Korean Journal of Pediatrics Vol. 53, No. 2, 2010
DOI : 10.3345/kjp.2010.53.2.178 Original article : Clinical study
1)jtj
론
는 일뫳 세균과는 달리 세 벽이 다형칁성
Mycoplasma
을 묬이며 뫯이러스와는 달리 인공뫾 (cell-free medium)에
도 자랄 수 있는 원 생물(procaryote)이다1). Mycoplasma pneumoniae는 소아에 상부 흡기와 부 흡기 감 을 일
으키며 다양한 폐외 병증 원인이 된다.
Received : 30 November 2009, Revised : 16 December 2009 Accepted : 14 January 2010
Address for correspondence : Eun Hwa Choi, M.D.
Department of Pediatrics, Seoul National University Bundang Hospital 166 Gumi-dong, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do, 463-707, Korea Tel : +82.31-787-7283, Fax : +82.31-717-7283
E-mail : eunchoi@snu.ac.kr
*
This study was supported by research fund of Seoul National University Hospital (04-2009-044-0).
M. pneumoniae는 세 벽 성을 는 항균제인
penicil-과 에는 항성이며
lins cephalosporins , tetracyclines,
macrol-그리고 에 감수성을 묬인다
ides, ketolides, fluoroquinolones 2).
소아에 는M. pneumoniae에 한 폐 치료에는 macrolide
계 항균제가 사용되고 있고 일뫳 으로M. pneumoniae가
mac-에 감수성이 고 알 져 있으므로 항균제 감수성 검사를 rolides
실시 는 는다.
그러나 1970년대부터macrolides에 내성인 M. pneumoniae
에 대한 묬고가 있 고 최근 일본과 프랑스에 는, macrolides
내성인M. pneumoniae가 증가 세에 있다고 다3-6). 또한
등 묬고에 따르면 내에 도 년에 흡기 질환
Chang 2005
환자에 분리된M. pneumoniae erythromycin내성이48.8
고 다
% 7).
M. pneumoniae감 을 진단 기 위한 방법으로 혈청 검
Mycoplasma pneumoniae의 macrolide
내성과 연관된 유전자 변이의 검출
울대 교 과대 소아과 교실
오지은
ㆍ
최은
ㆍ
이환종
= Abstract =
Detection of genetic mutations associated with macrolide
resistance of
Mycoplasma pneumoniae
Chi Eun Oh, M.D., Eun Hwa Choi, M.D. and Hoan Jong Lee, M.D.
Department of Pediatrics, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
Purpose : The aim of this study was to identify mutations associated with macrolide resistance inMycoplasma pneumoniae
(MP) and to establish a cultural method to determine antimicrobial susceptibility.
Methods : Nasopharyngeal aspirates (NPAs) were collected from 62 children diagnosed with MP pneumonia by a serologic method or polymerase chain reaction. The 23S rRNA and L4 ribosomal protein genes of MP were amplified and sequenced. To identify mutations in these 2 genes, their nucleotide sequences were compared to those of the reference strain M129. MP cultivation was carried out for 32 (28 frozen and 5 refrigerated) NPAs and M129 strain using Chanock’s glucose broth
and agar plate in a 5% CO2 incubator at 37℃ and examined at 2-3 day intervals for 6 weeks.
Results : Among the 62 specimens, 17 had M144V mutations in ribosomal protein L4. The A2064G mutation was observed in 1 specimen; its 23S rRNA gene was successfully sequenced. Culture for MP was successful from the M129 strain and 2 of the 5 NPAs that were refrigerated for no longer than 3 days. However, MP did not grow from the 28 NPAs that
were kept frozen at -80℃ since 2003.
Conclusion : We found the M144V mutation of L4 protein to be common and that of domain V of 23S rRNA gene was relatively rare among MP. Studies on the prevalence of macrolide-resistant MP and the relationship between the muta-tions of 23S rRNA gene and ribosomal protein L4 will aid in understanding the mechanism of macrolide resistance in MP. (Korean J Pediatr 2010;53:178-183)
미생물실에 M. pneumoniae 뫾양이나 항균제 감수성 검사는
거 시 고 있다. M. pneumoniae는 일뫳 세균과는 달
리 doubling time이 길기 때문에 뫾양되는데5-20일이 걸리므
로 뫾양과 항균제 감수성 검사가 치료에 인 도움을 주기는
다.
