UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

CARLOS CESAR DE ANTONI

OSTEONECROSE MEDICAMENTOSA, OSTEOMIELITE E OSTEORRADIONECROSE: ESTUDO

IMUNOISTOQUIMICO COMPARATIVO

BAURU

2018

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CARLOS CESAR DE ANTONI

OSTEONECROSE MEDICAMENTOSA, OSTEOMIELITE E OSTEORRADIONECROSE: ESTUDO

IMUNOISTOQUIMICO COMPARATIVO

Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia - Área de Concentração: Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial, sob orientação da Prof.ª Dra. Camila Lopes Cardoso.

BAURU

2018

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) de acordo com ISBD

De Antoni, Carlos Cesar D284o

Osteonecrose medicamentosa, osteomielite e osteorradionecrose: estudo imunoistoquímico comparativo / Carlos Cesar De Antoni. -- 2018.

37f. : il.

Orientadora: Prof.ª Dra. Camila Lopes Cardoso.

Tese (Doutorado em Odontologia - Área de Concentração:

Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial) - Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP

1. Osteonecrose medicamentosa dos maxilares. 2.

Bisfosfonatos. 3. Osteomielite. 4. Osteorradionecrose. I. Cardoso, Camila Lopes. II. Título.

Elaborado por Laudeceia Almeida de Melo Machado – CRB-8/8214

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CARLOS CESAR DEANTONI

OSTEONECROSE MEDICAMENTOSA, OSTEOMIELITE E OSTEORRADIONECROSE: ESTUDO IMUNOISTOQUIMICO

COMPARATIVO

Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia - Área de Concentração: Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial, sob orientação da Prof.ª Dra. Camila Lopes Cardoso.

Bauru, 25 de setembro de 2018.

Banca examinadora:

__________________________________

Prof.ª Dra. Camila Lopes Cardoso Universidade do Sagrado Coração

___________________________________

Prof.ª Dra. Andréia Aparecida da Silva Universidade do Sagrado Coração

____________________________________

Prof. Dr. Marcelo Salles Munerato Universidade do Sagrado Coração

_____________________________________

Prof. Dr. Gabriel Fiorelli Bernini Faculdade do Centro Oeste Paulista

____________________________________

Prof.ª Dra. Cláudia Cristina Biguetti Universidade Estadual Paulista

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Esta obra eu dedico a minha esposa Eloise Halluch, por ser esta mulher guerreira e pelo apoio de uma vida. Aos meus filhos Giancarlo e Carlos filho por serem tão especiais. Dedico também a minha orientadora do Mestrado e Doutorado Camila Lopes Cardoso, que me ensinou tudo sobre pesquisa, com um incrível conhecimento de nossa área e um ser humano admirada por todos, dedicada à odontologia e sua família.

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AGRADECIMENTO

Agradeço aos meus pais, por ter me direcionado para o bem, por me mostrar os valores da honestidade e nunca desistir da luta, mesmo quando os caminhos tornaram-se difíceis, muito obrigado.

Agradeço aos amigos que fiz durante o Mestrado e Doutorado, por compartilharem de todos os conhecimentos que nossos mestres nos ofereceram, nesta incrível jornada.

Agradeço a minha orientadora, professora Dra. Camila Lopes Cardoso, por todos os ensinamentos transmitidos com maestria e, que sabiamente Deus te direcionou como minha orientadora. Serei eternamente grato por tudo que fez por mim.

Agradeço aos professores do Doutorado, que sempre se empenharam para nos garantir o aprendizado.

Agradeço às doutoras Andreia Aparecida da Silva e Mariza Matzumoto.

Agradeço ao doutor Laurindo Moacir Sassi, pela participação e parceria através do Hospital Erasto Gaertner e pela amizade de mais de trinta anos.

A Maira Couto, do laboratório de histotécnica da USC, pela ajuda técnica desta tese.

Agradeço à Universidade do Sagrado Coração por me proporcionar um ambiente favorável de estrutura, o que certamente facilitou minha jornada no Doutorado.

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RESUMO

A osteonecrose medicamentosa associada ao uso de bisfosfonatos (OMMBF), osteomielite (OM) e osteorradionecrose (ORN) apresentam muita similaridade nos aspectos clínicos e radiográficos. No intuito de investigar os aspectos microscópicos de cada doença, e diante de poucos estudos comparativos, em especial análises imunohistoquimica, o objetivo deste trabalho foi comparar a imunoexpressão de marcadores relacionados ao ritmo da remodelação óssea e a vascularização entre as três doenças. Foram selecionados prontuários de pacientes que realizaram biópsia prévia com o diagnóstico das três doenças: OM, OMMBF e ORN. As lâminas de cada espécime foram submetidas às imunomarcações utilizando os anticorpos OPG, RANKL, VEGF e CD31. A análise semiquantitativa cega foi realizada por um examinador, sendo conferida por um supervisor. A amostra obtida foi de 34 espécimes oriundos de 34 pacientes, sendo 16 pacientes com OMMBF, 6 com OM crônica e 12 com ORN. Considerando o valor de p<0,05, não foi identificada diferença significante na expressão dos marcadores entre as doenças.

Através deste estudo, pode ser afirmado que considerando os marcadores relacionados ao ritmo de remodelação óssea e a vascularização, as doenças analisadas não se diferenciaram.

Palavras-Chave: Osteonecrose medicamentosa dos maxilares. Bisfosfonatos.

Osteomielite. Osteorradionecrose. VEGF. CD31. OPG.

RANKL.

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ABSTRACT

Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws (BRONJ), osteomyelitis (OM) and osteoradionecrosis (ORN) present a great deal of similarity in clinical and radiographic aspects. In order to investigate the microscopic aspects of each disease, and with few comparative studies, especially immunohistochemical analyzes, the objective of this study was to compare the immunoexpression of markers related to the rhythm of bone remodeling and vascularization among the three diseases. Patients were selected from patients who underwent previous biopsy with the diagnosis of the three diseases: OM, BRONJ and ORN. The slides of each specimen were subjected to immunoblots using the OPG, RANKL, VEGF and CD31 antibodies. Blind semiquantitative analysis was performed by an examiner, and was checked by a supervisor. The sample obtained was 34 specimens from 34 patients, 16 patients with BRONJ, 6 with chronic OM and 12 with ORN. Considering the value of p <0.05, no significant difference in the expression of the markers between the diseases was identified. Through this study, it can be affirmed that considering the markers related to the rhythm of bone remodeling and vascularization, the analyzed diseases were not differentiated.

