TÍTULO: ESTUDO DA MODULAÇÃO DO STRESS OXIDATIVO EM LINHAGEM DE MACRÓFAGOS J774A.1 INDUZIDOS POR ISOLADOS DE LEISHMANIA (L.) INFANTUM CHAGASI OBTIDOS DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE VISCERAL QUE APRESENTARAM DIFERENTES RESPOSTAS AO TRATAMENTO COM A MILTEFOSINA
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DO ESPÍRITO SANTO INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): ADEILTON PEREIRA DA SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JULIANA BRAMBILLA CARNIELLI TRINDADE, RODRIGO PRATTE SANTOS ORIENTADOR(ES):
1. RESUMO
A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença sistêmica, causada por protozoário do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie Leishmania (L.) chagasi. O tratamento para LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais pentavalentes, pentamidina, anfotericina B, e a miltefosina. A miltefosina é a primeira droga oral registrada para o tratamento das leishmanioses e vem sido utilizada com sucesso na Índia para o tratamento de LV. Contudo, o ensaio clínico realizado no Brasil observou apenas 60% de eficácia da miltefosina no tratamento da LV. Um estudo proteômico prévio, conduzido por nosso grupo de pesquisa, mostrou que um isolado de L. (L.) chagasi tolerante à miltefosina exibiu expressão aumentada de proteínas associadas com a homeostase do sistema redox, resposta ao stress e proteção à morte celular programada. Nesse contexto, o presente estudo tem como objetivo caracterizar o efeito modulador de isolados de L. (L.) chagasi, obtidos de pacientes com leishmaniose visceral que apresentaram diferentes respostas ao tratamento com a miltefosina, na homeostase redox da linhagem de macrófagos J774A.1, visando contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância natural do parasita à miltefosina.
2. INTRODUÇÃO
A LV é uma doença sistêmica causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani (Laison e Shaw, 1987), o qual engloba a espécie Leishmania (L.) chagasi (Cunha e Chagas, 1937), agente etiológico de uma zoonose nas Américas (Bern et al., 2008), recentemente considerada por alguns autores sinonímia da espécie L. (L.) infantum (Lukes et al., 2007). A LV é endêmica em 65 países, com uma estimativa de 500.000 novos casos por ano. Brasil, Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Etiópia apresentam os maiores índices epidemiológicos, que em conjunto perfazem 90% dos casos (WHO, 2010).
Um dos maiores avanços na pesquisa de drogas com atividade
anti-Leishmania foi à descoberta de uma droga oral efetiva, a miltefosina.
Contudo, o mecanismo de ação anti-Leishmania da miltefosina a nível molecular é pouco conhecido. A elucidação dos mecanismos de resistência utilizando linhagens experimentais resistentes a esta droga tem mostrado que o acúmulo intracelular da droga é um pré-requisito para a ação da miltefosina (Perez-Victoria, 2006). Além disso, evidências experimentais demonstram que a miltefosina interfere em diferentes níveis da biossíntese de lipídios (Lux et al., 2000; Lira et al., 2001), provoca danos à membrana flagelar
(Santa-Rita et al., 2000), inibe a enzima citocromo c oxidase (Luque-Ortega e Rivas, 2007) e induz a morte celular programada em Leishmania spp. (Paris et al., 2004; Verma e Dey, 2004).
Diferenças na sensibilidade à miltefosina entre espécies de Leishmania clinicamente relevantes tem sido reportadas. Na Índia, foi observada cura clínica e parasitológica em 94% dos casos de LV causados por L. (L.)
donovani (SUNDAR et al., 2002). Contudo, cerca de 40% dos pacientes
avaliados no Brasil, em um ensaio clínico conduzido por nosso grupo de pesquisa, apresentou recidiva após o tratamento com a miltefosina. A caracterização do fenótipo in vitro de susceptibilidade à miltefosina desses isolados de L. (L.) chagasi mostrou que a falha terapêutica está associada com tolerância natural à miltefosina (MONTI-ROCHA, 2012).
A caracterização de linhagens experimentais resistentes à miltefosina tem associado o fenótipo de resistência com: (i) redução no acúmulo intracelular da miltefosina no parasita, (VICTORIA et al., 2001; PEREZ-VICTORIA et al., 2006); (ii) alteração da composição lipídica da membrana do parasita (RAKOTOMANGA et al., 2005); (iii) e susceptibilidade reduzida à morte celular programada mediada por droga e maior habilidade de controlar a homeostase redox na presença da droga (VERGNES et al., 2007; DAS et
al., 2013).
Considerando a importância epidemiológica e médica da leishmaniose visceral e a ausência de novas drogas, o conhecimento sobre as bases moleculares da falência do tratamento e o desenvolvimento de novas ferramentas para detecção desse fenômeno podem contribuir para o uso racional da miltefosina e para traçar novas estratégias terapêuticas para o seu uso no tratamento da LV.
3. OBJETIVO GERAL
Analisar o efeito modulador de isolados de L. (L.) chagasi, obtidos de pacientes com leishmaniose visceral que apresentaram diferentes respostas ao tratamento com a miltefosina, na homeostase redox da linhagem de macrófagos J774A.1, visando contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância natural do parasita à miltefosina.
4. METODOLOGIA
Os isolados de L. (L.) chagasi foram obtidos de pacientes com LV que participaram do ensaio clínico para avaliar a eficácia da miltefosina no tratamento da LV no Brasil. O efeito modulador dos isolados de L. (L.)
chagasi na homeostase redox da linhagem J774.1 será determinada 24 horas
quantificação de Espécies reativas de oxigênio e dosagem de oxido nítrico, de acordo com Faria e colaboradores (2017) e Cabral-Piccin (2016).
