Apostila aulas pratica Micro I doc

Microbiologia I

Microbiologia I

Roteiros das aulas práticas

Sumário

Normas de segurança para as aulas práticas de microbiologia.

Prática 1 – Introdução ao laboratório/ Métodos de controle de microrganismos Prática 2- Verificação da presença de microorganismos no ambiente.

Pratica 3 – Desinfecção de superfícies.

Prática 4– Crescimento de colônias isoladas pelo método Streak Plates (“estricar”) e diluição seriada.

Pratica 5 – Teste da catalase e do KOH.

Prática 6 – Método de Coloração de Gram e morfologia bacteriana Prática 7 – Estrutura de locomoção.

Normas de segurança

para as aulas práticas de microbiologia

É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de

mangas compridas e estar abotoado;

Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório;

O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações;

Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática;

 Descarte de material:

a)Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias;

b)Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada;

c)Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d)Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes.

 Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes  Terminados os trabalhos práticos:

a)Esterilizar alças e fios de platina;

b)Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; c)Desligar lâmpadas e microscópios;

d)Limpar microscópios e cobri-los com a capa; e)Tirar o avental e guardar;

Prática 2 –

Verificação da presença de microorganismos no ambiente

Objetivos:

Verificar a presença de microorganismos em diferentes ambientes. Testar a eficácia da ampicilina como antibiótico. Analisar o método de seletividade do meio Agar Macconkey.

Materiais:

 Ágar + LB Broth(em pó);  Água destilada;

 Antibiótico – Ampicilina;

 2 Placas de Petri esterilizadas;  Cotonetes esterilizados

 Erlenmeyer de 500mL – Graduado a cada 100mL;  Banho Maria à 37°C;

 Balança analítica;

 Proveta de 500mL – Graduada a cada 10mL;  Papel alumínio.

Procedimento:

Parte I – Preparar: Meio de cultura Luria-Bertani (LB) + Ágar

Preparar 50 mL de meio, sendo para cada placa de Petri aproximadamente 25 mL. O LB Broth e o Agar já estão misturados em suas devidas proporções para a preparação do meio de cultura. Porém a tabela abaixo mostra as proporções de cada reagente para preparar o meio de cultura (para 100mL de meio):

Reagentes Para 100 mL de meio LB Broth 2,5 g

Ampicilina 50 µg/mL Ágar bacteriológico 1,5 g

Verifica-se que o LB Broth com o Agar geram 4g de reagente juntos, para 100mL de meio.

Sendo assim, deve-se pesar 2g de LB Broth + Agar sobre um papel alumínio na balança analítica e misturar com o volume de água destilada desejada no Erlenmeyer de 500mL. Agitar até formar uma solução homegênea. Autoclavar por 20 minutos.

Enquanto o meio de cultura está na autoclave, realizar a Parte III do experimento, com as placas já preparadas com antecedência pelos técnicos.

A ampicilina também já está preparada.

Ao retirar o meio da autoclave, separar 25mL de meio e misturar com ampicilina, homogeneizar a nova solução, e plaquear ambas as soluções (com e sem antibiótico).

Parte II - Preparar: Placas de Petri

Sem abrir totalmente a placa, verter cerca de 25mL de meio a uma temperatura de 45°C, tapando a placa de imediato;

Após a solidificação inverter as placas.

Parte III - Isolamento de microrganismos do ambiente

Utilizar os cotonetes para fazer inóculos nas placas de Petri como orientado.

Questionário

1) Qual a composição do meio LB?

2)Qual o volume final de solução de ampicilina utilizado no meio? Mostre os cálculos partindo da concentração inicial e final mostradas abaixo.

Utilizar: [ ] de 1,25mg/mL, e deseja-se uma [ ]final de 50ug/mL.

3) Como se prepara o meio de cultura Agar Macconkey e qual seu método seletivo para microorganismos? Pesquisar.

Pratica 3 – Desinfecção de superfícies

Objetivo:

Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano.

Materiais:

 Tubos de ensaio estéreis (12 para cada grupo)

 Tubos de ensaio contendo 3mL de meio de cultura LB líquido (15 para cada grupo)  Tampões de algodão para as culturas (colocados nos tubos);

 Tubos de ensaio contendo meio de cultura LB líquido + e-coli + 3 lamínulas (4 para cada grupo)

 Papel de alumínio;  Banho Maria a 37°C;

 Pinças esterilizadas (aguardar segunda parte do experimento);  Produtos que serão testados:

a. Hipoclorito de sódio (0,1%, 1%, 3%, água, controle) b. Álcool etílico (30%, 70%, 96%, água, controle) c. Lisoforme (30%, 70%, 100%, água, controle) d. Detergente comum (1%, 5%, 10%, água, controle)

