1.1 - MUTAÇÃO DINÂMICA
Avanços na área de Genética Molecular permitiram o desenvolvimento de técnicas eficazes para o isolamento e caracterização molecular de genes, refletindo diretamente na aquisição de um maior conhecimento acerca das desordens de etiologia genética. No início da década de 90, foi descrito um novo mecanismo mutacional caracterizado pela expansão instável de seqüências repetidas in tandem que ocorrem como polimorfismos naturais nas populações. Este tipo de mutação, inicialmente detectado em indivíduos com a síndrome do X frágil foi denominado de mutação dinâmica (Fu et al., 1991; La Spada et al., 1991; Oberlé et al., 1991; Richards & Sutherland, 1992).
O mecanismo proposto para explicar a mutação dinâmica envolve a expansão e a instabilidade de arranjos seqüenciais de DNA que existem como pequenos segmentos estáveis distribuídos por todo genoma humano (Gusella & MacDonald, 1996; Reddy & Housman, 1997). As repetições mutantes são caracterizadas por apresentarem tanto instabilidade somática quanto germinativa e, mais freqüentemente, se expandem do que se contraem nas sucessivas gerações (Masino & Pastore, 2001). Em grande parte dos casos ocorre o fenômeno da antecipação que é a manifestação mais precoce dos sintomas e/ou a maior severidade da doença nas sucessivas gerações, estando normalmente relacionado aos tamanhos maiores de expansão da repetição e que pode ser
influenciado pela origem parental dos alelos (Richards & Sutherland, 1992; McInnis, 1996; Cummings & Zoghbi, 2000a; Richards, 2001).
A mutação dinâmica é responsável por uma série de desordens neurológicas causadas por expansões de repetições trinucleotídicas (Zoghbi & Orr, 2000; Sinden, 2001; Siyanova & Mirkin, 2001) que, em geral, apresentam padrão de herança ligado ao cromossomo X ou autossômico dominante (Cummings & Zoghbi, 2000b).
1.2 - DOENÇAS ASSOCIADAS A REPETIÇÕES TRINUCLEOTíDICAS
Baseando-se na localização das repetições no gene, as doenças causadas por expansões trinucleotídicas podem ser subdivididas em duas classes: a classe I onde as repetições ocorrem na região não-codificadora dos genes e a classe II que é caracterizada por repetições exônicas CAG que codificam domínios de poliglutamina, exceto na distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) provocada pela expansão de repetições trinucleotícas GCG na região codificadora do gene PABP2 (Brais et al., 1998; Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi & Orr, 2000; Sinden, 2001) (quadro 1).
Alterações envolvendo expansões trinucleotídicas foram identificadas, ainda, nos loci KCNN3, ERDA1 e CTG18.1, mas nenhum fenótipo associado foi identificado (Jin et al., 2001). Além disso, foi observado que diversos genes associados a doenças em humanos apresentam variações no número de repetições de seqüências trinucleotídicas, o que sugere que números variáveis de repetições em tandem (VNTRs) de seqüências genéricas possam estar associados à manifestação de doenças (De Fonzo et al., 1998). Variantes alélicas apresentando seqüências de repetições trinucleotídicas expandidas ou contraídas foram descritas em associação à pseudoacondroplasia (PSACH), displasia múltipla epifiseal (MED), displasia cleidocranial (CCD), simpolidactilia (SYN) e holoprosencefalia (HPE). Nestes casos, entretanto, o mecanismo proposto para a alteração difere da mutação dinâmica, sendo atribuído à recombinação somática ou à duplicação (Mundlos et
Quadro 1: Características genéticas das doenças causadas por repetições trinucleotídicas DOENÇA GENE E LOCUS REPETIÇÃO E LOCALIZAÇÃO Síndrome do X Frágil FMR1/Xq27.3 CGG - 5’ UTR Retardo Mental FRAXE FMR2/Xq28 GCC- 5’ UTR CLASSE Distrofia Miotônica (DM) DMPK/19q13 CTG - 3’ UTR I Ataxia de Friedreich X25/9q13-21.1 GAA – intron Ataxia Espinocerebelar 8 (SCA8) SCA8/13q21 CTG – 3’ UTR Ataxia Espinocerebelar 12 (SCA12) PP2R2B/5q31-33 CAG – 5’ UTR
Ataxia Espinocerebelar 1 (SCA1) SCA1/6p23 CAG – seqüência codante
Ataxia Espinocerebelar 2 (SCA2) SCA2/12q24.1 CAG – seqüência codante Ataxia Espinocerebelar 3 (SCA3) MJD1/14q32.1 CAG – seqüência codante CLASSE Ataxia Espinocerebelar 6 (SCA6) SCA6/19p13 CAG – seqüência codante II Ataxia Espinocerebelar 7 (SCA7) SCA7/3p12-13 CAG – seqüência codante
Atrofia dentatorubral palidolusiana (DRPLA) e Síndrome de Haw-River
(HRS)
DRPLA/12p13.31 CAG – seqüência codante
Doença de Huntington HD/4p16.3 CAG – seqüência codante Doença de Kennedy (SBMA) AR/Xq13-21 CAG – seqüência codante Ataxia Espinocerebelar 17 (SCA17) TBP/6q27 CAG – seqüência codante
Baseado em OMIM 2002
1.2.1 - Classe I – Doenças Decorrentes da Amplificação de Repetições Localizadas em Regiões Gênicas Não-Codificadoras
Esta classe de desordens é representada pela síndrome do X frágil (FRAXA), que é causada por expansões de repetições trinucleotídicas CGG, localizadas na região 5’ não traduzida do primeiro exon do gene FMR1 sendo a segunda causa genética de deficiência mental, só suplantada em freqüência pela síndrome de Down (Meadows et al., 1996).
Também estão incluídos nesta classe, o retardo mental FRAXE que é causado por expansões de repetições GCC na região
5’ não traduzida do gene FMR2; a distrofia miotônica (DM) uma doença de herança autossômica dominante, causada pela amplificação de seqüências trinucleotídicas CTG localizadas na região 3’ não traduzida do gene DMPK; a ataxia espinocerebelar tipo 8 (SCA8) que pertence ao grupo das ataxias hereditárias e que é causada por expansões de trinucleotídeos CTG repetidos em
tandem localizadas na região 3’ não traduzida do gene SCA8; a
ataxia espinocerebelar tipo 12 (SCA12) que é uma desordem rara causada pela amplificação de seqüências trinucleotídicas CAG localizadas na região 5’ não traduzida do gene PP2R2B e a ataxia de Friedreich (FRDA), única desordem do grupo a apresentar padrão de herança autossômico recessivo sendo causada por expansões de trinucleotídeos GAA presentes no primeiro intron do gene X25 (Cummings & Zoghbi, 2000a).
As doenças pertencentes a esta classe são, tipicamente, caracterizadas por apresentarem expansões longas e variáveis de repetições que resultam em disfunção e/ou degeneração em múltiplos tecidos. As manifestações fenotípicas variam de doença para doença, assim como o mecanismo patogênico que pode ser caracterizado pela perda ou ganho de função das respectivas proteínas. Nestas desordens, em geral, ocorre a presença de alelos intermediários, também denominados de pré-mutados, que podem se expandir e tornarem-se mutados após a transmissão para a geração subseqüente (Cummings & Zoghbi, 2000b; Sinden, 2001). A transição entre os alelos pertencentes a faixa normal de
repetições e a faixa pré-mutada é dependente, entre outros fatores, da estrutura primária do alelo, sendo que, a capacidade de expansão está diretamente associada à perda de trinucleotídeos intercalantes na repetição. As proteínas codificadas pelos genes responsáveis pelas doenças desta classe são, geralmente, ausentes ou expressas em níveis baixos (Masino & Pastore, 2001).