5. RESULTADOS PRELIMINARES
Em um estudo proteômico prévio, o nosso grupo de pesquisa verificou que isolado de L. (L.) chagasi obtido de paciente que exibiu falha ao tratamento apresentou expressão aumentada de proteína envolvida na homeostase do sistema redox, resposta ao stress e proteção à morte celular programada. Nesse contexto, o presente estudo irá verificar se isolados de L. (L.) chagasi obtidos de pacientes que apresentaram falha terapêutica apresentam maior habilidade de modular negativamente a geração de ROS e NO em macrófagos J774A.1, quando comparados com isolados obtidos de pacientes que evoluíram para cura clínica.
6- FONTES CONSULTADAS
Bern, C., Maguire, J. H. e Alvar, J. Complexities of assessing the disease burden attributable to leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis, v.2, n.10, p.e313. 2008.
Cabral-Piccin MP, Guillermo LV, Vellozo NS, Filardy AA, PereiraMarques ST, Rigoni TS, et al. Apoptotic CD8 T-lymphocytes disable macrophage-mediated immunity to Trypanosoma cruzi infection. Cell death & disease. 2016.
Cunha, A. M. e Chagas, E. Nova espécie de protozoário do gênero
Leishmania patogênico para o homem, Leishmania chagasi. O Hospital,
v.11, p.3-9. 1937.
Das, M.; Saudagar, P.; Sundar, S.; Dubey, V. K. Miltefosine-unresponsive
Leishmania donovani has a greater ability than miltefosine-responsive L. donovani to resist reactive oxygen species. The FEBS Journal, v. 280, n. 19,
p. 4807–4815, 2013.
Faria, R. P., Damasceno; J. D., Carvalho, S. F. G.; Mottram, C. J. Effects of Miltefosine on Leishmania chagasi Cellular Oxidative Stress Dynamics: Uncovering Natural Miltefosine Resistance Process. Núcleo de Doenças Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, p. 40-43, 2017. Laison, R. e Shaw, J. J. Evolution, classification and geographical distribution. The Leishmaniasis in Biology and Medicine. London. 1: 1-120 p. 1987. Lukes, J., Mauricio, I. L., Schonian, G., Dujardin, J. C., Soteriadou, K., Dedet, J. P., Kuhls, K., Tintaya, K. W., Jirku, M., Chocholova, E., Haralambous, C., Pratlong, F., Obornik, M., Horak, A., Ayala, F. J. e Miles, M. A. Evolutionary and geographical history of the Leishmania donovani complex with a revision of current taxonomy. Proc Natl Acad Sci U S A, v.104, n.22, p.9375-80. 2007.
Luque-Ortega, J. R. e Rivas, L. Miltefosine (hexadecylphosphocholine) inhibits cytochrome c oxidase in Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother, v.51, n.4, p.1327-32. 2007.
Monti-Rocha, R. Correlação entre sensibilidade in vitro de isolados
clínicos de Leishmania chagasi à miltefosina e resposta ao tratamento. Núcleo de Doenças Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, p. 77, 2012.
Paris, C., Loiseau, P. M., Bories, C. e Breard, J. Miltefosine induces apoptosis-like death in Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother, v.48, n.3, p.852-9. 2004.
Perez-Victoria, F. J., Sanchez-Canete, M. P., Castanys, S. e Gamarro, F. Phospholipid translocation and miltefosine potency require both L. donovani miltefosine transporter and the new protein LdRos3 in Leishmania parasites. J Biol Chem, v.281, n.33, p.23766-75. 2006.
Perez-Victoria, J. M., Perez-Victoria, F. J., Parodi-Talice, A., Jimenez, I. A., Ravelo, A. G., Castanys, S. e Gamarro, F. Alkyl-lysophospholipid resistance in multidrug-resistant Leishmania tropica and chemosensitization by a novel P-glycoprotein-like transporter modulator. Antimicrob Agents Chemother, v.45, n.9, p.2468-74. 2001.
Rakotomanga, M., Saint-Pierre-Chazalet, M. e Loiseau, P. M. Alteration of fatty acid and sterol metabolism in miltefosine-resistant Leishmania donovani
promastigotes and consequences for drug-membrane interactions.
Antimicrob Agents Chemother, v.49, n.7, p.2677-86. 2005.
Santa-Rita, R. M., Santos Barbosa, H., Meirelles, M. N. e De Castro, S. L. Effect of the alkyl-lysophospholipids on the proliferation and differentiation of
Trypanosoma cruzi. Acta Trop, v.75, n.2, p.219-28. 2000.
Sundar, S., Jha, T. K., Thakur, C. P., Engel, J., Sindermann, H., Fischer, C., Junge, K., Bryceson, A. e Berman, J. Oral miltefosine for Indian visceral leishmaniasis. N Engl J Med, v.347, n.22, p.1739-46. 2002.
Vergnes, B., Gourbal, B., Girard, I., Sundar, S., Drummelsmith, J. e Ouellette, M. A proteomics screen implicates HSP83 and a small kinetoplastid calpain-related protein in drug resistance in Leishmania donovani clinical field isolates by modulating drug-induced programmed cell death. Mol Cell Proteomics, v.6, n.1, p.88-101. 2007.
Verma, N. K. e Dey, C. S. Possible mechanism of miltefosine-mediated death of Leishmania donovani. Antimicrob Agents Chemother, v.48, n.8, p.3010-5. 2004.
WHO. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser, n.949, p.xii-xiii, 1-186, back cover. 2010.
