Análise por RMN de produtos de degradação forçada em fármacos

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ANA CRISTINA ISLER

ANÁLISE POR RMN DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA EM FÁRMACOS

CAMPINAS 2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

ANA CRISTINA ISLER

ANÁLISE POR RMN DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA EM FÁRMACOS

ORIENTADOR: PROF. DR. ALVICLÉR MAGALHÃES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ORGÂNICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR ANACRISTINA ISLER, E ORIENTADA PELO PROF.DR. ALVICLÉR MAGALHÃES.

_______________________ Assinatura do Orientador

CAMPINAS 2014

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química

Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144

Isler, Ana Cristina,

Is4a IslAnálise por RMN de produtos de degradação forçada em fármacos / Ana

Cristina Isler. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.

IslOrientador: Alviclér Magalhães.

IslDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

Isl1. Produto de degradação. 2. Degradação forçada. 3. Ressonância magnética

nuclear. 4. Fármaco. 5. Teste de estresse de fármacos. I. Magalhães, Alviclér. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: NMR analysis of forced degradation products in drugs Palavras-chave em inglês:

Drug forced degradation Drug degradation study Nuclear magnetic resonance Drug

Drug stress testing

Área de concentração: Química Orgânica

Titulação: Mestra em Química na Área de Química Orgânica Banca examinadora:

Alviclér Magalhães [Orientador] Anita Jocelyne Marsaioli

José Dias de Souza Filho

Data de defesa: 01-10-2014

Programa de Pós-Graduação: Química

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

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“O mundo é visto segundo a cadeira em que estamos sentados” José Jaime Isler

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A meus grandes amores, por tanto amor. José Jaime Isler (in memoriam) Ana Maria Borin Isler (in memoriam)

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AGRADECIMENTOS

Ao meu pai José Jaime Isler e minha mãe Ana Maria Borin Isler pelos exemplos de retidão de caráter, pela fé inabalável na vida e no mundo, por terem me trazido até aqui e a todos os lugares.

Aos meus irmãos Silvio André Isler e David José Isler por serem meus primeiros e para sempre amigos. Obrigada por estarem sempre tão perto, ainda que tão longe.

As minhas irmãs Ivone Silva e Marianna Melo Isler pela acolhida e meus sobrinhos João Guilherme e André Luís pela razão.

A toda minha família por todo amor e força. O abraço mais forte nas mais que queridas Maria Sílvia Isler, Isabel Borin, Carmen Correia e Alessandra Sciamana, que são luzes nos meus dias mais escuros.

Ao Prof. Dr. Alviclér Magalhães pela orientação, ensinamentos e amizade. A todos os professores que estiveram em minha vida nessa jornada, em especial Prof. Dr. Cláudio Tormena pela ajuda e amizade.

A todas as amizades feitas nesse período, em especial Fabrício Naciuk, Rodrigo Cormanich e Thaís Mendonça pelo apoio.

A todos os amigos da Core e UNIFAG, em especial Fábio Barros, Gisele Denoni, Nilson Pereira, Diogo Baldim, Amanda Gomes, Roberta Izzo, Calissa Macedo, Daniela Nemer, Claudete Alves, Maira Zanin pelo apoio e compreensão.

A todos os amigos do CAEP, em especial, Daniele Hamamoto, Francesca Riccio, Patrícia Pissolatti e Sandra Souza pela força e compreensão.

Aos meus amados Cláudio Marquez, Lina Sayuri, Heloisa Villar e Milena Morita por serem meus irmãos do coração!

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CURRICULUM VITAE

Ana Cristina Isler

Dados Pessoais:

Brasileira, solteira, natural de Rio Claro, nascida em 21/10/1981.

Endereço Residencial: Rua Luiz Dionísio de Souza, nº 375. Torre 04. Apto 45. Jardim Myriam – Campinas/SP CEP: 13098-426.

Endereço Profissional: Rua José Geraldo Cerebino Christófaro, nº 245. Fazenda Santa Cândida

– Campinas/SP CEP: 13087-567.

Endereço eletrônico: anacrisler@yahoo.com.br.

Formação Acadêmica: Farmacêutica.

08/2010 _{– Presente: Mestrado em Química Orgânica. Universidade Estadual de Campinas}

(UNICAMP), sob orientação do Prof. Dr. Alviclér Magalhães.