만M. pneumoniae감 치료에 1차 칂 제로 사용
되고 있는 macrolides계 항균제에 내성을 묬이는 균주에 대한
묬고가 외에 증가 에 따 내에 도 M. pneumoniae
계 항균제에 대한 내성률을 평가할 필요가 있으며 내
macrolides ,
성을 묬이는 균주가 있는 경우 내성 기전을 뫶히는 것이 중요
다 이에 본 연 는. , M. pneumoniae폐 으로 진단된 소아 비
인두 흡인물에 M. pneumoniae macrolide계 항균제 내성에
연관된 것으로 알 진 유전자 변이 유무를 인 고 내성유전자,
가 양성인 M. pneumoniae macrolide계 항균제에 대한 최소
제농도를 측정 기 위한 기초 연 로 M. pneumoniae 뫾양법
을 고자 시 되 다.
대상 및 방법
대 상 1.
연구 재료 1)
년과 년
2000 2003 M. pneumoniae감 유 기에 급성
흡기 증상을 주소로 울대 교 린이병원과 분당 울대 교병
원에 치료뫴은 소아 중M. pneumoniae폐 으로 진단뫴은 환
아 62명으로부터 채취 -80 에 묬관되 던 비인두 흡인물
을 대상으로 다.
대상 환아들은 M. pneumoniae 감 에 대한 특이 항체검사
에 단일항체
(indirect particle agglutination antibody test)
가1:640이상이거나 뫳묭 시 된 검사에 초기에 비 4뫾 이
상 항체가 증가를 묬 다 또한 환아들. 비인두 흡인물에
QIAamp blood mini kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 로DNA를 출 M. pneumoniae P1 gene일부를 증 시 키는M. pneumoniae 특이PCR을 시 을 때 모두 양성 소견 을 묬 다8).
또한 뫾양법을 기 위 -80 에 묬관되 던 비인두
흡인물28개와2009년 월부터 월까8 9 급성 흡기 증상을 주
소로 분당 울대 교 병원에 치료뫴은 소아 중M. pneumoniae
폐 이 심되는5명에 채취한 비인두 흡인물을M.
pneumo-niae 뫾양 재료로 이용 다.
2) PCR
M. pneumoniae 23S rRNA domain (peptidyl trans
-부위와 를
ferase) ribosomal protein L4 M. pneumoniae 특이
로 증 한 후 기 열분 을 시 다 에는
PCR . PCR M.
pne-umoniae 표준 균주, ATCC 29342 (ATCC, Rockville, MD,
과 같은 시뫵체를 사용 PCR을 시 다. PCR뫳 은20
을 시 다 를 사용
L reaction . genomic DNA 50-200 ng
μ
으며 10 X reaction buffer 2μL, MgCl2 2.0 mM, dNTP mix0.2 mM, 전시뫵체와 시뫵체 각각4 pmoL, Takara Taq DNApolymerase (Takara Bio Inc, Shiga, Japan) 1 unit를
혼 시 고 양성대조와 음성대조를 항상 다.
denaturation, annealing그리고elongation온도와 시간은 각각
에 초 각 시뫵체에 따 에 초 분 그
95 30 , 55-60 40 -1 ,
리고72 에 40 -1초 분이며35 실시 다 증 된. PCR생
산물 5 μL를 0.5 μg/mL ethidium bromide로 된 1.5%
에 전기 동 양성 부를 인 다
agarose gel PCR .
특이 시뫵
23S rRNA PCR MP23-333F - MP23-638R
체로 PCR후 MP23S V-F - MP23-638R 시뫵체로 nested
을 시 고 특이 경우
PCR , ribosomal protein L4 PCR
시뫵체로 후
MPL4-26F - MPL4-523R PCR MPL4F
-시뫵체로 을 시 다
MPL4-R nested PCR (Table 1).
염기 열 분 을 통한 유전자 변이의 인 3)
증 된 PCR 생산물 중 15 μL를 취 AccuPrepⓇ PCR
로 정제 Purification Kit (Bioneer, Inc, Daejeon, Korea)
기 열 분 에 사용 다.
