R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i le i r a d e M e d i c i n a T r o p ic a l 2 3 ( 3 ) : 1 8 7 - 1 8 9 , ju l - s e t , 1 9 9 0
R E SU M O D E T E SE
C A R D IT E E X PE R IM E N T A L D O CO BA IO PE L A C E PA Y D O
T R Y P A N O S O M A C R U Z I .
C O R R E LA ÇÃ O E N T R E A H IST O PA T O L O G IA E A P R E S E N Ç A
D E A N T ÍG E N O S PA R A SIT Á R IO S ID E N T IF IC A D O S PO R IM U N O F L U O R Ê SC Ê N C IA
IN D IR E T A .
A cardite chagásica experimental foi reprodu zida em 15 cobaios adultos. C ada cobaio foi inoculado com um milhão de tripomastigotas contidos em 0,5 ml de um “ pool” de sangue citratado de camundongos infectados com a cepa Y do T. c r u z i. Os animais foram divididos em 4 grupos e sacrificados 1 mês (Grupo 1-5 cobaios), 2 meses (G rupo 2-2 cobaios), 2 meses e meio (G rupo 3-3 cobaios) e 3 meses e meio (Grupo 4- 5 cobaios), após a inoculação. Para cada grupo, foi utilizado, como controle, 1 cobaio adulto, não infec tado, mantido nas mesmas condições ambientais.
Os cobaios foram sangrados semanalmente para a verificação da parasitemia e realização de hemaglutinação e imunofluorescência indiretas para a avaliação da anticorpogênese anti-T. c r u z i.
A histopatologia do coração dos animais infec tados foi correlacionada com a presença de antígenos parasitários do T. c r u z i nas lesões. Os antígenos foram identificados através de imunofluorescência indireta, em cortes obtidos pela técnica de Sainte-Marie. P ara a reação foram utilizados soros humanos padrões, posi tivo e negativo, para a doença de Chagas. A presença de fluorescência foi considerada significante quando observada apenas no corte tratado com o soro padrão positivo.
Como reações testemunhas, foram realizadas: reação de imunofluorescência indireta nos corações dos cobaios-controles, que foi negativa; reação de imunofluorescência indireta, com soro padrão positivo absorvido com T. c r u z i, nos corações dos cobaios infectados, que foi negativa; reação de imunofluores- ciência direta, com o conjugado anti-globulina humana, nos corações dos cobaios infectados e controles, que também foi negativa. A preservação da fração antigê- nica protéica do T. c r u z i, com o emprego da técnica de Sainte-Marie foi demonstrada na pele, pela mesma técnica usada no coração, através da injeção do antígeno nos cobaios do Grupo 4, por via intradér- mica, uma semana antes do sacrifício.
E X P E R IM E N T A L C A R D IT IS IN D U C E D BY T R Y P A N O S O M A
C R U Z I(Y ST R A IN ) IN G U IN E A PIG S.
C O R R E L A T IO N B E T W E E N H IST O PA T H O L O G Y A N D T H E PR E S E N C E O F T. C R U Z I A N T IG E N S
ID E N T IF IE D BY IN D IR E C T IM M U N O FL U O R E SC E N C E .
Experimental chagasic carditis was induced in 15 adult guinéa pigs by subcutaneous inocula tion of 1 x
106
trypomastigotes contained in 0.5 ml of a pool of blood samples of mice infected with T. c r u z i ( Y strain). The animals were sacrificed after 1 month (G roup 1-5 guinea pigs), 2 months (G roup 2-2 guinea pigs), 2.5 months (G roup 3-3 guinea pigs) and 3.5 months (G roup 4-5 guinea pigs) after inoculation. For each test group, 1 non-infected guinea pig was used as control.The animals were bled weekly for evaluation of parasitemia and levels of anti-T . c r u z i antibodies, by hemagglutination and indirect immunofluorescence.
The histopathology findings of the carditis was correlated with the presence of T. c r u z i antigens in the lesions. The antigens were detected by indirect immunofluorescence according to Sainte-Marie’s technique, using a positive and a negative reference human serum to Chagas’ disease. A finding was considered specific when observed only in the section stained with the positive serum.