Procedimento:

Preparar as 3 soluções do produto “escolhido” para 10mL (em tubos de ensaio, 3 para cada diluição, o que resultará em 9 tubos de ensaio);

Preparar 3 tubos de ensaio com 10mL de água destilada;

Cada grupo terá 4 tubos de ensaio com meio de cultura LB líquido + e-coli com 3 lamínulas cada um, que agirá como a superfície infectada;

Pegar os tubos de ensaio com as lamínulas infectadas, observar que o meio de cultura está turvo, retirar cada uma das 3 lamínulas com uma pinça e colocá-las separadamente nos tubos contendo a solução do produto testado, inclusive na água;

Deixar agir por 10 minutos;

Passados os 10 minutos, retirar cada uma das lamínulas com uma pinça ESTERELIZADA e inseri-las em tubos de ensaio com meio de cultura LB líquido (puro) para testar a desinfecção;

A água não matará nenhuma bactéria, portanto agirá como controle positivo, ou seja, nos tubos de ensaio nos quais foram colocadas as lamínulas dos tubos com água, teoricamente apresentarão crescimento de bactérias. Além disso sobrarão 3 tubos contendo meio de cultura líquido que deverá ser guardado junto com os outros tubos, para que eles possam atuar como o controle negativo, pois não será inserida nenhuma bactéria neles e teoricamente não crescerá nada.

Colocar em todos os tubos tampões de algodão, tomando cuidado para não contaminá-los e deixá-contaminá-los em banho-maria à 37°C.

Questionário:

Qual o efeito de cada um dos compostos testados nas células de bactérias? Quais as concentrações recomendadas e por quê?

Como atua um controle negativo? Se houver crescimento de bactérias nele o experimento pode ser considerado válido?

Prática 4 –

Crescimento de colônias isoladas pelo método Streak Plates

(“estricar”) e diluição seriada

Objetivos:

Tentar isolar colônias monoclonais.

Materiais:

 Mistura de bactérias (tubo de ensaio contendo meio de cultura líquido LB e 5 tipos diferentes de bactérias), previamente preparada;

 Alça de platina;

 Meio de cultura líquido LB ( em tubos de ensaio);  Meio de cultura sólido LB ( em placas de petri);  Alça de Drigalski;

 Micropipeta

 Banho maria à 37°C

Procedimentos:

Técnica 1 – Streak plates (semeadura)

Estricar placas de petri contendo meio de cultura sólido LB .

Após o término da estricagem, armazenar em banho maria á 37° C. A técnica de Streak plates está descrita abaixo:

Com o auxílio de uma alça previamente esterilizada por flambagem, coletar uma porção de uma amostra biológica, de uma cultura bacteriana em meio de laboratório ou em suspensão em uma solução, depositar sobre um ponto da superfície do meio de cultura na placa e espalhar, com a alça, em três ou quatro setores, perpendiculares uns aos outros, de modos a se obter quantidades progressivamente menores do material contido na alça.

Essa técnica tem por objetivo a obtenção de colônias isoladas de bactérias em meio sólido. A obtenção de colônias isoladas permite a distinção de diferentes tipos bacterianos presentes no material analisado.

Técnica 2 - Diluição seriada

Retirar 1mL da mistura de bactérias com o auxílio de uma micropipeta;

Inserir essa amostra da mistura em um tubo de ensaio contendo 9mL de meio de cultura LB líquido e agitar.

Desse mesmo tubo recém infectado, retirar 1mL, utilizando a micropipeta e inserí-lo no próximo tubo de ensaio contendo 9mL de meio de cultura LB líquido e agitar.

Repetir esse procedimento até que se tenha 5 diluições. Como mostra a figura abaixo:

Deixar os tubos em banho-maria por 4 dias, à 37°C.

espalhar em uma placa de petri com meio de cultura LB sólido com o auxilio de uma alça de Drigalski.

Deixar as placas de petri em banho maria à 37°C.

Questionário:

Qual é a técnica mais eficiente para o isolamento de culturas isoladas de bactérias?

Se houver isolamento de colônias bacteriais em alguma placa de petri (pela técnica da diluição), calcule aproximadamente a quantidade de células bacteriais na mistura inicial de bactérias, considerando que cada colônia isolada é gerada a partir de uma única célula bacteriana.

Pratica 5 – Teste da catalase e do KOH

Objetivos:

Análise bioquímica referente à presença de catalase e classificação em Gram-positivas e Gram-negativas através de um meio alternativo que não a coloração Gram.

Materiais:

 KOH 3%;

 Peróxido de Hidrogênio;  Palitos de dente esterilizados;  Micropipeta;

 Placas de cultura com amostras de bactérias.