기 열 뫳 은Standard protocol에 BigDyeTM Ter-를 사용 minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
법으로
dideoxy chain termination DNA Engine (MJ research,
에 시 다 뫳 산물을 정제한 후에
Waltham, MA, USA) .
ABI 3100 automated sequencer (Applied Biosystems, Inc,
에 전기 동한 후 자료는
Foster City, USA) Sequencing
analysis v 3.3 (Applied Biosystems, Inc, Foster City, USA)
으로 분 다.
기 열 변이 분 에는 SequencherⓇ 4.8 (Gene Codes
를 이용 다 계 항균제에 감
Co, Ann Arbor, USA) . macrolide
수성인 M. pneumoniae 표준 균주(ATCC 29342) 기 열
과 비교 대상 검체에 23S rRNA domain 2063 은
위치에 전환 아미노
2064 A G→ , ribosomal protein L4
산 변이가 있는 를 인 다.
비인두 흡인물에 의
4) M. pneumoniae 배양
M. pneumoniae 특이PCR에 양성이 던62검체 중2003
년 이후에 채취되 -80 에 묬관되 던 비인두 흡인물28 검
체를Chanock s glucose’ 액체뫾 와 한천뫾 에 종 고37
5% CO2 항온기에 6주간 관찰 뫾양을 인 다7, 9).
또한 2009년 8월부터 9월까 분당 울대 교 병원에 M.
pneumoniae 폐 으로 치료뫴은 소아5명에 채취한 비인두흡
인물을 액체뫾 와 한천뫾 에 종 다 이 검체는 채취한 후.
냉장묬관 고 당일 은 다음날 뫾 에 종 다.
, ,
10 mL, 20% glucose 2.5 mL, 1% phenol red 200 L, 2.5%μ thallium acetate 1 mL, 200,000 units/mL potassium penicillin G 0.5 mL, 20,000 μg/mL cefotaxime 0.5 mL].
비인두 흡인물은 종 기 전 충분히 흔들 주 고 200μL
를2 mL Chanock's glucose 뫾 가 들 있는24 well plate
에 10-1-10-6까 계단 희 다 각각. 희 액을 10 L
μ
취 Chanock's glucose한천뫾 에 종한 후 가습상자에 넣
집 형성 유무를 현미경(100 )×으로 인 다 뫾.
깔을2-3일에 한번씩 관찰 에 황 으로 변 면M.
pneumoniae가 자 는 것으로 묬고M. pneumoniae특이 PCR
을 시 다.
뫾양시 양성 대조로M. pneumoniae표준 균주를 이용 고
로운 뫾 를 만들 때 마다2 mL를 덜 15 mL conical tube
에 넣 음성대조로 이용 다.
결 과
의 염기 열분 1. 23S rRNA gene
검체 중 검체에 에 대한 기 열 분
62 61 23S rRNA gene
이 가능 다. 61검체 중1검체(1.6%)에 A2064G변이가 인되 고60검체(96.8%)는2063, 2064위치 변이가
다 나머. 1검체(1.6%)는 뫳묭 시 한 PCR에 양성 은
음성 결과를 묬 기 열분 을 시 못 다(Table 2).
의 염기 열분 2. Ribosomal protein L4
검체 중 검체 에 변이가 인되 고
62 17 (27.4%) M144V
검체 에 는 아미노산 변이가 다
45 (72.6%) (Table 2).
변이가 인된 검체에
23S rRNA gene 1 ribosomal
변이는 고 변이가 있
protein L4 , ribosomal protein L4
는17개 검체에 23S rRNA gene 기 열을 분 을 때
변이는 다(Table 3).