Other data were taken as evidence of specificity of the immunofluorescent findings: i) absence of fluorescence in the hearts of the control guinea pigs; ii) the fluorescence in the hearts of infected guinea pigs stained with the positive serum was abolished with the absorption of the serum with trypomastigotes of T. c r u z i (Y strain); iii) absence of fluorescence in the heart o f infected guinea pigs stained only with the fluorescein conjugated anti-human immunoglobulin. To check whether Sainte-Marie’s technique pre served T. C r u z i antigens, the guinea pigs from Group 4 were intradermally inoculated with 12 pig of the antigen used in the hemagglutination test one week prior to sacrifice. A t the sacrifice, punch biopsies from the skin sites were processed in a similar manner to the hearts. Intense fluorescence was documented in the dermis in sections stained with the positive serum.
R e s u m o d e Tese. F ra n c o M F . C a rd ite e xp erim en ta l d o co b a io p e la cepa y do T r y p a n o s o m a c ru zi. C orrelação en tre a histo p a to lo g ia e a p re se n ç a de a n tíg en o s p a ra s itá r io s id e n tific a d o s p o r im u n o fiu o rescên c ia in direta. R e v ista d a S o c ie d a d e B ra sileira d e M e d ic in a T ro p ica l 23: 1 8 7 -189, ju l-set, 1990.
N as condições experimentais utilizadas e com a metodologia empregada, os principais fatos obser vados foram:
1. Os cobaios infectados, com exceção de quatro, apresentaram parasitemia na 1 ? semana. 2. Em todos os cobaios, a parasitemia foi negativa a
partir da 7? semana.
3. As reações sorológicas de imunofiuorescência e de hemaglutinação indiretas atingiram títulos máximos na 3? ou 4? semana; os títulos se mantiveram até a época do sacrifício dos animais. 4. A reação de hemaglutinação indireta foi mais
sensível do que a reação de imunofiuorescência indireta.
5. A elevação dos títulos de anticorpos coincidiu, em geral, com a queda dos índices parasitêmicos. 6. Em todos os cobaios infectados, foi observado
processo inflamatório intersticial afetando os três folhetos do coração.
7. Os cobaios do Grupo 1 apresentaram numerosos ninhos de amastigotas nas fibras miocárdicas; os do Grupo 2 apresentaram número menor de ninhos e não foi encontrado parasitismo em fibras cardíacas nos animais dos Grupos 3 e 4. Em 1 cobaio do Grupo 3, havia ninho de amastigotas na camada média da porção inicial da aorta.
8. A s amastigotas se mostraram antigênicas, com fluorescência mais intensa da membrana celular. Por vezes, o material amorfo intersticial do ninho foi fluorescente, antigênico.
9. Em tomo dos ninhos íntegros, não se observou reação inflamatória.
10. Em tomo dos ninhos rotos, observou-se sempre infiltrado inflamatório mononuclear, por vezes muito intenso.
11. Em tomo dos ninhos rotos, foram observadas amastigotas fluorescentes no interstício ou no citoplasma de macrófagos, e fluorescência difusa do citoplasma de células mononucleares, indi cando presença de material antigênico nestes locais.
12. E m todos os cobaios infectados, foi observado processo inflamatório intersticial, aparentemente não correlacionado com o parasitismo tecidual, caracterizado por edema e infiltrado mononuclear com disposição predominante em tomo de capi lares intersticiais. Por vezes, o processo englo bava fibras cardíacas contíguas.
13. O processo inflamatório intersticial se dissemi nou por entre as fibras do miocárdio, atingindo desta forma o epicárdio e endocárdio.
14. Tanto o parasitismo tecidual quanto o processo inflamatório intersticial foram mais intensos ao nível da base dos ventrículos e nos átrios.
The main results o f the present investigation were as follows:
1. Eleven out of 15 infected guinea pigs developed parasitemia within the first week post-inoculation. 2. F o r all animals, parasitemia became negative
from week 7 onwards.
3. Anti- T . C r u z i antibody levels peaked at week 3 and week 4 and plateaued onwards.
4 . Hemagglutination was more sensitive than
immunofluorescence in detecting circulating antibodies.
5. The rising of antibody levels coincided with the decline of parasitemia.
6. The hearts from all infected guinea pigs revealed an inflammatory process involving the endo cardium, myocardium and pericardium.
7. Guinea pigs from Group 1 showed numerous amastigote cysts in the myocardium. Cysts were less numerous in G roup 2 and absent in Groups 3 and 4 .
8. The amastigotes inside the cysts were strongly antigenic showing fluorescence mainly at the cellular membrane. The amorphous intra-cyst interstitial material was also fluorescent.