1.2.2 - Classe II – Doenças Decorrentes da Amplificação de Repetições Localizadas em Regiões Codificadoras dos Genes
Esta classe de desordens é causada por expansões de repetições CAG que são transcritas e traduzidas em longos domínios poliglutamínicos na proteína codificada (Kakizuka, 1998). São, caracteristicamente, doenças progressivas que se iniciam, em geral, na idade adulta causando aumento da disfunção neuronal e, eventualmente, perda total das funções neuronais 10 a 20 anos após o aparecimento dos sintomas (Zoghbi & Orr, 2000). À exceção da SBMA, todas estas desordens neurodegenerativas apresentam padrão de herança autossômico dominante. Nesta classe, os alelos normais situam-se na faixa entre 4 a 40 repetições trinucleotídicas CAG, enquanto que os alelos expandidos apresentam entre 41 a pouco mais de 100 repetições CAG (Gusella & MacDonald, 1996; Paulson & Fischbeck, 1996).
Estudos realizados em modelos animais e em sistemas de cultura de células têm revelado que estas desordens são causadas por um mecanismo de ganho de função da proteína mutante, que passa a exercer um efeito tóxico sobre a célula. Este fato sugere que os tratos poliglutamínicos expandidos sejam, provavelmente, o centro da patogênese, apesar das diferenças fenotípicas observadas entre os pacientes e da especificidade dos tecidos afetados (Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi, 2000). A presença de agregados de proteína ou inclusões nucleares (INs), freqüentemente encontrados no núcleo de células do sistema nervoso afetadas, sugere um mecanismo patológico comum para estas desordens e diversos estudos demonstram uma evidência substancial de que as inclusões nucleares são tóxicas para as células neuronais e que, conseqüentemente, sua presença é uma causa direta da patogênese (Fischbeck, 2001; Masino & Pastore, 2001). Entretanto, outros estudos envolvendo modelos animais e cultura de células sugerem que a formação destes agregados de proteína podem não estar diretamente relacionados à toxicidade celular e, neste caso, as inclusões nucleares formadas desempenhariam um papel protetor nas células neuronais, consistindo de tentativas celulares de degradar proteoliticamente ou inativar as proteínas tóxicas expandidas (Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi & Orr, 2000; Masino & Pastore, 2001).
Estão incluídas nesta classe a doença de Kennedy (SBMA) que é uma desordem com herança ligada ao cromossomo X
recessiva, a doença de Huntington (HD), as ataxias espinocerebelares do tipo 1 (SCA1), 2 (SCA2), 3 (SCA3), 6 (SCA6), 7 (SCA7) e 17 (SCA17), a atrofia dentato-rubral palidolusiana (DRPLA) e a síndrome de Haw-River (HRS).
1.3 - AS ATAXIAS
A ataxia consiste em uma alteração da motricidade que é caracterizada pela falta de coordenação no movimento e no equilíbrio, podendo resultar de qualquer alteração da ação conjugada da sensibilidade profunda, do labirinto e do cerebelo, elementos determinantes na coordenação dos movimentos voluntários (Rosenberg, 1992).
Na maioria dos casos, as ataxias resultam de um dano ou atrofia do cerebelo e podem ser divididas em duas categorias: as ataxias adquiridas, de caráter não-genético e as ataxias hereditárias. As formas adquiridas são resultado da influência de fatores ambientais tais como, exposição química, tumor ou trauma cerebral. As ataxias hereditárias constituem um grupo extenso e complexo de doenças degenerativas do sistema nervoso. Entretanto, a etiologia genética é reconhecida apenas em poucos casos. O espectro das ataxias hereditárias é amplo, apresentando desde um envolvimento cerebelar puro ao acometimento cerebelar
e dos gânglios da base, incluindo síndromes medulares associadas à neuropatia periférica (Imbert et al., 1996; Furtado et al., 1998; Klockgether & Evert, 1998; Bürk et al., 1999).
As ataxias hereditárias podem ser classificadas em ataxias autossômicas recessivas e ataxias de herança autossômica dominante (Furtado et al., 1998). As ataxias recessivas são causadas pela perda da atividade de proteínas que são essenciais para a sobrevivência e função de uma população específica de neurônios. A ataxia de Friedreich é o tipo mais comum desta forma de ataxia. As ataxias autossômicas dominantes são caracterizadas por uma grande heterogeneidade genética e por apresentarem mecanismos patogênicos diferentes que as dividem em dois grupos: o grupo I, representado pelas ataxias espinocerebelares do tipo 1(SCA1), 2 (SCA2), 3 (SCA3 ou doença de Machado-Joseph), 4 (SCA4), 5 (SCA5), 6 (SCA6), 7 (SCA7), 8 (SCA8), 10 (SCA10), 11 (SCA11), 12 (SCA12), 13 (SCA13), 14 (SCA14), 15 (SCA15), 16 (SCA16) e 17 (SCA17), e o grupo II, representado pelas ataxias episódicas 1 (EA1), 2 (EA2), 3 (EA3) e 4 (EA4) (Klockgether & Evert, 1998; NAF, 2002) (quadro 2).
Quadro 2: Aspectos genéticos das ataxias hereditárias
DOENÇA MUTAÇÃO PROTEÍNA
Autossômicas Recessivas
Ataxia de Friedreich (FRDA) Expansão GAA Frataxina Ataxia telangiectasia (AT) Deleção, Inserção Fosfatidilinositol –
3’quinase Abetalipoproteneimia Mutação Missense Proteína Microsomal
transferidora de triglicerídeo Ataxia com deficiência isolada de
vitamina E
Deleção Proteína transferidora de α-Tocoferol
Cerebrotendinosa Xantomatosa Mutação Missense Esterol 27- hidroxilase Autossômicas Dominantes
Grupo I
SCA 1 Expansão CAG Ataxina-1 SCA 2 Expansão CAG Ataxina-2 SCA 3 Expansão CAG Ataxina-3
SCA 4 ? ?
SCA 5 ? ?
SCA 6 Expansão CAG CACNA1A (canal de Ca 2+) SCA 7 Expansão CAG Ataxina-7
SCA 8 Expansão CTG ?
SCA 10 Expansão ATTCT ?
SCA 11 ? ?
SCA 12 Expansão CAG PP2R2B
SCA 13 ? ?
SCA 14 ? ?
SCA 15 ? ?
SCA 16 ? ?
SCA 17 Expansão CAG Proteína de ligação ao TATA-box Grupo II
EA -1 Mutação Missense KCNA1(canal de K +) EA -2 Deleção, mutação
por splicing
CACNA1A (canal de Ca 2+)
EA -3 ? ?
1.4 - ATAXIAS CEREBELARES AUTOSSÔMICAS DOMINANTES
As ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ADCA) constituem um grupo heterogêneo de doenças neurológicas, geralmente de manifestação tardia (por volta de 30 a 40 anos), que são caracterizadas por ataxia progressiva que resulta na degeneração do cerebelo e de suas vias aferentes e eferentes levando à falta de coordenação generalizada (Bürk et al., 1999). Há poucos relatos sobre a prevalência mundial das ADCA, mas estima-se que esta varie entre 0,3 e 2,0/100.000 habitantes (van de Warrenburg et al., 2002).