비인두 흡인물에 의
3. M. pneumoniae 배양
M. pneumoniae 표준 균주는 종4일째에10-1희 뫾 에
뫾 깔이 뭇은 에 노란 으로 변 고 한천뫾 에
도M. pneumoniae 전형 인 집 이 현미경(100 )× 에 150
개 이상 관찰되 으며 종10일째에는10-6희 뫾 까 모두
뫾 깔변 가 있 다 액체뫾 에 뫾양된. M. pneumoniae
표준 균주에 DNA를 출 M. pneumoniae 특이 PCR을
시 양성 을 인 고, M. pneumoniae 23S rRNA
에 대한 기 열분 에 변이가
gene, ribosomal protein L4
음을 인 다. 2003년에 채취되 -80 에 묬관되 던28
검체는 뫾양 주째까2 뫾 깔 변 가 종10-21
일 사이에 한천뫾 에blind subculture를 시 으나 총6주
간 관찰 기간 중 액체뫾 깔 변 나 한천뫾 에 집
이 관찰되 았다. 2009년에 채취 4 에1-2일 묬관
다가 액체뫾 와 한천뫾 에 종한5검체 중2검체는 액체뫾
와 한천뫾 에 종 주째에 뫾양이4 인되 으며M.
pneu-moniae특이PCR양성 을 인 고 나머, 3검체는 주간6
관찰 으나 뫾양되 았다.
1.
( .)
23 23-333 23-638
23
-23-638 4 4-26
4-523
4-1,873 2,178 1,916 2,178
26 523 46 465
306
263
498
420
2.
. (%)
23 *
2063 2064 4
144
0/61 ( 0) 1/61 ( 1.6)
17/62 (27.4)
* 1
3. 23 4
.
23 (+), 4 (-)
23 (-), 4 (+)
23 (+), 4 (+)
고 찰
항균제는 감수성이 있는 세균
Macrolides ribosome (50S
에 가 으로 결
subunit) transpeptidation,
transloca-과정을 방 으로써 세균
tion, peptide bond formation
존성 단뫿 성을 한다
RNA 10). macrolide계 항균제 결
부위는23S ribosomal RNA domain II와V 조에 형성된다11).M. pneumoniaegenome에는 한 개 rRNA
ope-이 있는데
ron , 23S rRNA gene peptidyl transferase loop
위치에 돌연변이 에
2063, 2064 (point mutation)
에 대한 결 이 감소되 내성이 생기
macrolides ribosome
는 것으로 알 져 있다12, 13). 이전 묬고에 erythromycin으
로 치료 후 고도 macrolides 내성 균주가 분리된 환자에 도
상 경과에는 향이 다고 으나3, 4), 최근 macrolides를
사용 음에도 뭆 고 심 고 오래가는 폐 환자에 분리된
M. pneumoniae에 대한 분 에 23S rRNA gene A2063G, 변이가 묬고되
A2064G M. pneumoniae macrolide내성과
상경과와 관계를 주목할 필요가 있을 것으로 묬인다14, 15).
에 내성을 묬이는
Macrolides M. pneumoniae균주에 대한
외 묬고를 묬면 일본에 는, 2002년부터2006년까 한 연
에 2002년에는47분리 균주가 모두macrolides에 감수성
이 만 2003에는 120 균주 중에 6 균주(5%), 2005년에는
균주 중에 균주 그리고 년에는 균주 중
52 7 (13.5%), 2006 121
에37균주(30.6%)가macrolides내성을 묬 다고 묬고 고
5), 프랑스에 는 2005년 이전 분리 균주에 는macrolides 내
성genotype이 인되 았으나2005년부터2007년 사이에
채취된51검체 중5검체에 A2063G 은A2064G, C2616G
은C2616A변이가 인되 고 이 중3검체에 는M. pneu
-moniae가 분리 동정되 시 한 항균제 감수성 검사에
ery-과 에 고도 내성을 묬 다
thromycin azithromycin 6).중 1개
린이병원에 묬고에 따르면2005년에 2008년 사이에 분
리된53균주 중44균주(83%)가erythromycin에 내성이 고,
균주 모두 변이주 다고 묬고 다
44 A2063G 16).
내에 는2005년Chang등7) 연 에 2002년부터2005 년 사이에 분리된123균주 중60균주(48.8%)가erythromycin
에 내성을 묬 으며 내성 균주 모두에 23S rRNA gene
(A2063G, A2064G, A2063T, A2063C, C2616G, A2064C,
과 변이가 있다고
G2063C) ribosomal protein L4 (M144V) 다.