Procedimento:

Adicionar uma gota de peróxido de hidrogênio a cada uma das diferentes colônias bacterianas.e verificar a liberação de oxigênio.

Para o Teste de Gram Utilizando KOH 3% :

A uma cultura bacteriana adicionar uma gota de uma solução de KOH a 3% e homogeneizar com um palito estéril a amostra com a solução de KOH. Se após homogeneização, a solução formada for viscosa, formando-se um filamento quando se levanta o palito, a estirpe bacteriana em análise é Gram-negativa. Se não se formar o filamento a estirpe é Gram-positiva.

Questionário:

Explicar o princípio dos dois testes.

Prática 6: Método de Coloração de Gram e Morfologia Bacteriana

Objetivo:

Aplicar a coloração de Gram em lâminas com cultura bacteriana

Analisar por microscopia os diferentes tipos de bactérias e suas morfologias

Materiais:

e)3 lâminas para microscopia;



Bequer para descarte dos corantes;



Alça de Platina para esfregaço;



Culturas bacterianas já preparadas;



Solução de cristal violeta (já preparada);



Solução de lugol (já preparada);



Álcool 70%;

Procedimento:

1- Preparando as lâminas

Colocar uma gota de água destilada (Mili-Q) sobre uma das lâminas e, com a alça de

platina, tocar levemente uma cultura bacteriana e transferi-la para a lâmina.

Ainda com a alça, fazer um esfregaço em forma de círculo. Deixar secar.

Marcar o lado da lâmina que contém o esfregaço com uma caneta, e passar o lado que

não contém o esfregaço três vezes sobre a chama com o objetivo de fixar a cultura.

Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta por aproximadamente 1 minuto.

Lavar em água corrente e depois cobrir com solução de lugol também por

aproximadamente 1 minuto.

Deixar escorrer o excesso de lugol e, mantendo a lâmina inclinada, pingar álcool até

que não se desprenda mais o corante.

LAVAR IMEDIATAMENTE EM ÁGUA CORRENTE.

Cobrir o esfregaço com a solução de safranina (contra-corante) por aproximadamente

1 minuto. Lavar em água corrente e deixa-lá secar bem ao ar e/ou secar com papel

absorvente (não esfregar o papel na lâmina, apenas coloque-o por cima do material

fixado para absorver a umidade).

2- Observação e analise dos resultados via microscopia ótica

Levar a lâmina ao microscópio e prepare-a para a objetiva de 100x (não esquecer de

usar o óleo de imersão e limpar a objetiva após o uso).

forma (coccos, bacilos, etc...) e modo de agrupamento.

Questionário

g)Explicar o conceito do teste de Gram. Quais são as bactérias Gram-Positivas e

quais as Gram-Negativas?

h)Faça um esquema da parede celular das bactérias Gram-positivas e negativas,

usando esse esquema para explicar a questão 1.

i)Agora que vocês já fizeram o teste de Gram, compare os resultados com o teste

do KOH feito na outra prática. Qual a conclusão que o grupo chegou desses

resultados?

Prática 7 – Estrutura de locomoção

Objetivo:

Verificar presença de estruturas locomotivas nas bactérias.

Materiais:

 Placas de petri contendo colônias de bactérias;  Fio de platina;

 Tubos de ensaio;

 Meio de cultura LB semi-sólido em tubo em ensaio;  Meio de cultura LB sólido em placas de petri;  Bico de Bunsen;

 Banho maria à 37°C

Procedimento:

Flambar o fio de platina no bico de bunsen;

Esfriá-lo no meio de cultura e inserí-lo na cultura de bactéria para coletá-las;

Introduzir o fio de platina verticalmente e bem no centro de um tubo de ensaio contendo meio de cultura semi-sólido;

Flambar novamente o fio de platina para poder inserí-lo novamente em outra colônia; Após a inoculação de todos os tubos, armazená-los em banho-maria, à 37°C.

Questionário:

O que deve ser notado ao comparar tubos de ensaio contendo bactérias locomotoras com outras não locomotoras.

Prática 8 – Observação de fungos ao microscópio

Objetivos:

Inocular bactérias e fungos para a utilização nas próximas aulas.

Materiais:

 Placas de Petri contendo meio de cultura LB + àgar (5 para cada grupo);  Palitos de dente esterilizados;

 Bico de Bunsen;

 Placas de Petri contendo microorganismos.

Retirar das placas de Petri (dos experimentos anteriores), com um palito de dente, amostras de fungos SEMPRE próximo ao Bico de Bunsen;

Em três placas inocular amostras diferentes no centro de cada quadrante da placa; Guardar para a próxima aula (daqui uma semana).