As ADCA podem ser classificadas, clinicamente, em três categorias (Harding, 1982): ADCA I (ADCA tipo I) que é a forma mais comum sendo caracterizada por ataxia associada a outros fatores neurológicos, entre eles, o envolvimento do sistema nervoso central e periférico e que inclui as ataxias espinocerebelares do tipo 1 (SCA1), tipo 2 (SCA2), tipo 3 (SCA3/MJD) e tipo 4 (SCA4); ADCA II (ADCA tipo II) que associa uma síndrome cerebelar à degeneração retiniana (maculopatia pigmentar) e é representada pela ataxia espinocerebelar do tipo 7 (SCA7); e ADCA III (ADCA tipo III) que se apresenta como uma síndrome cerebelar relativamente pura sendo geneticamente heterogênea e que inclui as ataxias espinocerebelares do tipo 5 (SCA5), tipo 6 (SCA6), tipo 10 (SCA10) e tipo 11 (SCA11) (Worth et al., 1999).
A maioria dos genes responsáveis pelas ADCA apresenta o mesmo tipo de mutação, a expansão instável de um polimorfismo constituído de trinucleotídeos CAG (Orr et al., 1993; Dürr et al., 1996; David et al., 1997; Geschwind et al., 1997; Michalik et al., 1999).
1.5 - A DOENÇA DE MACHADO-JOSEPH OU ATAXIA ESPINOCEREBELAR DO TIPO 3
Em 1972, Nakano e colaboradores descreveram a “doença de Machado”, uma forma de ataxia hereditária em uma família originária da ilha açoreana de São Miguel, a família de William Machado. Em 1976, uma desordem semelhante à doença de Machado foi descrita em uma família da Califórnia com ancestrais de várias ilhas dos Açores, tendo sido denominada “doença de Joseph” (Rosenberg et al., 1976). No início dos anos 80, diversos estudos demonstraram que as doenças de Machado e Joseph constituíam a mesma entidade. A partir de então, a doença passou a ser referida como doença de Machado-Joseph (MIM# 109150).
Inicialmente descrita em duas famílias norte-americanas originárias das ilhas portuguesas dos Açores e considerada uma desordem distinta da doença de Machado-Joseph (MJD), a ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) é considerada a forma mais comum das ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ADCA)
(Rosenberg, 1992), respondendo por 15 a 40% dos casos sugestivos, dependendo da população em estudo (Ranum et al., 1995). Após a caracterização molecular do gene responsável pela SCA3, ela passou a ser reconhecida como a mesma anomalia que acometia os portadores da doença de Machado-Joseph (Takiyama
et al., 1993; Kawagushi et al., 1994).
Sequeiros e Coutinho (1993) sugeriram que o evento mutacional que deu origem à SCA3 ocorreu em Portugal e se estendeu aos Açores durante o período de colonização ao longo dos séculos XV e XVI e, através da alta taxa de emigração para este arquipélago no final do século XIX, se estendeu aos Estados Unidos e Canadá. A SCA3 apresenta uma freqüência elevada (1/3.700 habitantes) nas ilhas portuguesas açoreanas de São Miguel e Flores, sendo também considerada a forma mais comum das ataxias hereditárias na Alemanha, no Brasil, nos Estados Unidos e no Japão (Schöls et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997; Geschiwind et al., 1997; Takano et al., 1998). Recentemente, em um estudo, envolvendo 145 famílias holandesas com ADCA, foi demonstrada a alta freqüência da SCA3 também nesta população, onde 44% das famílias foram diagnosticadas com esta desordem (van de Warrenburg et al., 2002).
A enfermidade caracteriza-se por ataxia cerebelar progressiva, associada à oftalmoplegia, sinais piramidais e extrapiramidais, atrofias musculares distais e retração das pálpebras. As manifestações da doença se iniciam, geralmente, na
idade adulta e se intensificam com o aparecimento dos sintomas mais severos da doença (Kawagushi et al., 1994; Maciel et al., 1995; Schöls et al., 1997). As diferentes manifestações clínicas da doença de Machado-Joseph resultaram numa classificação em três tipos: tipo I, grupo no qual a evolução da doença é mais rápida e seu início é precoce (entre 20 e 30 anos), com sinais clínicos geralmente mais severos (ataxia, oftalmoplegia e sinais piramidais e extrapiramidais); tipo II, considerado o grupo mais comum, que apresenta o início entre 30 e 40 anos e as manifestações clínicas são limitadas a ataxia associada à oftalmoplegia e tipo III, onde o início é o mais tardio (entre 40 e 60 anos) e a evolução da doença é lenta, caracterizando-se por sinais periféricos com adição das características do tipo II (Lopes-Cendes et al., 1997; Münchau et
al., 1999).
O locus da doença foi inicialmente mapeado no braço longo do cromossomo 14, em 14q24.3-q32.1 (Takiyama et al., 1993). Em 1994, Kawagushi e colaboradores descreveram a localização precisa do gene MJD1, também denominado de SCA3, em 14q32.1, a partir do rastreamento de uma biblioteca de c-DNA do cérebro humano utilizando uma sonda oligonucleotídica com 13 repetições GTC, complementares às repetições CAG. O gene MJD1 é composto por três exons e codifica a proteína ataxina-3. A SCA3 é decorrente da expansão de seqüências trinucleotídicas CAG, localizadas na região codificadora no terceiro exon deste gene. Esta expansão não altera a transcrição nem a tradução do gene, porém leva à
formação de tratos anormais de poliglutamina na proteína (Kawagushi et al., 1994).
O polimorfismo do locus SCA3 foi avaliado em diferentes populações, tendo sido caracterizado o grupo de alelos normais, compreendendo uma faixa de repetições (CAG)n entre 12 e 40 unidades. Já os alelos mutantes apresentam entre 55 e 86 unidades da repetição (Igarashi et al., 1996) (Figura 1). Foi observada em uma família alemã à presença de alelos intermediários contendo 53 e 54 repetições (van Alfen et al., 2001).
Figura 1: Representação esquemática do gene MJD1 com seus três
exons e as duas classes de alelos: normais e mutados; os exons 1, 2 e 3 ; os introns e a região polimórfica CAG no terceiro exon
Kawaguchi e colaboradores (1994) realizaram um estudo envolvendo 12 pacientes com SCA3 e 36 indivíduos normais pertencentes à população japonesa e verificaram que em indivíduos
Gene MJD1 1 2 3 1 2 3 Alelos Normais Alelos Mutados CAG (12 - 40) CAG (55 - 86)
normais os alelos variaram entre 13 e 36 repetições CAG, enquanto que alelos mutados apresentaram entre 69 e 72 repetições. No quadro 3 estão relacionados os dados de alguns estudos populacionais referentes ao locus SCA3.
Quadro 3: Caracterização do número de repetições CAG no gene MJD1 em diferentes populações do mundo
Maciel
et al., 1995 et al., 1997 Zhou et al., 1999 Pujana et al., 2000 Basu
População
Várias Chinesa Espanhola Indiana
Alelos
Normais 12-37 14-32 14-36 14-32
Alelos
Mutados 62-84 72-86 67-77 62-79
A transmissão de alelos expandidos está associada ao aumento no comprimento da seqüência trinucleotídica (Gusella & MacDonald, 1996) e o grau de instabilidade na transmissão destes alelos apresenta diferenças de acordo com o sexo do genitor, sendo mais freqüente a expansão por transmissão paterna (Maruyama et
al., 1995; Takiyama et al., 1995; Igarashi et al., 1996; Riess et al.,
1997). Assim como nas demais formas de ataxias espinocerebelares descritas, há uma correlação inversa entre a extensão da
amplificação e a idade de aparecimento dos sintomas (Ranum et
al., 1995).
