C
D
C
Figura 5 - Equipamento Laser utilizado para irradiações dos animais.
4.7.1 Parâmetros do Laser de Baixa Potência
Tabela 1 - Parâmetros do equipamento de Laser de Baixa Potência (LBP).
Comprimento de onda (nm)
Densidade de Energia de saída (J/cm²))
Potência Efetiva (mW)
Tempo de Irradiação (s)
Diâmetro Feixe (cm2)
Área irradiada (cm²)
Densidade de potência efetiva (W/cm²)
Densidade de energia efetiva (J/cm²)
830 3 100 30 0,028 1 3.57 107.14
A irradiação com Laser foi realizada no modo de contato, em apenas um ponto na região média do músculo tibial anterior dos ratos, 1 hora após a indução da lesão muscular.
4.8 TERAPIA FARMACOLÓGICA (AINE): DICLOFENACO
Grupos tratados receberam diclofenaco, uma hora após a indução da lesão, na dose de 11.6 mg/g-1 (miligrama grama) topicamente, no ventre do músculo lesado (Carvalho et al., 2013). No grupo tratado com LBP e diclofenaco, conjuntamente, aplicou-se o laser no local da lesão, cinco minutos antes da aplicação do diclofenaco. Este protocolo foi realizado para os grupos 6, 12 e 24 horas.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados serão expressos como médias ± EPM e submetidos ao teste Shapiro-Wilk para verificação de normalidade. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente através do Programa Graph Pad Prisma 5, utilizando o teste de análise de variância (ANOVA), para as comparações entre os grupos, seguido da aplicação de pós-teste de Tukey para múltiplas comparações. Valores de p< 5%
foram considerados estatisticamente significantes.
5 RESULTADOS
5.1 GLICEMIA
Gráfico 1 - Análise sanguínea da glicemia.
Glicemia
Controle
Diabético 0
100 200 300 400 500
*
mg/dL
Fonte: Elaborado pelas autoras.
Podemos observar os dados relativos aos níveis glicêmicos dos grupos hígido e diabetes sem lesão após dez dias da administração de streptozotocina nos ratos diabéticos e administração de tampão nos ratos controle. Os dados representam a média ±EPM, n=6 grupo Hi e n=36 grupo DM (teste t-Student não pareado, p<0,0001 vs. D). A glicemia basal após o período de dez dias foi significativamente elevada nos ratos diabéticos (370 ± 29 mg/dL) quando comparados aos animais do grupo controle (102 ± 2,3 mg/dL) com p<0,0001.
5. 2 VARIAÇÃO DE MASSA CORPORAL.
O gráfico 2 demonstra a variação de massa corporal nos ratos hígido, dez dias após injeção da solução tampão, e nos ratos diabéticos, dez dias após a administração de streptozotocina. Inicialmente os animais apresentaram uma massa corporal média de 295g. Foi observado que os ratos diabéticos apresentaram perda significativa de massa corporal (-19 ± 5,4 g) quando comparados aos animais do grupo hígido (46 ± 4,2 g) com p<0,0001.
Gráfico 2 - VARIAÇÃO DE MASSA CORPORAL
Hígido Diabético
-40 -20 0 20 40
60
*
massa corporal (g)
Fonte: Elaborado pelas autoras.
5.3 AVALIAÇÃO FUNCIONAL
Gráfico 3 - Comparativo entre as diferenças das médias do índice funcional obtido no teste Walking Track com 6 horas:
6 horas
Hí
DM
DML La Di
LaDi -15
-10 -5 0
** **
#
Índice Funcional
Fonte: Elaborado pelas autoras.
O gráfico 3 demonstra o comparativo entre as diferenças das médias obtidas no teste do índice funcional do isquiático nos grupos (Hi, DM, DML, La, Di e LaDi), no período de 6 horas após protocolo de lesão por trauma. Observamos que o índice
Variação de massa corporal
funcional apresentou um aumento, estatisticamente significativo, gerando dificuldade de marcha dos animais de todos os grupos lesionados quando comparados ao grupo Hi (6,38 ± 0,78) e ao grupo DM (6,52 ± 0,49) com **p<0,01. O grupo Di (11,67
± 0,84) apresentou maior dificuldade de marcha quando comparado aos grupos DML (10,15 ± 0,86), La (10,23 ± 0,78) e LaDi (9,91 ± 0,47) com #p<0,05.
Gráfico 4 - Comparativo entre as diferenças das médias do índice funcional - 12 horas.
12 horas
Hí DM DM
L La Di
LaDi -15
-10 -5 0
*** ***
+ ++
Índice Funcional
O gráfico 4 demonstra o comparativo entre as diferenças das médias obtidas no teste do índice funcional do isquiático nos grupos (Hi, DM, DML, La, Di e LaDi), no período de 12 horas após protocolo de lesão por trauma. Observamos que o índice funcional apresentou um aumento, estatisticamente significativo, na dificuldade de marcha dos animais de todos os grupos lesionados quando comparados ao grupo Hi (6,05 ± 0,83) e ao grupo DM (6,89 ± 0,79) com ***p<0,001.
O grupo La (10,32 ± 0,80) apresentou menor dificuldade de marcha quando comparado aos grupos DML (11,48 ± 0,49) e Di (12,10 ± 1,10) com +p<0,05 e o grupo LaDi (9,25 ± 0,54) apresentou menor dificuldade de marcha quando comparados aos grupos DML (11,48 ± 0,49) e Di (12,10 ± 1,10) com ++p<0,01.