Keywords: Medication-related osteonecrosis of the jaws. Bisphosphonates.

Osteomyelitis. Osteoradionecrosis. VEGF. CD31. OPG. RANKL.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CD31/PECAM-1 - Cluster de diferenciação 31 ou Molécula de adesão celular endotelial plaquetária

OM - Osteomielite

OMMBF - Osteonecrose medicamentosa dos maxilares associada ao uso de bisfosfonatos

OPG - Osteoprotegerina ORN - Osteorradionecrose

RANK-L - Ligante do receptor ativador kappa β VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...9

2 REVISÃO DA LITERATURA ...11

2.1 ESTUDOS COMPARATIVOS ENTRE A OSTEONECROSE MEDICAMENTOSA, OSTEOMIELITE E OSTEORRADIONECROSE ...11

2.2 PROTEÍNAS ALVO DO ESTUDO (VEGF, CD31, OPG E RANKL) ...16

2.2.1 VEGF ... 16

2.2.2 CD31 (Pecam-1) ... 17

2.2.3 OPG e RANK-L ... 18

3 OBJETIVOS ...20

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS ...21

4.1 PREPARO DOS ESPÉCIMES ...21

4.2 PROCEDIMENTOS PARA IMUNOMARCAÇÃO ...22

4.3 PROTOCOLO DE IMUNOMARCAÇÃO...22

4.4 ANÁLISE SEMIQUANTITATIVA ...23

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...23

5 RESULTADOS ...25

6 DISCUSSÃO ...28

7 CONCLUSÃO ...30

REFERÊNCIAS ...31

ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em seres humanos ...36

ANEXO B – Análise Estatística...37

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9 1 INTRODUÇÃO

Dentre as patologias ósseas dos maxilares, a osteonecrose medicamentosa associada ao bisfosfonato (OMMBF) tem sido alvo de discussões científicas na última década, sendo sua etiopatogenia considerada uma ampla linha de pesquisa atual. Considerando seus aspectos clínicos e radiográficos similares ao da Osteomielite (OM) e ao da Osteorradionecrose (ORN), muitas vezes indistinguíveis, alguns estudos levantaram hipóteses de variações nos achados microscópicos, os quais poderiam revelar alguma característica peculiar de cada doença contribuindo na sua etiopatogenia (HANSEN et al., 2006; MARX; TURSUN, 2012).

Ao analisar as três doenças (OMMBF, ORN, OM), o aspecto clínico comum é de uma necrose óssea exposta, ou não, ao meio bucal, mais frequente na mandíbula, podendo estar relacionada a sinais e sintomas flogísticos como eritema, supuração, dor, edema, que, dependendo dos mesmos, será um processo agudo ou crônico. Além disso, podem gerar complicações e sequelas como parestesias e fraturas mandibulares. Os aspectos imaginológicos comuns revelam áreas de osteólise difusa, podendo ter sequestros ósseos definidos, os quais são porções escleróticas de osso avascular, circundado por um tecido fibroso, o qual aparece radiolúcido numa radiografia. Um aspecto radiográfico peculiar na OMMBF é uma alteração mais generalizada de esclerose óssea e espessamento da lâmina dura envolvendo vários dentes (CARDOSO et al., 2017; ROCHA et al., 2012; TREISTER et al., 2009).

Entretanto, ao comparar a história das três doenças, a OM é comumente uma patologia óssea inflamatória quase sempre infectada e consequência de um abscesso dentoalveolar agudo não tratado adequadamente. Ela apresenta sinais e sintomas mais ou menos severos, dependendo do quadro agudo ou crônico (LEW;

WALDVOGEL, 2004; RADCLIFFE, 2015). Na OMMBF, o paciente apresenta na história médica pregressa, um relato de ter feito uso de bisfosfonatos, seja na forma oral ou intravenosa (RUGGIERO et al., 2014). E quando se trata de uma ORN, o paciente apresenta necessariamente uma história de radioterapia prévia em região de cabeça e pescoço (GUIMARÃES et al., 2013).

Sendo assim, a anamnese é soberana no processo de diagnóstico. Tão soberana, que muitas vezes o exame anatomopatológico é apenas complementar no processo de diagnóstico e não decisivo (DE ANTONI et al., 2018; SHUSTER et al.,

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10 2018).

No intuito de investigar microscopicamente as três doenças (OM, OMMBF e ORN), alguns autores encontraram similaridades e diferenças entre as mesmas (MARX; TURSUN, 2012). Na sequencia, um estudo muito semelhante, inspirado na metodologia dos referidos autores, foi realizado a fim de responder dois questionamentos: se haveria diferença microscópica entre as três doenças (OM, OMMBF e ORN) e se um patologista seria capaz de diagnosticá-las sem o conhecimento prévio das mesmas. Os autores concluíram que as três doenças são muito semelhantes do ponto de vista microscópico e incapazes de serem diferenciadas sem informações clínicas (DE ANTONI et al., 2018).

Considerando a ausência de estudos imunohistoquímicos comparativos entre as três doenças supracitadas, se justificou a proposta do presente estudo, o qual foi comparar o processo de remodelação óssea e a vascularização entre a OM, OMMBF e ORN.

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11 2 REVISÃO DA LITERATURA

Este capítulo se propõe a explanar o que alguns autores colocam a respeito dos assuntos principais que norteiam esta pesquisa. Espera-se que o conteúdo deste capítulo seja suficiente para embasar o estudo e auxiliar no capítulo destinado à análise e discussão dos resultados.