A ataxina-3, proteína codificada pelo gene MJD1 apresenta 359 resíduos e peso molecular estimado de 42 kDa sendo a menor proteína descrita no grupo das doenças poliglutamínicas. Esta proteína não apresenta função conhecida ou homologia com nenhuma outra proteína já descrita (Tait et al., 1998). O trato poliglutamínico ocorre na região carboxi-terminal, sendo a única do grupo de doenças neurodegenerativas progressivas com esta característica (Kawagushi et al., 1994; Paulson & Fischbeck, 1996; Paulson et al., 1997). Em 1997, Schmit e colaboradores isolaram e caracterizaram o gene SCA3 em ratos e observaram que a ataxina-3 destes é altamente homóloga a dos humanos, com uma homologia na seqüência de aminoácidos de 88%. Entretanto, a região carboxi-terminal da proteína isolada em camundongos difere significativamente da seqüência descrita em humanos.
A ataxina-3 é encontrada, predominantemente, no citoplasma em células de indivíduos normais, entretanto, em tecidos de pacientes afetados pela SCA3, é também encontrada no interior do núcleo das células destes tecidos, formando estruturas denominadas inclusões nucleares (INs). Embora a ubiquitinação da proteína mutante e a agregação nuclear tenham sido descritas, o mecanismo molecular que pode explicar como ocorre a neurodegeneração ainda está pouco esclarecido (Paulson et al.,
1997). Os modelos propostos para explicar a patogênese incluem a alteração da função da proteína e a aquisição de propriedades interativas com outras proteínas, além da capacidade de agregação com a proteína selvagem (Paulson et al., 2000) (Figura 2).
Fonte: www.stanford.edu/group/hopes/rltdsci/trinuc/f6.html
Figura 2: Localização sub-celular da proteína ataxina-3. Em
células de indivíduos normais a ataxina-3 localiza-se preferencialmente no citoplasma, entretanto nas células de indivíduos afetados esta se encontra no núcleo formando agregados
Não há relatos específicos sobre o polimorfismo do número de repetições CAG no gene da ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) ou doença de Machado-Joseph em indivíduos normais na população do Estado do Rio de Janeiro. Entendemos que a caracterização dos alelos na população de nosso Estado e, particularmente, nos indivíduos acometidos de ataxia de causa
desconhecida é de extrema importância, já que esta doença faz parte de um grupo que apresenta uma grande sobreposição de fenótipos. Conseqüentemente, o oferecimento deste tipo de avaliação em Serviços de Genética Humana permitirá o diagnóstico da doença, possibilitando determinar a freqüência desta desordem em nossa população.
2.1 - OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho tem por objetivo realizar um estudo molecular dos alelos do locus SCA3 na população do Estado do Rio de Janeiro, permitindo a caracterização do polimorfismo na população normal e entre indivíduos acometidos por ataxia espinocerebelar de causa desconhecida.
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Caracterização dos alelos MJD1 em uma amostra de indivíduos normais da população do Rio de Janeiro;
• Determinação do padrão de distribuição dos diferentes alelos do locus SCA3;
• Identificação de alelos MJD1 mutantes entre indivíduos com sintomas sugestivos de ataxia espinocerebelar de etiologia desconhecida.
3.1 - OBTENÇÃO DE AMOSTRAS DE MATERIAL BIOLÓGICO
A análise do polimorfismo do locus SCA3 na população do Estado do Rio de Janeiro foi realizada em 246 indivíduos, sendo 237 indivíduos anônimos normais e 9 indivíduos portadores de ataxia espinocerebelar de etiologia desconhecida, pertencentes a diferentes famílias.
A amostra de indivíduos normais consistiu de 118 homens e 119 mulheres (faixa etária: 18 - 60 anos), doadores do Banco de Sangue Herbert de Souza do Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ). Para manter o anonimato das amostras foi utilizado um sistema de codificação alfanumérica, com indicação do sexo (M para masculino e F para feminino). Foram analisados também 9 pacientes (3 homens e 6 mulheres – faixa etária: 7-68 anos) portadores de ataxia espinocerebelar. Estes foram encaminhados ao Serviço de Genética Humana da UERJ (SERVGEN) por médicos neurologistas ou geneticistas do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE/UERJ), da Maternidade Escola (UFRJ) e do Instituto Fernandes Figueira (FIOCRUZ).
Amostras de sangue periférico para realização dos testes genéticos somente foram colhidas após assinatura de um termo de consentimento informado (Anexo I). A amostra de DNA de um paciente portador de SCA3 apresentando alelos com 14 e 71 repetições CAG foi utilizada como controle, tendo sido gentilmente
cedida pela Drª. Íscia Lopes Cendes (Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP).
A coleta de sangue periférico foi realizada por um técnico em análises clínicas seguindo normas de plena assepsia. Utilizando-se tubos vacutainer com anticoagulante EDTA, foram coletados 5 mL de sangue dos indivíduos normais e 10 mL dos indivíduos com sintomas sugestivos de ataxia espinocerebelar, referidos para análise molecular.
Este trabalho teve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) (Anexo II).
3.2 - EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
A extração do DNA genômico das amostras de sangue periférico seguiu o procedimento descrito por Miller e colaboradores (1988), com pequenas modificações.
O tubo contendo sangue foi suavemente homogeneizado e o sangue foi transferido para um tubo cônico de 50mL. Adicionou-se a este volume, 3,5 vezes o volume inicial de tampão de lise de hemácias (155 mM NH4Cl -Merck-, 10 mM KHCO3 -Merck-, 1 mM
EDTA -Amersham Pharmacia Biotech-) pH 7,4. O material foi homogeneizado e incubado em gelo por 30 minutos. Em seguida, o material foi centrifugado (Centrífuga Excelsa Baby II modelo
206-R/Fanem) por 15 minutos em uma velocidade de 1500 rpm. Terminada a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e ao material precipitado foram adicionados 5 mL de tampão de lise de hemácias. O material foi novamente homogeneizado, ressuspenso cuidadosamente com o auxílio de um agitador para tubos do tipo vórtex (Phoenix) e submetido a uma nova centrifugação por 15 minutos a 1500 rpm (Centrífuga Excelsa Baby II modelo 206-R/Fanem).
Após centrifugação, todo sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso com o auxílio do agitador para tubos do tipo vórtex em 3mL de tampão de lise de núcleo (10 mM Tris-HCl - Amersham Pharmacia Biotech, 400 mM NaCl -Isofar-, 2 mM EDTA) pH 8,2. Foi então adicionado a este material 70µL de proteinase K (20mg/mL – Gibco BRL-) e 150µL de SDS 20% (Amersham Pharmacia Biotech) seguido de leve homogeneização. Em seguida, o tubo foi incubado em banho de aquecimento (Fanem modelo 100) a 37°C por 20 horas.