03/2004 – 12/2005: Habilitação Farmácia Industrial, Universidade Estadual de Maringá. 03/2000 _{– 12/2003: Graduação em Farmácia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.}

Cursos:

 “Técnicas de Análise Ambiental e Segurança Alimentar por Espectrometria” - 3º Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas - 2009.

 “Introdução a Instrumentação para RMN” - XII Jornada Brasileira de Ressonância Magnética’ - 2012.

 “Understanding NMR Spectroscopy” Instituto de Química – UNICAMP - 2013.

Eventos:

 3º Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas - 2009.  35ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química 2012.  XII Jornada Brasileira de Ressonância Magnética 2012.

Trabalhos:

 “Análise dos produtos de degradação forçada de rosuvastatina via RMN” - 35ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química 2012.

xiv

 “Análise de misturas utilizando RMN e pulsos seletivos” - XII Jornada Brasileira de Ressonância Magnética 2012.

Artigo Publicado:

 SANTO, RDE; SIMAS, R. C.; MAGALHAES, A; SANTOS, V. G.; REGIANI, T.; ISLER, A. C.; MARTINS, NG; EBERLIN, M.N.; GONZÁLEZ, E R P; Experimental NMR and MS study of benzoylguanidines. Investigation of E/Z isomerism, 04/2013, Journal of Physical Organic Chemistry (Print), Vol. 26, Fac. 4, pp.315-321, West Sussex, REINO UNIDO, 2013.

Experiência Profissional:

 CAEP _{– Centro Avançado de Estudos e Pesquisa – 02/2012 até o presente momento.} Área: Etapa Analítica de Bioequivalência. – Analista de Espectrometria de Massas: Desenvolvimento de metodologia analítica e atualmente coordenação do laboratório.  Core Clinical Research – 06/2008 até 12/2011. Área: Etapa Analítica de Bioequivalência.

– Assessora de Desenvolvimento Analítico: Desenvolvimento de metodologia analítica e coordenação da equipe de analistas do laboratório.

 UNIFAG _{– Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia – 04/2006 até} 05/2008. Área: Etapa Analítica de Bioequivalência. – Analista de Laboratório: preparo de amostras.

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RESUMO

ANÁLISE POR RMN DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA EM FÁRMACOS

A degradação forçada ou teste de estresse é uma boa estratégia para demonstrar as rotas de degradação e os produtos formados durante a estocagem do fármaco ou do produto formulado. O principal objetivo desse teste é demonstrar a especificidade dos métodos indicativos de estabilidade.Trata-se de ensaios que visam desafiar e confirmar a especificidade e seletividade da metodologia analítica empregada na quantificação do princípio ativo presente no medicamento e na manutenção dessas características ao longo do estudo de estabilidade.

É comum o emprego de métodos cromatográficos na indústria farmacêutica para análise de impurezas que trabalham através da coinjeção de padrões de referência. Esta é uma tarefa simples quando se tratam de produtos de degradação conhecidos e disponíveis em suas formas puras. Entretanto, quando se trata de um medicamento novo, com perfil de degradação ainda não estabelecido, a técnica de ressonância magnética nuclear (RMN) pode facilitar essa investigação por sua versatilidade em relação aos meios utilizados nas análises e ao preparo da amostra. A RMN é uma técnica analítica não focada em um único alvo, por isso as análises proporcionam identificação abrangente das espécies químicas detectáveis em uma amostra complexa.

Considerando que o meio reacional de degradação de um fármaco deve consistir de uma mistura de compostos, esse trabalho foi realizado na tentativa de elucidar estruturalmente os produtos de degradação do fármaco rosuvastatina em diferentes meios de reação, resolvendo sempre que possível e necessário o problema de sobreposição de sinais, através de espectros bidimensionais e sequências de pulso para detecção seletiva, aumentando a sensibilidade e resolução espectral.

xvii

ABSTRACT

NMR ANALYSIS OF FORCED DEGRADATION PRODUCTS IN DRUGS

Forced degradation or stress testing is a good strategy to show the routes of degradation and products formed during storage of the drug or the formulated product. The main objective of this test is to demonstrate the specificity of indicative methods of stability. These are tests that aim to challenge and confirm the specificity and selectivity of the analytical methodology used to quantify the active ingredient present in the product and maintenance of the characteristic along the stability study.