9. M ononuclear cellular infiltration was observed only around ruptured cysts.
10. In those foci, fluorescent amastigotes were detec ted in the cardiac interstitium or in the cytoplasm of macrophages. In addition, there was also a diffuse fluorescence in the cytoplasm of some mononuclear cells revealing incorporation of pa rasitic antigens by those cells.
11. In addition to the inflammation related to ruptured cysts, it was observed in all animals an interstitial inflammatory component, made up by edema and mononuclear cellular infiltration mainly around small vessels. In some foci, the inflammation involved some contiguous normal muscle cells. 12. The inflammation spread alongside the myocar
dium interstitium reaching in this way the endo cardium and the epicardium.
13. The carditis was more intense at the basis of the h eart
14. T. c r u z i antigens detected by immunofluorescence were found in the cytoplasm of mononuclear cells and endothelial cells along the interstitial in flammation.
15. There were also dilated lymphatic vessels in the inflammatory foci, layered by plump cells and filled by an amorphous material. There were T. c r u z i antigens in the cytoplasm of the endothelial cells and in the intravascular material.
16. There was a positive correlation between the intensity of the inflammation and the amount of T.
R e s u m o d e Tese. F ra n c o M F . C a rd ite e x p erim en ta l d o co b a io p e la cepa y d o T r y p a n o s o m a cru zi. C orrelaçã o en tre a histo p a to lo g ia e a p resen ça d e a n tíg en o s p a ra s itá r io s id en tifica d o s p e la reação d e im u n o flu o rescèn c ia indireta. R e v ista da S o cied a d e B ra sile ira de M e d ic in a T ro p ica l 2 3 :1 8 7 -1 8 9 , ju l-se t, 1990.
15. Antígenos parasitários fluorescentes foram ob servados no citoplasma de células mononucleares e de células endoteliais de vasos sangüíneos nos focos de inflamação do miocárdio, epicárdio e endocárdio.
16. Em associação com o processo inflamatório intersticial, observaram-se linfáticos dilatados, revestidos por endotélio tumefeito, contendo na luz material amorfo e células mononucleares. A microscopia de fluorescência revelou antígenos parasitários nas células endoteliais e em mononu cleares da luz; por vezes, o material amorfo da luz era fluorescente.
17. O processo inflamatório intersticial foi mais in tenso nos cobaios do Grupo 1. N os cobaios dos Grupos 2 e 3, ele foi mais focal, mais compacto e por vezes assumiu aspecto granulomatoso. 18. N o Grupo 4, o processo inflamatório foi muito
menos intenso e a quantidade de antígenos para sitários menor.
19. Em um cobaio do Grupo 4, foi observada arterite coronária do tipo necrosante, com morfologia sugestiva de reação de hipersensibilidade. 20. A íntima associação entre antígenos parasitários
e reação inflamatória intersticial, não correlacio nada com parasitismo, pareceu indicar a partici pação de fenômenos imunoalérgicos na pato genia das lesões da cardite chagásica experi mental estudada. A drenagem intersticial e linfá tica de antígenos parasitários deve contribuir de modo importante para a sensibilização do mesên- quima do coração. Mesmo n a presença de pe queno parasitismo miocárdico, a inflamação in tersticial poderá se manter persistente, à custa de fenômenos imunes relacionados com antígenos seqüestrados nos interstícios.
c r u z i antigens in the lesions. Both findings were marked in Group 1, moderate in Group 2 & 3, and mild in Group 4.
17. A guinea pig from Group 4 presented a necrotizing arteritis in a coronary vessel, suggesting a hyper sensitivity reaction.
18. The close relationship between parasitic antigens and interstitial inflammation, in the absence of amastygote cysts, seemed to indicate that hyper sensitivity played a role in the pathogenesis o f the chagasic carditis. The interstitial and lymphatic drainage of T. c r u z i antigens should contribute to the sensitization of cardiac structures away from ruptured cysts. Even in the absence of tissular pa rasitism, the inflammation may persist through hypersensitivity reaction due to parasitic antigens sequestered in the interstitium.
M a r c e l l o F a b i a n o d e F r a n c o
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas e Biológicas de Botucatu da
Universidade Estadual Julio de M esquita Filho para obtenção do Título de D outor em Medicina
Botucatu, São Paulo, Brasil, 1972*
* Esta tese não foi publicada e, apesar do tempo» encerra assunto de interesse.