2.1 ESTUDOS COMPARATIVOS ENTRE A OSTEONECROSE

MEDICAMENTOSA, OSTEOMIELITE E OSTEORRADIONECROSE

A literatura é escassa considerando estudos comparativos entre pelo menos duas dessas doenças, mais raro ainda são as três doenças sendo comparadas, por isso a idéia do estudo. Ao realizar uma busca utilizando os termos “osteonecrosis AND osteomyelitis AND osteoradionecrosis”, foram obtidos 36 títulos de artigos, e analisando os resumos, foram selecionados somente os trabalhos que mencionam investigações comparativas entre pelo menos duas das doenças.

Hansen et al. (2006) realizaram um estudo histomorfológico comparando a ORN e a OMMBF. Os autores investigaram 8 pacientes com OMMBF e 10 com ORN. Histologicamente, o grupo da OMMBF revelou osso com áreas difusas e irregulares de necrose, enquanto na ORN, a área de osteonecrose foi maior e não tão difusamente distribuída. Em todos os casos, foram encontrados Actinomyces no tecido ósseo necrótico. Em cinco dos oito casos de OMMBF e em seis dos 10 casos ORN, numerosos osteoclastos puderam ser detectados perto de ossos vitais, aderidos ao osso, exibindo sinais de reabsorção óssea. A hiperplasia pseudo- epiteliomatosa (HP) foi revelada em cinco dos oito pacientes com OMMBF e em sete dos dez pacientes ORN. Desta forma, os autores concluíram que o Actinomyces está envolvido nas duas doenças. O aumento do número de osteoclastos sugere que ambos os fatores possam estar envolvidos nos mecanismos osteolíticos.

Bagan et al. (2009) realizaram um estudo clínico comparando a ORN e a OMMBF. O grupo 1 foi composto por 53 casos de OMMBF e o grupo 2 com 20 casos de ORN. Nos dois grupos foram avaliados o tamanho das áreas ósseas expostas, o número dessas áreas, a localização dos maxilares e a presença de complicações graves, como fístulas e fraturas mandibulares. O maior tamanho das áreas de osso exposto na cavidade bucal foi de 2,29 ± 2,02 (média ± desvio padrão)

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12 no grupo 1 e 2,7 ± 2,9 (média ± desvio padrão) no grupo 2 (p> 0,05). O número de áreas expostas foi 1,8 ± 1,34 (média ± desvio padrão) no grupo 1 e 1,2 ± 0,55 (média ± desvio padrão) no grupo 2 (p> 0,05). Houve mais fraturas no segundo grupo (20%) (p<0,05) e fístulas na pele (35%) (p <0,05). Houve mais pacientes no grupo 1(OMMBF) em que a extração dentária foi a etiologia local da necrose óssea (35 casos, 66,03%), enquanto no grupo 2, houve 8 (40%) (p <0,05). Na OMMBF não houve diferenças no tamanho maior das áreas expostas ao osso. A gravidade das complicações, como fraturas da mandíbula e fístulas cutâneas, foram maiores nas ORN, sendo neste grupo mais freqüentes as lesões espontâneas do que nas OMMBF, onde é mais freqüente após extrações dentárias.

Marx (1983) foi o pioneiro em comparar microscopicamente as três doenças:

osteomielite (OM), osteonecrose medicamentosa associada ao bisfosfonato (OMMBF) e osteorradionecrose (ORN) no intuito de esclarecer a etiopatogenia de cada doença. No estudo, foram investigados 23 casos de OM, 37 casos de OMMBF e 45 casos de ORN. Considerando as amostras de OM, todas revelaram osso necrótico. 91% dos espécimes apresentaram hiperemia, trombose e 33% de microorganismos. Os espécimes de OMMBF demonstraram osso necrótico e ausência de vasos sanguíneos e infiltrado inflamatório nos espaços medulares. Nas amostras de ORN, foi identificado osso necrótico evidenciado pelas lacunas osteocíticas vazias e ausência de osteoblastos na periferia. Foi observada notável ausência de células inflamatórias e também de vasos sanguíneos. Microorganismos foram observados na superfície do osso em 26 dos 45 espécimes (58%). A OM foi a única doença a demonstrar osteoclastos. Através deste estudo, a evidência histológica mostrou que a OM é causada pela infecção de um microorganismo que provoca intensa inflamação e trombose favorecendo um ambiente propício para a proliferação bacteriana. A OMMBF é vista como uma toxicidade não-inflamatória decorrente do bisfosfonato que causa a morte dos osteoclastos. Com relação à ORN, seria também uma condição causada pelos efeitos da radiação. Em conclusão, os autores atribuem os achados microscópicos ao mecanismo de cada doença (MARX; TURSUN, 2012).

Guimarães et al. (2013) descreveram o manejo de casos clínicos respectivamente de OM, OMMBF e ORN, propondo também comparar os aspectos clínico, radiográfico, microscópico, terapêutico e preventivo. Considerando os achados microscópicos de cada caso, na OM, a microscopia revelou a presença de

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13 tecido não viável associado a um infiltrado inflamatório com linfócitos. No caso de ORN, foi diagnosticado apenas com a história de radioterapia na região de cabeça e pescoço, portanto não mencionaram sobre o exame do sequestro ósseo removido.

Com relação ao terceiro caso, referente à OMMBF, consideraram os aspectos clínicos e história médica para fechar o diagnóstico, entretanto realizaram uma análise do material purulento, o qual foi submetido a exame de cultura e revelou a presença de Staphylococcus epidermidis. Os autores concluíram que as três doenças são muito semelhantes microscopicamente e consideraram crucial que o cirurgião dentista diagnostique corretamente para um adequado manejo e melhora do prognóstico. Os dentistas também desempenham um papel importante na prevenção de danos, fornecendo cuidados prévios à terapia cirúrgica com o objetivo de eliminar focos comprometedores ou infecciosos.