It is common to use chromatographic methods in the pharmaceutical industry for the analysis of impurities working through co injection of assay standards. This is a simple task when dealing with known and available degradation products in their pure forms. However, when it comes to a new product with degradation profile is not yet established, the technique of nuclear magnetic resonance (NMR) can facilitate such research for their versatility on the resources used in the analysis and sample preparation. NMR is a non-targeted analytical technique therefore analyzes provide comprehensive identification of detectable chemical species in a complex sample.

Whereas the reaction medium of degradation of a drug should consist of a mixture of compounds, this work was undertaken in an attempt to elucidate the structural degradation products of rosuvastatin drug in different reaction media, whenever was possible and necessary two-dimensional spectra and pulse sequences with selective detection were used to solve the problem of overlapping signals, increase sensitivity and spectral resolution.

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SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...XXI

LISTA DE TABELAS...XXIII

LISTA DE FIGURAS...XXV

1 INTRODUÇÃO ... 3

1.1 Produtos de degradação em medicamentos ... 3

1.2 Ressonância Magnética Nuclear ... 11

1.2.1 Spin Nuclear ... 11

1.2.2 Pulso de RF ... 17

1.2.3 O Sinal de RMN ... 18

1.2.4 Deslocamento químico ... 19

1.2.5 RMN, Sensibilidade e Resolução de Sinais ... 21

2 OBJETIVO ... 37

3 EXPERIMENTAL ... 41

3.1 Preparo de amostras: ... 41

3.2 Análises de RMN ... 43

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47

4.1 Tratamento com Ácido Clorídrico Deuterado: ... 54

4.2 Tratamento com Hidróxido de Sódio Deuterado ... 74

4.3 Tratamento com água deuterada sob refluxo: ... 80

4.4 Tratamento com peróxido de hidrogênio à temperatura ambiente: ... 83

5 CONCLUSÃO ... 87

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 91

ANEXO ... 97

xx

xxi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

 ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária;  AQ – Acquisition Time (Tempo de Aquisição);  CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;

 COSY – Homonuclear Correlation Spectroscopy (Espectroscopia de Correlação Homonuclear);

 COLOC - Correlation Spectroscopy for Long-range Couplings (Correlação de Acoplamento Heteronuclear à Longa Distância);

 DFT – Density Functional Theory (Teoria do Funcional da Densidade);  DNP – Dynamic Nuclear Polarisation (Polarização Nuclear Dinâmica);  FID - Free Induction Decay (Decaimento da Indução Livre);

 HETCOR - Heteronuclear Correlation Spectroscopy (Correlação de Acoplamento Heteronuclear);

 HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Correlação Heteronuclear via Múltiplas Ligações);

 HMQC - Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (Correlação Heteronuclear de Múltiplo Quantum);

 HSQC – Heteronuclear Single Quantum Coherence (Correlação Heteronuclear de Quantum Simples);

 CT-HMBC - Constant time Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Correlação Heteronuclear via Múltiplas Ligações de Tempo Constante);  LC-MS – Espectrometria de Massas Acoplada à Cromatografia Líquida;  NOE – Nuclear Overhauser Enhancement (Efeito Nuclear Overhauser);  NOESY - Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy (Espectroscopia

de Amplificação Nuclear de Overhauser);  PDA - Photodiode Array (Arranjos de Diodos);  RE – Resolução;

 RDC – Resolução da Diretoria Colegiada;  RF – Radiofrequência;

xxii  RMN – Ressonância Magnética Nuclear;

 RMN de 1_{H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio;}

 RMN de 13_{C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13;}

 SW – Spectral Width (Janela Espectral);

 TD – Time Domain - Size of FID (Número de pontos do FID);  TF – Fourier Transform (Transformada de Fourier);

 TOCSY - Total Correlation Spectroscopy (Espectroscopia Total de Correlação Homonuclear);

xxiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Necessidade de notificação, identificação e qualificação de produtos de

degradação segundo a dose diária.13 _{... 6} Tabela 2– Núcleos atômicos e seus respectivos spins. ... 13

Tabela 3 - Resumo das condições utilizadas nos preparos de amostra. Destacado

o objetivo final para cada tipo de tratamento da amostra. ... 42

Tabela 4 - Atribuição dos sinais dos espectros de RMN de 1H e 13_{C da}

rosuvastatina (s: singleto, d: dubleto, dd: dubleto de dubleto, h: hepteto e m: multipleto). ... 49

xxv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fluxograma das condições neutras de degradação (Adaptado de Singh