Transcorridas às 20 horas, adicionou-se ao material 800 µL de uma solução saturada de cloreto de sódio 6M e agitou-se vigorosamente o tubo por 15 segundos. Para precipitação das proteínas, o material foi submetido a uma centrifugação (Centrífuga Hitachi modelo Himac CR21) por 30 minutos a uma velocidade de 6000 rpm/rotor 27. Terminada a centrifugação, transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mL
ao qual foi adicionado 2 vezes o volume de etanol absoluto (Isofar) gelado para a precipitação do DNA.
O precipitado foi lavado duas vezes em etanol 70% e transferido para um tubo de microcentrífuga para secar a temperatura ambiente por 24 horas. O DNA foi ressuspenso em 1mL de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) pH 7,4 e deixado solubilizar em banho de aquecimento (Fanem modelo 100) a 37°C por 3 dias. Após a solubilização, o DNA foi armazenado a 4°C.
3.3 - ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO DO DNA
As eletroforeses foram realizadas em gel de agarose 0,8% (Gibco BRL) em tampão TBE 1X (89 mM Tris, 89 mM H3BO3 -Gibco
BRL-, 2 mM EDTA), em cuba horizontal (Horizon 58 - Gibco BRL-) por 1 hora a 60 V.
As amostras foram preparadas utilizando-se 1 µL de DNA que foi misturado a 4 µL de água milliQ e 1 µL de corante de corrida (0,25% azul de bromofenol -Sigma-; 0,25% xileno cianol – Merck- ; 40% glicerol -Merck-). Após o tempo da corrida, o gel de agarose foi corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL -Sigma-) por 5-10 minutos. A estimativa da concentração das amostras de DNA foi feita através da comparação destas com padrão de 100 ηg do DNA do bacteriófago λ (Gibco BRL). Após a quantificação, uma
alíquota do DNA foi diluída a uma concentração de uso de 50 ηg/µl e o restante do material foi armazenado a 4°C.
3.4 - AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO INTERNO DO GENE
MJD1 ATRAVÉS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
(PCR)
A amplificação do fragmento que contém o polimorfismo CAG através da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando-se a metodologia descrita por Kawagushi e colaboradores (1994), com algumas modificações.
As seqüências dos oligonucleotídeos utilizados neste trabalho estão descritas abaixo:
• Primer MJD52 (FORWARD) – 5’ CCA GTG ACT ACT TTG ATT CG 3’.
• Primer MJD25 (REVERSE) – 5’ TGG CCT TTC ACA TGG ATG TGA A 3’.
As reações de PCR foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 200 µL com parede fina e incluíram 100ηg de DNA genômico, tampão de reação 1X (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl -Biotools-), 10% dimetilsulfóxido – DMSO - (Gibco BRL), 2,0 mM MgCl2 (Biotools), 0,1% Triton X-100 (Gibco BRL), 0,25 mM de dNTP
-Amersham Pharmacia Biotech-), 5 pmol dos oligonucleotídeos MJD52 e MJD25 (Kawagushi et al., 1994) e 2 U Taq DNA polimerase (Biotools) em um volume final de 25 µL.
As reações foram conduzidas em um termociclador modelo PTC-150 (MJ Research), e as condições de ciclagem estabelecidas incluíram uma desnaturação inicial a 94° por 5 minutos, seguida de 32 ciclos que incluíram três etapas: desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 62°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto e, em seguida uma etapa de extensão a 72°C por 5 minutos.
3.5 - ANÁLISE DO POLIMORFISMO DOS ALELOS MJD1
Os fragmentos gerados por PCR foram separados através eletroforese vertical (cuba V16 - Gibco BRL-) em gel de poliacrilamida 12% não-desnaturante composto de 8,8 mL de uma solução de acrilamida:bis acrilamida 30% (Gibco BRL), 4,4 mL de TBE 5X (445 mM Tris, 445 mM H3BO3, 10 mM EDTA), 135 µL de
persulfato de amônio (APS) a 10% (Gibco BRL), 8,65 mL de água milliQ e 15 µL de TEMED (Gibco BRL), utilizando-se TBE 1X (89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM EDTA) como tampão de corrida.
A um volume de 5µL de amostra de PCR foram acrescentados 2 µL de tampão de corrida (0,25% azul de
bromofenol, 0,25% xileno cianol, 40% glicerol) e aplicados em gel para corrida eletroforética. Para determinação dos tamanhos dos alelos, em paralelo às amostras de DNA amplificadas, foram aplicados 5 µL de marcador de peso molecular 1kb DNA ladder (Gibco BRL) e 5 µL de DNA de bacteriófago λ digerido com a enzima de restrição PstI (Gibco BRL). A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente por 20 - 22 horas a 140V.
Após a eletroforese, o gel foi submetido à coloração por prata (Santos et al., 1993). Primeiramente, o gel foi incubado sob agitação moderada em uma solução fixadora contendo 10% de etanol e 0,5% de ácido acético (Isofar) a 40°C por 3 minutos e, em seguida, em uma solução de 10% etanol, 0,5% de ácido acético e 0,2% de nitrato de prata (Merck) a 40°C por 10 minutos. Após a coloração, foi realizada uma lavagem de 20 segundos com água MilliQ à temperatura ambiente. O gel foi revelado em solução contendo 3% de hidróxido de sódio (Isofar) e 150 µL de formaldeído (Merck) à temperatura ambiente por 15 minutos. Para intensificar a coloração das bandas submetemos o gel a uma solução de 10% de etanol e 0,5% de ácido acético a 40°C por 3 minutos.
Após o procedimento de coloração, o gel foi seco em uma secadora de géis do tipo Gel Air Dryer (Bio-Rad).
3.6 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
Para determinar o número de repetições CAG nos alelos SCA3, foi realizada uma conversão da medida da migração da banda em cm para kb. O valor em kb foi obtido por meio de um gráfico gerado através das medidas da migração dos padrões de peso molecular (1kb DNA ladder e λPstI), utilizando-se o programa Instat da Graph Pad Software, San Diego, USA.
O número de repetições CAG nos alelos SCA3 foi determinado pela fórmula N = A – 161/3, onde N é o número de repetições CAG do alelo, A é o tamanho encontrado em pares de bases no alelo, 161 é o fragmento mínimo a ser amplificado, dividido por 3 por serem repetições trinucleotídicas.
A distribuição dos alelos MJD1 e das freqüências genotípicas da população foram avaliadas quanto ao equilíbrio de Hardy-Weinberg através do teste de qui-quadrado, ao nível de significância de 0,05. O teste não-paramétrico U de Mann-Whitney foi aplicado para estabelecer as diferenças entre o perfil de distribuição total das freqüências alélicas entre homens e mulheres, também ao nível de significância de 0,05. O uso do teste U de Mann-Withney deve-se ao fato dos nossos dados não seguirem a distribuição normal, conforme verificado pela aplicação do teste de Kolmogorov-Smirnov.
4.1 - ANÁLISE MOLECULAR DO GENE MJD1 EM INDIVÍDUOS NORMAIS
Um total de 237 indivíduos anônimos da população do Estado do Rio de Janeiro, sendo 118 do sexo masculino e 119 do sexo feminino, com faixa etária compreendida entre 18 e 60 anos foram avaliados neste estudo. O perfil de migração apresentado pelos alelos MJD1 na separação eletroforética em um gel de poliacrilamida 12% está representado na figura 3.