Carmagnola et al. (2013) analisaram as caraterísticas histológicas do tecido ósseo de pacientes com OMMBF e ORN. Dezesseis amostras de tecido ósseo de 14 pacientes com OMMBF e dois pacientes com ORN foram processadas para obter áreas descalcificadas ou não. As lâminas foram submetidas à análise histomorfométrica. As doenças avaliadas compartilharam semelhanças microscópicas como a perda da arquitetura óssea, ausência de um sistema Harvesiano e espaços medulares adequados, presença de porções de osso necrótico, raros osteoclastos, bactérias e infiltrado inflamatório. Os autores concluíram que as características microscópicas são bastante semelhantes às que representam a osteomielite. Apesar de não ser claro se a infecção é a causa ou consequência da exposição óssea, células inflamatórias, bactérias ou seus produtos podem ter um efeito lítico importante diretamente no tecido ósseo alterado pelos bifosfonatos.

Mitsimponas et al. (2014) compararam as diferenças microscópicas entre a ORN e OMMBF. Foram utilizadas 10 amostras de ORN, 10 de OMMBF e 10 de mandíbulas normais como controle. A análise foi utilizada através de duas colorações: Sirius red para o estudo da presença relativa dos tipos de colágeno I e III, e azul de toluidina para estudo da densidade óssea. A análise, Vermelho Verde Azul (RGB), dos espécimes corados com Sirius Red, identificou diferenças significativas entre os padrões cromáticos observados em espécimes ósseos de ORN quando comparado com as amostras do grupo controle e grupo da OMMBF.

Além disso, a qualidade óssea das amostras de OMMBF foi mais baixa quando

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14 comparada com a ORN e as amostras de osso normal. Em resumo, os resultados do estudo destacaram ainda mais as diferenças fisiopatológicas entre estas duas formas de necrose óssea. A ORN é dominada por fibrose e hiper-expressão de colágeno I, enquanto o mesmo não foi observado nos espécimes de OMMBF, que, por outro lado foram caracterizados por desvio do estado normal da arquitetura óssea. Os autores concluíram que as diferenças demonstradas na arquitetura óssea e no teor de colágeno entre as duas condições patológicas provavelmente refletem diferenças fisiopatológicas.

Gross et al. (2017) realizaram um estudo sobre o perfil osteoclástico da OMMBF, da ORN e OM. Usaram espécimes de mandíbula de 70 pacientes, sendo 30 de OMMBF, 15 de OM, 15 de ORN e 10 controles. Foram analisadas a quantidade de osteoclastos, morfologia e expressão de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) e proteína transmembrana específica de célula dendrítica (DC- STAMP). Os espécimes foram processados para coloração com hematoxilina e eosina (H&E), histoquímica (TRAP) e imuno-histoquímica (anti-DC-STAMP) e analisados por microscopia virtual. A quantidade, diâmetro e nuclearidade dos osteoclastos foram significativamente maiores nos espécimes de OMMBF quando comparados aos de OM, ORN e amostras de controle. A expressão do TRAP foi menor nos espécimes de OMMBF e ORN do que nos espécimes OM e controle. A expressão DC-STAMP de osteoclastos e células mononucleares foi significativamente maior nos espécimes de OMMBF e ORN, do que em OM e amostras de controle. A conclusão deste estudo indica que o perfil de osteoclastos da OMMBF é caracterizado pela inativação dos osteoclastos (baixa secreção / expressão de TRAP) e alta taxa de fusão célula-célula (alta expressão de DC- STAMP). Pela primeira vez, o presente estudo analisou a expressão de DC-STAMP em espécimes ósseos de maxila humana de rotina. Foram encontrados padrões de expressão semelhantes para o DC-STAMP nos espécimes de OMMBF e ORN, embora os osteoclastos hipernucleados e gigantes tenham sido encontrados apenas nos espécimes de OMMBF. Este achado indica que o surgimento desses osteoclastos alterados na OMMBF não pode ser atribuído a uma fusão célula-célula desencadeada por DC-STAMP aumentada. A caracterização incidental dos perfis osteoclásticos de OM e ORN revelou diferenças marcantes, que podem facilitar a diferenciação histopatológica entre OMMBF, ORN e OM. Uma diferenciação precisa é essencial porque as abordagens terapêuticas para essas doenças são um pouco

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15 diferentes.

De Antoni et al. (2018) realizaram um estudo no intuito de avaliar se existe diferença microscópica entre a osteomielite (OM), osteonecrose medicamentosa associada ao bisfosfonato (OMMBF), e osteorradionecrose (ORN). O estudo foi retrospectivo, com espécimes previamente submetidos à biópsia dos ossos maxilares, afetados pelas três doenças. Foram obtidos 6 espécimes de OM, 16 de OMMBF e 22 de ORN, totalizando 44 amostras. Dois patologistas examinaram os espécimes, sem o conhecimento do diagnóstico. Os aspectos microscópicos avaliados foram: tecido ósseo, infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos e a presença microorganismos. Além disso, os examinadores emitiram uma hipótese de diagnóstico de cada espécime. Considerando as estruturas avaliadas, houve total concordância entre os examinadores (Kappa=1). Apresentou diferença estatística significativa apenas a presença de canais vazios, a qual foi menos frequente na ORN (p=0,042) e a presença de neutrófilos, a qual foi bem inferior no grupo da OMMBF (p≤0,001) em uma análise aplicando-se o teste Kappa interexaminador

foi identificado que

não houve uma sugestão de diagnóstico concordante da doença presente entre os examinadores (Kappa=0,23). A partir das análises deste estudo, foi possível concluir que as doenças comparadas apresentaram muita semelhança microscópica, principalmente, com relação à presença de osso necrótico, inflamação e microorganismos. Além disso, não foi possível obter o diagnóstico das doenças avaliadas somente com a análise microscópica. As informações clínicas são fundamentais para o estabelecimento do seu diagnóstico final.

Shuster et al. (2018) seguindo a mesma proposta do estudo anterior, realizaram um estudo comparativo dos parâmetros histopatológicos da OM crônica/supurativa, OMM e ORN. Os autores examinaram a hipótese de que características histológicas distintas poderiam estar relacionadas a cada doença específica permitindo o diagnóstico final baseado apenas na avaliação microscópica.