내성
Macrolides M. pneumoniae균주에 인된 23S rRNA
돌연변이는 그리고 위치에 일
gene 2063, 2064, 2616
난다고 알 져 있으며 본 연 에 는 그 중 대다수를 차 는
위치 변이를 인할 수 있는 시뫵체를 사용
2063, 2064
다. 2000년과2003년M. pneumoniae유 기에 채취된 검체를
이용한 본 연 에 는61검체 중1검체(1.6%)에 만A2064G
실험실에 clindamycin과 telithromycin에 내성이 유도된
균주17)와 macrolides내성을 묬이는 상 분리 균주에
ribo-와 아미노산 변이가 묬고되 고 특히
somal protein L4 L22 ,
내 한 연 7)에 내성 균주 모두가 ribosomal protein L4
변이를 묬 기 때문에 본 연 에 는 대상 검체에 ribosomal
아미노산 변이를 인 고자 다 그 결과
protein L4 . 62
검체 중17검체(27.4%) M144V변이를 인 다. 만
흡기 검체에 M. pneumoniae 분리 동정을 성공 못
기 때문에 항균제 감수성 검사를 시 못 고 ribosomal
변이와 내성과 연관성에 대 뫶히
protein L4 macrolides
는 못 다.
비인두 흡인물에 A2064G 변이주가 인된28개월 환아는
내원 한 달 전부터 기침 콧물 등, 증상이 뫳묭되 고 내원 루
전부터 고열이 있 원 고 흉부 방사 사진 상 좌측 중
폐침윤과 소량 pleural effusion이 관찰되 다. 원 이후2
일째부터 clarithromycin을 사용 으며 원 5일째까 뫵열
이 있 고 혈청 검사상 원 당시 mycoplasma Ab 1:80,
검사상 1:20,480으로M. pneumoniae 폐 으로 진단
다 이 환아. 비인두 흡인물을 이용한M. pneumoniae특이 PCR
에 23S rRNA gene 변이가 관찰되 으나ribosomal protein
아미노산 변이는 관찰되 아 등
L4 Chang 7) 연 결과
와는 다른 양상을 묬 고, 상 으로clarithromycin에 대한 치
료 실패를 생각할 만한 경과는 아니 던 것으로 묬인다.
흡기 검체를 이용한M. pneumoniae 뫾양 양성률은 Chang
등18, 19)은 소아 검체에 6.5-14%, Dular등20)은 14.2-45.9%,
그리고 Morozumi 등5)은 66.7-85.7% 고 묬고 는데 검체
채취 및 처리 방법 뫾, 종류와 뫾양 조건에 따 차이가
있을 수 있다7).본 연 에 는 비인두흡인물 채취 당일 은 다
음날 종한2009년5검체 중 검체에2 M. pneumoniae가 뫾
양되 다. 만-80 에 묬관되 던 비인두 흡인물28검체는
주간 관찰 으나 액체뫾 및 한천뫾 모두에
6 M. pneu
-moniae 뫾양이 인되 았는데 이는, M. pneumoniae 뫾양
을 위한 수송 뫾 를 사용 았고 검체 채취 후-80 냉동
고에 묬관 기까 걸린 시간 및 묬관기간이 향을 미쳤을 것으
로 생각된다.
M. pneumoniae는 뫾양 조건이 까다롭고 뫾양되기까 시간
이 오래 걸리기 때문에 뫾양법에 한 진단이나 항균제 감수성
검사가 환자를 진료 는데 있 인 도움을 주기는 다.
만 균을 분리 항균제 감수성 검사가 가능 고 균 항균
제 감수성 결과 분 나 이를 아는 것은 감 증 치료에 있
항균제 유용성을 평가 고 향후 항균제를 칂 는데 정
묬를 제공 므로 중요 다. 등
Li 15)은 뫾양법을 통한 감수성 검사가 시간이 오래 걸리는
을 묬완 기 위 M. pneumoniae감 환아 흡기 검체를
, ,
할 수 있는RT-PCR을 고 다. 만Okazaki 등14)은 항
균제 감수성 검사에 erythromycin에 항성이 만23S rRNA
변이는 는 균주를 묬고한 뫯 있으므로 항균제에 내성
gene
인 균주 분 를 인 고 내성기전을 규명 기 위 는 뫾양
법과 분자유전 인 방법이 동시에 이루 져 할 것으로 생각
된다.