Figura 3: Perfil de migração apresentado pelos alelos MJD1 após
eletroforese em gel de poliacrilamida 12%. Raias 1-5, 7, 10-13, 15, 16 - indivíduos heterozigotos; raias 6 e 14 – indivíduos homozigotos; raia 8 - 1Kb DNA Ladder; raia 9 – λPstI. O limite de tamanho entre alelos normais e mutados está representado pela linha preta, que corresponde a alelos com 326 pb equivalentes a 55 repetições CAG. O número de repetições CAG apresentado por cada indivíduo está indicado na parte inferior da figura ½339pb ½264pb ½247pb ½216pb ½200pb 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 396pb ¾ 344pb ¾ 298 pb¾ 220pb ¾ 201pb ¾ 38 35 39 32 34 17 32 31 39 26 26 25 34 37 33 26 30 30 17 17 27 12 14 13 13 25 23 12
A análise molecular dos 474 alelos normais do gene MJD1 revelou um grau elevado de polimorfismo no padrão de distribuição do número de repetições CAG, tendo sido identificados 29 tamanhos diferentes de alelos. Os alelos normais apresentaram entre 12 e 40 unidades de repetição CAG e a média dos tamanhos dos alelos foi de 25,75 ± 6,53. A taxa de heterozigose observada foi de 79% (tabela 1). A distribuição do número de repetições CAG foi bimodal, apresentando um pico de alelos contendo 16 repetições e um pico de alelos contendo 26 repetições (figura 4). Quando analisados em conjunto, os alelos com 16 e 26 repetições CAG representaram 17% do total da amostra analisada. Foi observado somente um alelo contendo 40 repetições, sendo este o de menor freqüência (0,21%). Cerca de 51% dos alelos analisados apresentaram um tamanho compreendido na faixa entre 21 e 30 repetições CAG. Não foi observada em nossa distribuição a presença de alelos intermediários que correspondem à faixa de repetições entre 45 e 54.
Tabela 1: Distribuição da freqüência de repetições CAG nos alelos MJD1 na população normal do Estado do Rio de Janeiro
Número de
repetições CAG de Alelos Número Populacional (%) Freqüência
12 4 0,84 13 4 0,84 14 9 1,90 15 18 3,79 16 33 6,96 17 26 5,49 18 10 2,11 19 7 1,48 20 6 1,27 21 2 0,42 22 6 1,27 23 9 1,90 24 20 4,22 25 39 8,23 26 48 10,13 27 37 7,81 28 28 5,91 29 28 5,91 30 26 5,49 31 24 5,06 32 19 4,00 33 20 4,22 34 13 2,74 35 7 1,48 36 15 3,16 37 7 1,48 38 4 0,84 39 4 0,84 40 1 0,21 Total 474 100
Figura 4: Padrão de distribuição do número de r epetições CAG do ge ne MJD1
em indivíduos normais da população
A distribuição total do número de repetições CAG nos alelos de homens e mulheres foi comparada, utilizando-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney, e observamos que os tamanhos dos alelos masculinos e femininos apresentaram uma diferença significativa (MW= 24630; P=0,206).
Ao compararmos, através do teste do qui-quadrado, o número de repetições trinucleotídicas apresentado pelos alelos encontrados em homens e em mulheres observamos uma diferença significativa entre os alelos com 25 (χ2(1)=7,410; P<0,05), 29 (χ2(1)=5,143; P<0,05), 30 (χ2(1)=7,538; P<0,05) e 32 (χ2(1)=6,368; P<0,05) repetições CAG.
Em indivíduos do sexo feminino foi verificado que os alelos contendo 25 repetições CAG foram os mais freqüentes representando, aproximadamente, 12% da amostra analisada, enquanto que em indivíduos do sexo masculino estes alelos somente ocorreram em, aproximadamente, 5% da amostra. Por outro lado, os alelos contendo 26 repetições apresentaram maior freqüência em homens, sendo este o segundo tamanho de alelo mais freqüente na amostra de mulheres (tabela 2 e figura 5).
Tabela 2: Distribuição do número de repetições CAG no gene MJD1
entre homens e mulheres da população normal do Rio de Janeiro
Nº de repetições CAG Nº de alelos
♂
Freqüência em♂
(%) Nº de alelos♀
Freqüência em♀
(%) 12 3 1,27 1 0,42 13 1 0,42 3 1,26 14 4 1,70 5 2,10 15 10 4,24 8 3,36 16 13 5,51 20 8,40 17 13 5,51 13 5,46 18 3 1,27 7 2,94 19 5 2,12 2 0,84 20 1 0,42 5 2,10 21 0 0 2 0,84 22 5 2,12 1 0,42 23 3 1,27 6 2,52 24 9 3,81 11 4,62 25 11 4,66 28 11,77 26 24 10,16 24 10,08 27 23 9,75 14 5,88 28 13 5,51 15 6,30 29 20 8,48 8 3,36 30 6 2,54 20 8,40 31 13 5,51 11 4,62 32 15 6,36 4 1,68 33 10 4,24 10 4,20 34 8 3,39 5 2,10 35 5 2,12 2 0,84 36 10 4,24 5 2,10 37 4 1,70 3 1,26 38 1 0,42 3 1,26 39 2 0,84 2 0,84 40 1 0,42 0 0 Total 236 100 238 100Figura 5:
Gráfico demonstrando a variação do número de r
epetições CAG no g
ene
MJD1
entre indivíduos do sexo
Objetivando a avaliação da distribuição de genótipos na população e considerando a amplitude da amostra, os alelos MJD1 foram agrupados em três classes, de acordo com o número de repetições CAG: pequenos (12 a 20 repetições), medianos (21 a 30 repetições) e longos (31 a 40 repetições). Após a genotipagem dos indivíduos a distribuição dos alelos por classe foi avaliada entre os sexos, conforme apresentado na tabela 3.
Tabela 3: Distribuição dos alelos normais do gene MJD1 entre
indivíduos do sexo masculino e feminino. Os alelos estão agrupados em três classes de acordo com o número de repetições: pequenos (A) 12 -20 CAG; medianos (B) 21 - 30 CAG e longos (C) 31 - 40 CAG
Grupo de
Alelos N Freqüência Populacional (%) N♂ Freqüência em ♂ (%) N♀ Freqüência em ♀ (%) A (12-20) 117 24,7 53 22,5 64 26,9
B (21-30) 243 51,3 114 48,3 129 54,2 C (31-40) 114 24,0 69 29,2 45 18,9
Total 474 100 236 100 238 100
A avaliação do perfil de distribuição das classes alélicas através do teste do qui-quadrado revelou que o número de repetições nos alelos, por classe, entre homens e mulheres apresentou diferença significativa (χ2(1)=5,053; P<0,05) nos alelos com repetições maiores, sendo observado um excesso destes entre indivíduos do sexo masculino. Este dado foi confirmado através da
análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os diferentes genótipos. Esta análise revelou que a freqüência do genótipo AC (pequenas-longas repetições) em indivíduos do sexo masculino foi maior do que o esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (χ2(1)=7,529; P<0,05). Por outro lado, a freqüência do genótipo AA (pequenas repetições) em indivíduos do sexo feminino diferiu significativamente do esperado no equilíbrio (χ2(1)=5,40; P<0,05), sendo quatro vezes maior do que a observada em homens (tabela 4).