Cento e dez amostras foram revisadas por dois examinadores de forma cega e, uma análise histomorfométrica semi-quantitativa foi realizada. Os resultados deste estudo não identificaram características microscópicas distintas em nenhuma das três entidades que poderiam ser usadas para diferenciá-las. Os parâmetros avaliados incluíram a presença ou ausência de osso necrótico, inflamação, formação óssea reativa, bactérias e osteoclastos. Não foram encontradas diferenças estatisticamente

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16 significantes entre os grupos para nenhum parâmetro. O osso necrótico foi comum a todos os três diagnósticos. Inflamação e formação óssea reativa estavam presentes em todos os três diagnósticos. A presença de bactérias foi uma característica proeminente em todos os casos. Os osteoclastos foram escassos na OMM e osteomielite, e inexistentes em ORN. Portanto, foi impossível chegar a um diagnóstico final específico baseado apenas em achados microscópicos. Os autores concluíram que o papel da análise microscópica é servir como um auxílio ao diagnóstico que deve ser complementado pela história clínica e achados imaginológicos do paciente.

2.2 PROTEÍNAS ALVO DO ESTUDO (VEGF, CD31, OPG E RANKL)

2.2.1 VEGF

O fator de crescimento endotelial vascular, o VEGF, é uma proteína importante no processo de angiogênese, que é a formação de novos vasos sanguíneos. Estudos in vitro demonstraram que o VEGF é capaz de estimular a divisão e migração de células endoteliais (KUMAR; ABBAS; ASTER, 2009). O VEGF também atua na vasodilatação, aumento de permeabilidade vascular, angiogênese de processos inflamatórios crônicos, cicatrização e carcinogênese. Além do seu papel relacionado aos vasos sanguíneos, atua na migração de macrofagos. O VEGF representa uma família de moléculas semelhantes codificadas por um único gene e constituídas por proteínas representadas por letras (VEGFA-F) (SUTO et al., 2005).

Nos seres humanos, se encontram alguns tipos de VEGF, como: VEGF-A, responsável pela angiogênese, quimiotaxia e vasodilatação, principalmente; VEGF- B, relacionada com a angiogênese embrionária; VEGF-C atuante na linfoangiogênese; VEGF-D associado com a vascularização dos bronquíolos e PIDF, relacionado a vasculogênese embrionária (SUTO et al., 2005).

A sua secreção é realizada por muitas células mesenquimais e do estroma.

Outros fatores também regulam a expressão do VEGF como fator de necrose tumoral alfa e beta, fator de crescimento epidermal e interleucinas (BOOCOCK et al., 1995; ITAKURA et al., 2000). Os membros da família VEGF desempenham a sua função nas células alvo através de três receptores com atividade intrínseca da tirosina quinase: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3, localizados nas células

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17 endoteliais e em outros tipos de células. O mais importante na angiogênese é o VEGFR-2.

O processo de hipóxia induz a produção de VEFG. O VEGF também apresenta um papel em funções fisiológicas do metabolismo ósseo, hematopoiese e reparo ósseo (CHINTALGATTU; NAIR; KATWA, 2003; FERRARA et al., 1996).

O VEGF tem sido alvo de muitos estudos que investigam a angiogênese, em tecidos onde ela é aumentada a sua expressão é alta. A sua importância foi demonstrada através de um estudo com camundongos, onde quando o gene do VEGF foi deletado, houve a interrupção da angiogênese embrionária (STOUFFER et al., 2001; STREET et al., 2002).

2.2.2 CD31 (Pecam-1)

A molécula de adesão celular endotelial plaquetária, a PECAM-1, reconhecida também como cluster de diferenciação 31 (CD31), é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene PECAM1, no cromossomo 17 (GUMINA et al., 1996). Ela foi descrita em meados de 1980 (OHTO, 1985). CD31 é encontrada na superfície de plaquetas, neutrófilos, monócitos e altamente expressa em junções intercelulares do endotélio, onde funciona como uma proteína adesiva de resposta ao estresse para manter a integridade da junção das células endoteliais e acelerar a restauração da barreira de permeabilidade vascular após uma injúria inflamatória (LERTKIATMONGKOL et al., 2016). A CD31 é expressa em todos os endotélios contínuos, incluindo os das artérias, arteríolas, vénulas, veias e capilares não sinusoidais, mas não é expressa no endotélio descontínuo (KISHIMOTO et al.,1997).

A proteína CD31 tem capacidade de contribuir para a integridade da junção das células endoteliais (LERTKIATMONGKOL et al., 2016). Existem muitos trabalhos elucidando detalhadamente o papel da PECAM-1 na biologia plaquetária, na transdução de sinal e sobre seu papel na migração e inflamação transendotelial de leucócitos (ILAN; MADRI, 2003; NEWMAN, P.; NEWMAN, D., 2003; PRIVRATSKY;

NEWMAN, D.; NEWMAN, P., 2010; WOODFIN; VOISIN; NOURSHARGH, 2007). Ela também é expressa em alguns tumores como linfomas e sarcoma de Kaposi (GUMINA et al., 1996). Recentemente também foi relatado que a proteína CD31 propicia ao endotélio vascular a capacidade de manter a integridade vascular durante a ativação inflamatória da via extrínseca da apoptose (CHEUNG et al.,

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18 2015).

Além das atividades descritas, esta proteína está envolvida no processo de angiogênse e sobrevivência cellular (DELISSER et al., 1997).

2.2.3 OPG e RANK-L

A remodelação óssea é um processo fisiológico causado por eventos sincronizados envolvendo as células: osteoblastos, osteoclastos, células precursoras e diversos sinalizadores secretados pelos mesmos. Basicamente, o osso é constantemente reabsorvido pelos osteoclastos e neoformado pelos osteoblastos. O sistema OPG/RANK/RANK-L controla esse processo de remodelação óssea, sendo o RANK-L e OPG proteínas protagonistas da regulação functional dos osteoclastos (YASUDA et al., 1998).

Os osteoblastos além de sua função de síntese e deposição de matriz óssea extracelular, também atuam na sinalização para que os osteoclastos, células que reabsorvem o tecido ósseo, possam ser diferenciadas e se tornem funcionais (ROBLING; CASTILLO; TURNER, 2006).