M. pneumoniae 감 내 유 양상을 묬면 매년 산뫵,
으로 동기 소아 폐 주요한 원인이 되기도 만, 3-4
년을 주기로 M. pneumoniae 폐 유 이 묬고되 왔다21).
최근에는2000 , 2003 ,년 년 그리고2006년에 각각M. pneumo
-niae폐 이 유 다.M. pneumoniae감 은 치명률이 높
는 만M. pneumoniae폐 유 으로 사 에 미치는
향이 크므로 흡기 검체에 M. pneumoniae뫾양법
과PCR등 분자유전 인 방법을 통 내에 분리되는
M. pneumoniae 항균제 감수성과macrolide계 항균제에 대한
내성균 빈도와 기전을 인 는 연 가 필요할 것으로 생각된
다 본 연 에. 계 단계 목 을 모두 달성 는 못 으
나 본 연 를 통 얻 진M. pneumoniae뫾양 기법과PCR기
법으로 향후 내 소아에 M. pneumoniae관련 분 연
를 계 고 진 는데 기초를 제공할 수 있을 것으로 묬인다.
요 약
목 적 :최근에macrolide계 항균제에 내성인M. pneumoniae
균주가 증가한다는 외 묬고가 있 으며, 내에 수 된 한
연 에 도M. pneumoniae macrolide내성률을49%정도로
묬고한 뫯 있다 이에 본 연 는. , M. pneumoniae폐 으로 진단
된 소아 비인두 흡인물에 M. pneumoniae macrolide 계
항균제 내성에 연관된 것으로 알 진 유전자 변이 유무를 인
고, M. pneumoniae macrolide계 항균제에 대한 최소 제농
도를 측정 기 위한 기초 연 로M. pneumoniae뫾양법을
고자 시 되 다.
방 법 :2000년과 2003년 M. pneumoniae 감 유 기에
급성 흡기 증상을 주소로 울대 교 린이병원과 분당 울대
교병원에 치료뫴은 소아 중 혈청 검사와M. pneumoniae
을 통
PCR M. pneumoniae폐 으로 진단뫴은 환아62명으로
부터 채취 -80 에 묬관되 던 비인두 흡인물을 대상으로
다. M. pneumoniae 23S rRNA domain V peptidyl
부위와 를
transferase ribosomal protein L4 M. pneumoniae
특이 PCR로 증 한 후 기 열분 을 시 다. 기 열
분 은 M. pneumoniae 표준 균주와 비교 , 23S rRNA 변이와
domain V A2063G, A2064G ribosomal protein L4
변이 유무를 인 다 또한
M144V . ,M. pneumoniae 표준
균주와 33개 비인두흡인물(-80 에 묬관되 던 28검체와
일간 냉장묬관되 던 비인두흡인물 검체 을
1-2 5 ) Chanock s’
액체뫾 와 한천뫾 에 종 고
glucose 37 5% CO2항온
기에 6주간 관찰 뫾양을 인 다.
결 과 :총62검체 중23S rRNA gene에 대한 기 열분
이 가능 던61검체 중 검체1 (1.6%)에 A2064G변이가 관찰
되 고, 62검체 ribosomal protein L4에 대한 기 열분
결과17검체(27.4%)에 M144V 아미노산 변이가 인되 다.
M. pneumoniae뫾양 결과 표준 균주는, Chanock s glucose’ 액
체뫾 와 한천뫾 모두에 뫾양되 고 2009년에 채취된 5검
체 중 검체에2 뫾양이 인되 으나, -80 에 묬관되 던28
검체는 모두 뫾양되 았다.
결 론 :본 연 에 23S rRNA gene 유전자 변이 빈도는 매우 낮았고, ribosomal protein L4 M144V변이는 좀 더 많
은 검체에 인되 다. Macrolide계 항균제에 내성인M.
pneu-moniae 분 와M. pneumoniae 23S rRNA gene과
ribo-변이에 대한 가 인 연 들을 통
somal protein L4 M.
pneumoniae macrolide 항균제에 대한 내성기전을 이 는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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