& Bakshi, 2000). ... 8

Figura 2 - Fluxograma das condições ácidas ou básicas de degradação (Adaptado

de Singh & Bakshi, 2000). ... 8

Figura 3 - Fluxograma das condições oxidantes de degradação (Adaptado de

Singh & Bakshi, 2000) ... 9

Figura 4 – Similaridade entre um núcleo, momento angular (Sul-Norte) girando a uma frequência angular ω e uma pequena barra magnética com suas linhas de campo (B). ... 12

Figura 5 - À esquerda representação vetorial do torque (em função do raio (r) e

da força (F). À direita força gerada por um torque. ... 13

Figura 6 – Valores da energia de um núcleo com momento magnético μ em um campo magnético B0. ... 15 Figura 7 – Vários spins representados pelo vetor magnetização resultante. ... 17

Figura 8 - À esquerda pulso de 90° e à direita pulso de 180°. ... 18 Figura 9 - Geração de um campo magnético induzido devido à presença de um

campo magnético aplicado e ao movimento eletrônico. ... 19

Figura 10 - No topo é mostrado o espectro quando usado o hard pulse. Ao centro

há uma representação do padrão de excitação quando o transmissor é colocado em ressonância com apenas uma linha e a força do campo RF é reduzida, resultando que os picos distantes do offset são atenuados como mostra o espectro inferior. (Fonte: Adaptado de: Keeler, 2005). ... 27

Figura 11 - Sequência de pulsos do experimento gs-TOCSY seletivo. a) Pulsos

duros de 90° e 180°, pulso Gaussiano de 180°. b) Três gradientes formatados sinusoidais, sem ciclização de fases. c) e d) Rota de coerência excitada e não excitada (respectivamente) do experimento. (Fonte: Adaptado de: Chernysh et al., 2005). ... 28

Figura 12 - A amostragem dos sinais (a) e (b) obedecem a Condição de Nyquist.

xxvi

então é adquirido incorretamente como se o sinal estivesse a uma frequência menor. (Fonte: Adaptado de: Clarige, 2009) ... 30

Figura 13 - Esquema geral de experimentos de RMN de 2D. ... 32 Figura 14 - Sequência de pulsos do CT-HMBC seletivo de tempo constante. As

barras estreitas indicam pulsos de 90° e as barras largas pulsos de 180°. O pulso seletivo no canal do 13_{C está na forma de meio-seno. Todas as fases de pulso}

estão em x. O intervalo Δ1 é para a evolução de nJCH e Δ2 é igual a t1(máx)/2. Como

t1 é incrementado, os períodos (Δ2 - t1/2) são decrementados para que o período

ΔCT permaneça constante. Pulsos de gradiente são aplicados na razão 3:-5:4,01

para 13_C.33 _{... 33} Figura 15 - Espectro de RMN de 19F da rosuvastatina em DMSO-d6 a 564,72 MHz

antes da degradação forçada. ... 47

Figura 16 – Estrutura química da rosuvastatina. ... 48

Figura 17 - Espectro de RMN de 1H da rosuvastatina em DMSO-d6 a 600,17 MHz

antes da degradação forçada. ... 50

Figura 18 - Espectro de RMN de 13C da rosuvastatina em DMSO-d6 a 100,61 MHz

antes da degradação forçada. Em destaque na parte superior os sinais dos dubletos dos C18, C15, C16 e C17 com os respectivos acoplamentos 13C-19F (em Hz) J = 247,6; J = 2,7; J = 8,2 e J = 21,7. ... 51

Figura 19 - Espectro de RMN de 2D HSQC 1H-13C da rosuvastatina em DMSO-d6

a 400,13 MHz antes da degradação forçada com o assinalamento das correlações indicados na estrutura química. ... 52

Figura 20 - Espectro de RMN de 2D HMBC 1_H-13_{C da rosuvastatina em DMSO-d} 6

a 400,13 MHz antes da degradação forçada com o assinalamento das correlações indicados na estrutura química.. ... 53

Figura 21 - Espectro de RMN de 1H da amostra após degradação com DCl 0,1 M/12 h, sob refluxo. Eclipse da ampliação da região de H19 e H20 da rosuvastatina (RV) e produto de degradação (PD) (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz).