Os osteoclastos, células especializadas na reabsorção, se originam a partir de células do sistema hematopoiético do osso trabecular. São células multinucleadas, com bordas ora denteada na área onde causa a erosão óssea, ora especializada voltada para o tecido conjuntivo. Nesta membrana, existem receptores para hormônios e fatores de crescimento dentre eles o RANK, que compõe o controle da atividade osteoclástica (YASUDA et al., 1998).

Para cada segundo de atividade osteoclástica, fatores específicos devem estar presentes. Duas moléculas efetoras finais do processo de sinalização na atividade osteoclástica, produzidas pelos pré-osteoblastos são o RANK-L ou ligante da osteoprotegerina e a Osteoprotegerina (OPG). O RANK-L é um ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa β. É uma proteinna membro da superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral liberadas pelos pré-osteoblastos e osteoblastos principalmente (YASUDA et al., 1998). Apresenta alguns subtipos, porem o RANK-L apresenta melhor funcão (ODGREN et al., 2001).

A identificação dessas moléculas é relativamente recente (YASUDA et al., 1998). Autores estudando moleculas receptoras relacionadas ao TNF descobriram a OPG, expressa por vários órgãos, em especial pelos osteoblastos (TEITELBAUM;

(22)

19 ROSS, 2003).

Na sequencia, revelaram o ligante da OPG, conhecido como RANK-L. O RANK-L age diretamente na diferenciação dos macrofagos em osteoclastos. É responsável pela reabsorção óssea e osteoclastogênese. Já o OPG é um fator inibitório da osteoclastogênese, portanto atua como um antagonista do RANK-L e funciona se unindo ao receptor RANK, causando o bloqueio da ligação RANK/RANK-L e consequentemente inibindo a diferenciação dos precursores de osteoclastos em osteoclastos maduros (BOYCE; XING, 2008).

A OPG é secretada por muitos tipos de células, além dos osteoblastos, incluindo os do coração, rins, fígado e baço. Um estudo recente relata que as células B podem ser responsáveis por 64% da produção total de OPG da medula óssea e camundongos deficientes em células B são consistentemente osteoporóticas, sendo as células B a principal fonte de OPG na medula óssea de camundongos normais (BOYCE; XING, 2008). A maioria dos fatores que induzem a expressão de RANKL pelos osteoblastos também regulam a expressão de OPG. Embora haja alguns dados contraditórios, em geral, quando a expressão de RANKL é regulada positivamente, a expressão de OPG é regulada para baixo ou não induzida no mesmo grau que RANKL, de tal forma que a relação RANKL / OPG muda em favor da osteoclastogênese. Os números e atividades de osteoclastos podem aumentar se houver uma mudança na relação RANKL / OPG devido a um aumento na primeira ou a uma redução na segunda ou a uma mudança em ambas que leve a uma mudança na proporção em favor da RANKL.

O papel osteoprotetor da OPG em humanos tem sido apoiado por deleções parciais homozigóticas de OPG em pacientes com doença de Paget juvenil, um distúrbio autossômico recessivo no qual os indivíduos afetados têm aumento da remodelação óssea, osteopenia e fraturas.

(23)

20

3 OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho foi comparar através de marcadores imunohistoquímicos (VEGF, CD31, OPG e RANKL) a osteonecrose medicamentosa dos maxilares associada ao uso de bisfosfonatos (OMMBF), a osteomielite crônica (OM) e a osteorradionecrose (ORN) no intuito de responder os seguintes questionamentos específicos:

a) considerando o ritmo de remodelação óssea, existe diferença na expressão de anticorpos OPG e RANKL entre as três doenças?

b) considerando a vascularização, existe diferença na expressão de anticorpos VEGF e CD31 entre as três doenças?

(24)

21 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS

Inicialmente, o projeto, cujo estudo foi retrospectivo teve aprovação pelo CEP - Número do Parecer: 1.249.820 (ANEXO A). Foi realizada avaliação imunohistoquímica de lâminas obtidas de espécimes previamente submetidos à biópsia dos ossos maxilares acometidos por: osteomielite crônica (OM), osteonecrose medicamentosa associada ao uso de bisfosfonatos (OMMBF) e osteorradionecrose (ORN). A seleção da amostra foi realizada através de prontuários existentes no período de 2000 a 2017, oriundos de três instituições diferentes: Serviço de Estomatologia do Centro de Oncologia, do Hospital Santa Catarina, na cidade de São Paulo, banco de dados do serviço anatomopatológico da Universidade do Sagrado Coração, em Bauru e Hospital Erasto Gartner em Curitiba, Paraná.

Foram selecionados prontuários de pacientes que realizaram biópsia prévia com os seguintes diagnósticos: osteomielite crônica (OM) e osteonecrose medicamentosa associada ao uso de bisfosfonatos (OMMBF) e osteorradionecrose (ORN). Os seguintes critérios de inclusão foram utilizados para a seleção da amostra:

a) os critérios para o diagnóstico de OM foram: diagnóstico de OM, a ausência de radioterapia, o não uso de bisfosfonatos;

b) os critérios para o diagnóstico de OMMBF foram: diagnóstico de osteonecrose nos maxilares associada ao uso de um bisfosfonato e ausência de radioterapia de cabeça e pescoço (RUGGIERO et al., 2014);

c) os critérios para o diagnóstico de ORN foram: a presença de exposição óssea na maxila ou mandíbula, que persistiu por pelo menos 8 semanas em um paciente que recebeu, pelo menos, 6000 cGy de radioterapia local e que não usou bisfosfonatos (MARX, 1983).

4.1 PREPARO DOS ESPÉCIMES

Os processamentos histotécnico e imunohistoquímico foram realizados pela

(25)

22 técnica Maira Couto, da Universidade do Sagrado Coração. Os blocos de parafina de cada espécime foram submetidos a cortes seriados de 3 micra de espessura.