Tabela 4: Distribuição genotípica e freqüências relativas dos alelos do
gene MJD1 na população normal. Os alelos estão agrupados como descrito na tabela 3
Genótipo N Freqüência
Populacional (%) N♂ Freqüência em ♂ (%) N♀ Freqüência em ♀ (%) χ 2 AA 15 6,3 3 2,5 12 10,0 5,400* AB 53 22,4 22 18,6 31 26,0 1,528 AC 34 14,4 25 21,2 9 7,6 7,529* BB 69 29,1 31 26,3 38 31,9 0,710 BC 52 21,9 30 25,4 22 18,5 1,230 CC 14 5,9 7 5,9 7 5,9 - Total 237 100 118 100 119 100 - * significante ao nível de P<0.05
4.2 - ANÁLISE MOLECULAR DO GENE MJD1 EM INDIVÍDUOS ACOMETIDOS POR ATAXIA ESPINOCEREBELAR
A análise molecular do gene MJD1 foi realizada em 9 probandos (03 do sexo masculino e 06 do sexo feminino - faixa etária: 7-68 anos) com sinais clínicos de ataxia espinocerebelar, encaminhados por neurologistas e geneticistas ao Serviço de Genética Humana da UERJ. Na análise destes pacientes utilizamos como controle positivo uma amostra de DNA obtida de um paciente portador de SCA3, que apresentava um alelo normal contendo 14 repetições e um alelo expandido com 71 repetições CAG.
Em 6 dos casos avaliados (pacientes SCA001, SCA003, SCA004, SCA005, SCA006 e SCA007 – tabela 5), a análise molecular revelou a presença de alelos contendo um número de repetições CAG dentro da faixa de normalidade. Em 3 casos (pacientes SCA002, SCA008 e SCA009 - tabela 5) identificamos a presença de alelos expandidos, característicos dos portadores da ataxia espinocerebelar tipo 3 (figura 6).
A partir da identificação da mutação no gene MJD1 em um dos probandos (paciente SCA008 – tabela 5), realizamos também a análise molecular deste gene na irmã da paciente (SCA008B- 40 anos) que apresentou sintomas de ataxia espinocerebelar aos 32 anos. Sua análise molecular revelou a presença de um alelo na faixa normal, contendo 19 repetições CAG e um alelo expandido
contendo 69 repetições (figura 6). O heredograma da família é mostrado na figura 7.
Tabela 5: Distribuição do número de repetições CAG dos alelos MJD1 em pacientes com ataxia espinocerebelar de etiologia
desconhecida, encaminhados para análise molecular
Paciente Sexo Idade N o de repetições CAG
SCA001 F 14 17 e 26 SCA002* F 19 20 e 73 SCA003 M 7 20 e 23 SCA004 F 23 12 e 20 SCA005 F 45 20 e 26 SCA006 M 50 23 e 23 SCA007 F 67 18 e 23 SCA008* F 37 19 e 68 SCA009* M 19 28 e 72
* Pacientes portadores de SCA3
Figura 6: Análise molecular do gene MJD1 em indivíduos
portadores de SCA3. Raias: 1-SCA008, 2- SCA008B, 3-SCA009, 4 - λPstI, 5 - 1Kb DNA ladder, 6- C+ SCA3, 7-SCA002. Os alelos expandidos encontram-se acima da linha preta, que representa um segmento de 326pb contendo 55 CAG. O número de repetições CAG calculado para cada amostra está indicado na parte superior da figura 339pb¾ 264pb¾ 247pb¾ 216pb¾ 211pb¾ ½396pb ½344pb ½298pb ½220pb ½201pb 01 02 03 04 05 06 07 19 19 28 14 20 68 69 72 71 73
Figura 7: Heredograma do paciente SCA008. Após a confirmação
do diagnóstico clínico no probando (III-6), a avaliação molecular revelou a presença de um alelo expandido em sua irmã (III-5), que também apresenta os sintomas da doença
III5 e III6 – portadores de SCA3 confirmados por análise molecular.
Nas figuras 8A e B apresentamos os heredogramas dos pacientes SCA002 e SCA009 (tabela 5) identificados como portadores de expansões CAG no gene MJD1. Nenhum familiar foi referido para avaliação molecular nestas famílias.
1 2 3 4 5 6 7
[ ]
I II III IV 1 2 1 2 1 / - normalFigura 8: Heredograma dos pacientes SCA002 (8A) e SCA009 (8B).
(8A) – II5 portador de SCA3 confirmado por análise molecular (8B) – IV portador de SCA3 confirmado por análise molecular
Os resultados obtidos no presente trabalho originaram o manuscrito "Genetic characterization of MJD1 alleles and molecular analysis of SCA3 patients from Rio de Janeiro, Brazil" (Anexo III), submetido para publicação no periódico Genetic Testing.
A
B
1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 I II III IV 1 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 I II III 1 1 / - normalA ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) ou doença de Machado-Joseph foi originalmente descrita em famílias norte-americanas com ancestrais de portugueses açoreanos. Supõe-se que, durante o período de colonização nos séculos XV e XVI, esta desordem tenha sido disseminada por vários países, incluindo o Brasil (Sequeiros & Coutinho, 1993; Gaspar, 2001).
O locus SCA3 é altamente polimórfico tanto em indivíduos normais como em indivíduos portadores da doença e diversos estudos moleculares vêm sendo realizados em várias populações com objetivo de se obter maiores informações sobre a variação do número de repetições CAG neste gene (Kawaguchi et al., 1994; Maciel et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997; Zhou et al., 1997; Matsuyama et al., 1999; Maciel et al., 2001; Silveira et al., 2002), particularmente, porque a delimitação da faixa de alelos normais e de alelos mutados varia entre as populações.
A distribuição do número de repetições CAG nos alelos
MJD1 (tabela 1) observada em nossa amostra de indivíduos
normais do Rio de Janeiro foi semelhante a de outras populações do mundo já estudadas, apresentando 29 diferentes tamanhos de alelos e com variações de repetições entre 12 e 40. Kawagushi e colaboradores (1994) realizaram um estudo em 72 alelos normais do gene SCA3 na população japonesa e observaram tamanhos de repetições variando entre 13 e 36. Em um outro estudo, realizado por Maciel e colaboradores (1995) em 186 alelos normais de indivíduos de diversas etnias, o número de repetições CAG
observado encontrava-se na faixa entre 12 e 37. Matsuyama e colaboradores (1999) realizaram um estudo em uma ampla amostra da população japonesa, tendo observado entre 2134 alelos normais do gene SCA3 avaliados, um número de repetições maior, com variações compreendidas entre 14 e 47 trincas CAG. Assim como em outras populações estudadas, em nossa amostra não foram observados alelos do gene MJD1 na faixa intermediária (entre 45 e 54 repetições) (Maciel et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997; Maciel et al., 2001; van de Warrenburg et al., 2002). Entretanto, van Alfen e colaboradores (2001) reportaram a presença de alelos contendo 53 e 54 repetições, associados com fenótipos anormais, em dois indivíduos de uma família alemã e sugeriram que tais repetições poderiam ser patológicas.
De maneira semelhante ao observado em outras populações estudadas, em nossa distribuição de repetições CAG no locus SCA3, observamos uma taxa elevada de heterozigose (aproximadamente 80%). Em 1997, foi realizado um estudo na população brasileira onde foi estimada a taxa de heterozigose para o locus SCA3 em 91,3% (Lopes-Cendes et al., 1997). A análise do gene MJD1 na população espanhola demonstrou uma taxa de heterozigose em torno de 86% (Pujana et al., 1999) enquanto que na população indiana esta variou entre 82% e 87% (Basu et al., 2000).