4.2 PROCEDIMENTOS PARA IMUNOMARCAÇÃO

A análise IHQ dos espécimes foi utilizada para avaliar a vascularização entre os grupos. Para tanto, foram utilizados os seguintes anticorpos primários:

a) VEGF: Rabbit anti-human VEGF (A-20): sc-152, Santa Cruz Biotechnology®, glicoproteína dimérica como estrutura homóloga ao PDGF que possui atividade mitogênica aparentemente só para células endoteliais;

b) CD31: Pecam-1 Antibody (M-20): sc-1506, Santa Cruz Biotechnology®, é uma IgG policlonal de cabra, também disponível como IgG de coelho. Utilizado para mapeamento de epítopo no terminal C de PECAM-1, recomendado para detecção de Pecam-1 de rato, camundongo e humano por WB origem IP, IF, IHC (P) e Elisa agarose, sc- 1506;

c) OPG: Anticorpo OPG (P-17): sc-21038, Santa Cruz Biotechnology®, conhecida como Osteoprotegerina, também conhecida como fator inibitório de osteoclastogênese ou fator de necrose tumoral membro da superfamília 11B (TNFRSF11B). Especificamente atua no metabolismo ósseo, aumentando a densidade mineral e volume ósseo;

d) RANKL: Santa Cruz Biotechnology®, (Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand,) é uma importante molécula constituinte do metabolismo ósseo. Se encontra na superfície da membrana dos osteoblastos, células do estroma e linfocitos T. Sua principal função é a ativação dos osteoclastos, células atuantes na reabsorção óssea.

4.3 PROTOCOLO DE IMUNOMARCAÇÃO

O protocolo de IHQ foi o estabelecido no laboratório da USC, baseado nas recomendações dos reagentes da Vector ImmPRESS Reagent Kit (Peroxidase), universal. As lâminas utilizadas foram obtidas silanizadas.

(26)

23 Para as reações imunohistoquímicas, foram preparadas lâminas silanizadas com espécimes na espessura de 3µm. As amostras foram desparafinizadas no xylol e reidratadas numa sequência de tratamento com etanol e água destilada. Após o tratamento inicial dos cortes com banhos de 15 minutos em xilol, banhos rápidos no álcool absoluto, álcool 95% e álcool 70% e, permanência da água corrente por 5 minutos, foi realizada a recuperação antigênica com tampão citrato, pH 6.0 e utilizando o método da Panela de vapor (steamer), por 40 minutos. Na sequência, se deu o bloqueio da peroxidase endógena, realizado com 4 banhos de peróxido de hidrogênio 3%, com duração de 05 minutos, seguida de lavagem em água corrente.

Após este procedimento, as lâminas foram pipetadas com 2,5% Normal Horse Serum por 20 minutos, seguida pela incubação dos anticorpos primários (com PBS BSA 1% de acordo com o título estabelecido) por uma hora. No próximo passo, se deu a lavagem em PBS por 5 minutos e a incubação por 30 minutos do Immpress Reagent e, novamente, lavagem dupla no PBS por 5 minutos. Por fim, a revelação se deu com o cromógeno DAB KIT DAKO pipetado sobre a amostra e deixado durante segundos até ser evidenciada uma cor acastanhada. As amostras foram imersas em água destilada por 2 minutos, 2 vezes. Na sequência, foi realizada a contracoloração com Hematoxicilina de Harris por 10 a 15 segundos, lavadas em água corrente, mantidas em água destilada e hidratadas com álcool 95% e 100% por 2 minutos cada, xilol 2 banhos de 15 minutos e colocação da lamínula.

4.4 ANÁLISE SEMIQUANTITATIVA

A imunomarcação dos anticorpos avaliados foi determinada pela análise semiquantitativa, baseada no trabalho dos autores Luvizuto et al. (2010), considerando os scores de “-” ao “+++” , sendo “-”: ausente de marcação; “+”: leve;

“++”: moderado; “+++”: intenso(células fortemente marcads). O estudo foi realizado de modo cego, ou seja, sem o avaliador saber qual estava sendo avaliado. A análise semiquantitativa cega foi realizada por um examinador, sendo conferida por um supervisor.

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os escores provenientes da análise semiquantitativa foram organizados em

(27)

24 tabela em formato Excel (Microsoft Office Excel, Redmond, WA, Estados Unidos).

Foi realizada análise estatística, aplicando o teste Kruskal-Walis (dados não paramétricos, variável qualitativa ordinal) para avaliar diferença estatística significativa na expressão de todos os marcadores entre os três grupos, com nível de significância de 5%, por meio do programa estatístico PAST, version 3.11 (HAMMER; HARPER; RYAN, 2001).

(28)

25 5 RESULTADOS

Considerando os critérios de inclusão do presente estudo, a amostra obtida foi de 34 espécimes oriundos de 34 pacientes, sendo 16 pacientes com OMMBF, 6 com OM crônica e 12 com ORN. Abaixo se encontram os resultados da análise semiquantitativa de cada amostra (Tabela 1). Além disso, a Tabela 2 ilustra a porcentagem de imunomarcação de cada marcador por cada doença.

Considerando o valor de p<0,05, não foi identificada diferença significativa na expressão dos marcadores entre as doenças (Tabelas 1 e 2).

(29)

26 Tabela 1 - Relação dos espécimes avaliados de cada doença e o seu score

considerado na análise semiquantitativa. Imunomarcação ausente (-);

leve (+); moderada (++) e intensa (+++)

Amostra DOENÇA MARCADORES

VEGF CD31 OPG RANK-L

1 OMMBF - - - -

2 OMMBF ++ ++ + -

3 OMMBF - - - -

4 OMMBF - - - -

5 OMMBF - - - -

6 OMMBF + + - -

7 OMMBF - - - -

8 OMMBF - - - -

9 OMMBF - - - -

10 OMMBF - - + -

11 OMMBF - - - +

12 OMMBF - - + -

13 OMMBF - - - ++

14 OMMBF - - - -

15 OMMBF - - - +

16 OMMBF + + - -

17 OM - - + -

18 OM - - - -

19 OM - - - -

20 OM - - - +

21 OM - - - -

22 OM ++ ++ - ++

23 ORN - - - -

24 ORN ++ + - -

25 ORN + + + +

26 ORN - - - -

27 ORN - - - -

28 ORN - - - -

29 ORN - - - -

30 ORN - - - -

31 ORN - - -

32 ORN - - - -

33 ORN - - - -

34 ORN - - - -

Valor de p* 0,99 0,98 0,74 0,39

Fonte: Elaborada pelo autor.

Nota:* Teste Kruskal-Wallis.

(30)

27 Tabela 2 - Porcentagem dos resultados encontrados na análise semiquantitativa.

Imunomarcação ausente (-), leve (+) e moderada (++)

Doença Marcadores

VEGF CD31 OPG RANK-L

OMMBF 81,25% (-)

12,5% (+) 6,25% (++)

81,25% (-)

12,5% (+) 6,25% (++)

81,25% (-) 18,75% (+)

81,25% (-)

12,5% (+) 6,25% (++)

OM 83,3% (-)

16,6% (++)

83,3% (-) 16,6% (++)

83,33% (-) 16,66% (++)

66,67% (-)

16,66% (+) 16,66% (++)

ORN 83,33% (-)

8,33% (+) 8,33% (+)

83,33%(-) 16,66% (+)

91,67% (-) 8,33% (+)

Valor de p* 0,96 0,97 1 0,73

Fonte: Elaborada pelo autor.

Nota: * Teste Kruskal-Wallis.

(31)

28 6 DISCUSSÃO

O presente estudo segue uma linha de pesquisa sobre osteonecroses e, mais especificamente, dá sequencia ao trabalho de De Antoni et al. (2018), o qual avaliou as mesmas amostras deste estudo através da microscopia em espécimes corados pela técnica de hematoxilina e eosina. O autor investigou as três doenças (OM, OMMBF, ORN) considerando as variáveis: tecido ósseo, infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos e a presença microorganismos. Além disso, os examinadores emitiram uma hipótese de diagnóstico de cada espécime. Considerando as estruturas avaliadas, houve total concordância entre os examinadores (Kappa=1).

Apresentaram diferença estatística significativa apenas a presença de canais vazios, a qual foi menos frequente na ORN (p=0,042) e a presença de neutrófilos, a qual foi bem inferior no grupo da OMMBF (p≤0,001). Não houve uma sugestão de diagnóstico concordante da doença presente entre os examinadores (Kappa=0,23).

A partir das análises deste estudo, foi possível concluir que as doenças comparadas apresentaram muita semelhança microscópica, principalmente, com relação à presença de osso necrótico, inflamação e microorganismos. Além disso, não foi possível obter o diagnóstico das doenças avaliadas somente com a análise microscópica.

No intuito de detalhar melhor a similaridade entre as doenças supracitadas, e considerando que não foi encontrado trabalho comparativo entre as mesmas utilizando anticorpos de vascularização e remodelação óssea, é que se deu a justificativa deste estudo. Quando as amostras foram comparadas, não houve diferença significativa na expressão dos marcadores, ou seja, houve muita similaridade entre os tecidos avaliados, corroborando com outros trabalhos que compararam as três doenças (DE ANTONI et al., 2018; MARX; TURSUN, 2012).

Os anticorpos utilizados para avaliar a vascularização foram para as proteínas VEGF e CD31, pois as mesmas apresentam papel importante na angiogênese. A utilização dos mesmos, no presente estudo, teve o intuito de revelar se haveria quantidade diferente de vasos e células endoteliais, respectivamente entre as doenças. Raras amostras revelaram algum score positivo para os marcadores e, quando houve marcação, houve coincidência entre ambos os marcadores na mesma amostra. A ausência de marcação foi bem importante nas três doenças, fato característico que acompanha o tecido ósseo necrótico.

(32)

29 A diminuição de vascularização no tecido ósseo e tecidos moles são esperados na OMMBF. Marx e Tursun (2012) encontraram canais vazios e ausência total de vasos sanguíneos em 100% das amostras de OMMBF. As amostras de osteomielite revelaram mais vasos sanguíneos quando comparadas às de OMMBF, porém não houve diferença estatística significativa. Em contrapartida, no presente estudo, apenas uma amostra de OM revelou marcação moderada em áreas de tecido mole, enquanto três amostras de OMMBF também demonstraram, sendo duas com leve marcação e outra com moderada. Somente uma amostra revelou uma moderada expressão, entretanto, vale ressaltar que o número de amostras de OM foi quase dois terços menores quando comparada com as de OMMBF.

Quando os sinalizadores OPG e RANK-L foram avaliados, a ausência da expressão dos mesmos foi marcante na maioria da amostra avaliada. Além disso, não revelou diferença significativa entre as três doenças. Não foi encontrado estudo que compara a expressão dos mesmos entre as três doenças.

É importante considerar que os espécimes obtidos neste estudo são provenientes de diferentes Instituições e, consequentemente, o perfil de pacientes bem como o cirurgião-dentista que realizou a biópsia não são padronizados. O osso necrótico é uma característica padrão constante nas doenças investigadas.

Entretanto, dependendo dos fatores como o tempo que as necroses ósseas permanecem expostas, infectadas ou não, se foi utilizado antibiótico, dentre outros fatores como manipulação cirúrgica, podem gerar alguma alteração microscópica mais ou menos evidente. Independente do conhecimento destes fatores na amostra avaliada, a presença de osso não vital e os sinais de uma afecção crônica foram comuns em todas as amostras deste estudo.

Considerando a metodologia de análise, a semiquantitativa foi eleita, principalmente em decorrência de alterações dimensionais entre as amostras que dificultavam uma análise quantitativa, pois o tamanho das mesmas era bem variável.

Além disso, algumas amostras apresentaram porções de tecido mole na lâmina (LUVIZUTO et al., 2010).

Embora este estudo tenha poucas amostras, limitações discutidas acima, os resultados corroboram com outras análises, ou seja, as três doenças além de apresentarem sinais e sintomas clínicos e radiográficos comuns, também carregam semelhança microscópica, sendo fundamental a história da doença atual no processo de diagnóstico.

(33)

30

7 CONCLUSÃO

Através deste estudo, pode ser afirmado que, considerando os marcadores relacionados ao ritmo de remodelação óssea e vascularização, as doenças analisadas não se diferenciaram.

(34)

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Acesso em: 13 maio 2017.

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36 ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em seres humanos

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37 ANEXO B – Análise Estatística