A distribuição do número de repetições CAG no gene MJD1, na população estudada, apresenta dois picos, um deles de alelos
contendo 26 repetições e outro de 16 repetições, sendo considerada bimodal (figura 4). Os alelos mais freqüentes apresentaram 26 (10%), 25 (8%) e 16 (7%) repetições CAG. Nossos dados são similares aos reportados por Maciel e colaboradores (1995) em uma amostra de indivíduos de diferentes origens étnicas, que apresentaram uma distribuição bimodal com um pico em 24 repetições (18%) e um pico alternativo em 14 (9,5%). Entretanto, nossos dados diferem dos relacionados à população japonesa que apresentou distribuição unimodal, tendo como moda 14 repetições (Kawagushi et al., 1994; Matsuyama et al., 1999). Por sua vez, na população indiana foi observado que os alelos normais mais freqüentes no locus SCA3 apresentaram 23 (30%) e 27 (20%) repetições CAG (Saleem et al., 2000). É provável que a heterogeneidade genética da população brasileira possa ter influenciado, significativamente, o padrão de distribuição do número de repetições CAG dos alelos MJD1 em indivíduos normais.
Também foi observada em nossa distribuição, uma freqüência elevada (51%) de alelos na faixa entre 21 e 30 repetições CAG. Este dado é concordante com o relatado por Pujana e colaboradores (1999), que encontraram uma freqüência de 52% nesta mesma faixa de alelos em estudo realizado na população espanhola e por Maciel e colaboradores (2001) no estudo realizado em Portugal onde foi observada uma freqüência de aproximadamente 51%.
Verificamos através do teste não-paramétrico de Mann-Withney que a distribuição do número de repetições CAG nos alelos normais do gene MJD1 entre os sexos apresentou diferença significativa. A comparação entre os tamanhos individuais dos alelos entre indivíduos do sexo masculino e feminino demonstrou, através do teste do qui-quadrado, uma diferença significativa envolvendo quatro diferentes tamanhos de alelos: 25, 29, 30 e 32 (figura 5). Os alelos com 25 e 30 repetições foram significativamente mais freqüentes em mulheres, no entanto, em homens, os alelos com 29 e 32 repetições foram os mais freqüentes. Não há relatos específicos sobre estudos realizados em outras populações onde haja comparação das freqüências dos tamanhos de alelos observadas entre homens e mulheres.
Os alelos encontrados com maior freqüência na população masculina foram os com 26 repetições CAG, sendo este o segundo tamanho mais freqüente na população feminina. Nesta, os alelos com 25 repetições apresentaram maior freqüência, representando aproximadamente 12% do total da amostra de alelos femininos analisado.
Ao subdividirmos os tamanhos dos alelos MJD1 em 3 classes, de acordo com o número de repetições CAG, verificamos um desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg, através do teste do qui-quadrado, na análise das classes entre os sexos, sendo observado um excesso de alelos normais com longas repetições em homens (χ2(1)=5,053; P<0,05) (tabela 3). Matsuyama e colaboradores
(1999) realizaram um estudo analisando alelos de indivíduos normais da população japonesa, onde os tamanhos de alelos encontrados foram divididos em quatro grupos: A (14-17 CAG), B (18-23 CAG), C (24-25CAG) e D (26-47CAG), entretanto, estes autores não observaram diferença significativa na análise dos grupos entre os sexos.
Em nosso estudo, os alelos classificados por tamanho foram avaliados quanto à distribuição de genótipos entre indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino. O genótipo AC, constituído por alelos contendo repetições pequenas e longas foi significativamente mais freqüente em indivíduos do sexo masculino (χ2(1)=7,529;
P<0,05). Entretanto, em mulheres observamos um aumento significativo
do genótipo AA, constituído somente por alelos contendo pequenas repetições (χ2(1)=5,400; P<0,05) (tabela 4). Foi relatado para a SCA3 que os alelos de herança paterna são mais sujeitos à expansão do que os alelos de herança materna (Maruyama et al., 1995; Takiyama et al., 1995). Em 1996, Igarashi e colaboradores identificaram um polimorfismo nucleotídico CGG/GGG próximo à região 3’ da repetição CAG e observaram que há um risco 75 vezes maior de expansão em indivíduos do sexo masculino que apresentam o haplótipo (alelo expandido ligado ao trinucleotídeo CGG e alelo normal ligado ao trinucleotídeo GGG). Sendo assim, a elevada freqüência de alelos normais com longas repetições observada nos indivíduos do sexo masculino em nossa população pode estar relacionada à transmissão
preferencial do alelo mutado por via paterna. Torna-se, então, necessária a avaliação do polimorfismo CGG/GGG nestes indivíduos.
A análise do padrão de repetições CAG nos alelos SCA3 realizada em 9 probandos acometidos por ataxia de etiologia desconhecida, revelou a presença de 3 casos de ataxia espinocerebelar tipo 3, além da confirmação do diagnóstico clínico em um familiar .
Todos os pacientes acometidos apresentaram o alelo expandido em heterozigose. Os alelos expandidos encontrados situaram-se na faixa compreendida entre 68 e 73 repetições (tabela 5). Resultados similares foram observados nas populações avaliadas por Maciel e colaboradores (1995) (diferentes etnias), Lopes-Cendes e colaboradores, (1997) (Brasil) e Zhou e colaboradores (1997) (China).
Um aspecto interessante identificado neste trabalho foi a idade de manifestação dos sintomas. Os pacientes que apresentaram alelos com expansões maiores (SCA002 - 73 repetições CAG e SCA009 – 72 repetições) relataram um início precoce da doença (a paciente SCA002, aos 19 anos, já se encontrava em cadeiras de rodas e no paciente SCA009, os sintomas manifestaram-se inicialmente aos 17 anos), o que está de acordo com a ocorrência de antecipação, já estabelecida em famílias que apresentam SCA3. A análise molecular dos genitores destes pacientes seria necessária para a confirmação do fenômeno. Entretanto, os relatos destes pacientes sugerem que os sintomas dos ancestrais potencialmente acometidos tenha sido mais tardio.
A análise molecular do número de repetições trinucleotídicas CAG no gene MJD1 realizada em 237 indivíduos normais da população do Estado do Rio de Janeiro revelou um elevado grau de polimorfismo, tendo sido identificados 29 tamanhos diferentes de alelos. O número de repetições CAG variou entre 12-40 (X = 25,75 ± 6,53) e a taxa de heterozigose observada foi de 79%. A distribuição do número de repetições CAG é bimodal, apresentando um pico com alelos contendo 16 repetições e um pico com alelos contendo 26 repetições.
A distribuição do número de repetições CAG nos alelos normais do gene MJD1 entre homens e mulheres apresentou uma diferença significativa, sendo observado um excesso de alelos normais com maior número de expansões (31-40 repetições CAG) em homens.
A análise molecular do número de repetições trinucleotídicas CAG no gene MJD1 realizada em 9 indivíduos portadores de ataxia de etiologia desconhecida revelou a presença de alelos expandidos (68-73 repetições CAG) em 3 indivíduos, confirmando a SCA3 nestes indivíduos.
As condições ótimas para o diagnóstico molecular da mutação responsável pela SCA3 foram estabelecidas com sucesso e a metodologia se mostrou apropriada para diferenciar pacientes portadores de ataxia espinocerebelar do tipo 3 dos portadores de outras formas de ataxia espinocerebelar.
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