... 55

Figura 22 - Espectro de RMN de 19F da amostra após degradação com DCl 0,1 M/12 h, sob refluxo. (Em DMSO-d6 a 600,17 MHz). ... 56

xxvii

Figura 23 - Expansão do espectro de RMN de 1H da região de H7 da molécula de rosuvastatina. Superior: amostra íntegra em DMSO-d6 a 400,13 MHz. Inferior:

após degradação com DCl 0,01M/3h, sob refluxo (Em DMSO-d6 a 600,17 MHz). 57 Figura 24 - Espectros de RMN de 19F com a integração dos sinais da amostra após degradação com DCl 0,01 M/3 h, sob refluxo. (Em DMSO-d6 a 470,34 MHz).

... 58

Figura 25 - Espectro de RMN 1H de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h com expansões de regiões de sinais sobrepostos. (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz). ... 60 Figura 26 - Espectro de RMN 13C de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h com expansões de regiões de sinais de PD próximos à sinais de RV. (Em DMSO-d6 a

100,61 MHz). ... 61

Figura 27 - Espectro superior: RMN de 1H da RV após DCl 0,01 M, sob

refluxo/3h. Subespectros a-g: TOCSY seletivos da RV com irradiação dos hidrogênios descritos na estrutura molecular. (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz). ... 63 Figura 28 - Espectro superior: RMN de 1H da RV após DCl 0,01 M, sob refluxo/3h. Subespectros a-i: TOCSY seletivos do PD com irradiação dos hidrogênios descritos na estrutura molecular (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz).. ... 64 Figura 29 - Espectro de RMN de 2D HMBC 1H-13C de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h com expansões de regiões de correlações sobrepostas (à esquerda) e com resolução suficiente para atribuição do deslocamento químico (à direita)... 66

Figura 30 - Dois espectros de RMN de 2D HMBC 1H-13C de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h sobrepostos. Para ambos a mesma janela espectral na dimensão do 1_{H. Espectro adquirido com janela espectral de 180 ppm, com centro em 100}

ppm e resolução de 35,37 Hz, sobreposto com a imagem (retângulo rosa) do espectro adquirido com janela espectral de 40 ppm, com centro em 100 ppm e resolução de 7,86 Hz. As setas apontam para as únicas correlações de frequência coincidentes em ambos os espectros. ... 67

Figura 31 - Projeções dos domínios de 13C: Sinais largos: Espectros de RMN de 2D HMBC 1_H-13_{C. Sinais finos: CT- Espectros de RMN de 2D HMBC} 1_H-13_{C. ... 68} Figura 32 – Espectros de RMN de 2D: HMBC 1_H-13_{C, na dimensão do} 13_{C: TD}

xxviii

Figura 33 - Espectros de RMN de 2D: HMBC 1H-13C, na dimensão do 13C: TD 128, SW 220ppm, O2P 110ppm, Resolução 259,4 Hz. NS 2. ... 70

Figura 34 - Reação de esterificação da molécula de RV. ... 71 Figura 35 - Espectro de massas com ionização por electrospray. Superior: ESI

modo positivo com destaque para a forma protonada, para os correspondentes adutos de sódio e de potássio, e para a perda de uma molécula de água. Inferior: ESI modo negativo com destaque para a forma deprotonada e para a perda de uma molécula de água. ... 72

Figura 36 - Estruturas moleculares da atorvastatina (esquerda) e fluvastatina

(direita). ... 73

Figura 37 - Espectro de 1H da amostra após degradação com NaOD 1 M/12 h, sob refluxo com expansão da região de H7 da RV. ... 75

Figura 38 - Espectro de massas com ionização por electrospray modo positivo.

Superior: destaque para a forma protonada, e outras formas que se acreditar serem isótopos da Rosuvastatina. Inferior: destaque para perda do grupo metilsulfanila e para a perda de uma molécula de água. ... 76

Figura 39 - Mecanismo de reação proposto para perda do grupo metilsulfanila em

meio básico. ... 77

Figura 40 - Expansões da região de H20 nos espectros de 1H da amostra: a) em DMSO-d6, b) em NaOD 0,001 M e analisada imediatamente, a) em DMSO-d6, b)

em NaOD 0,001 M e analisada imediatamente, c) em NaOD 0,01 M e analisada após 1,5 h, d) após refluxo com NaOD 0,1 M/8 h. com NaOD 0,1 M/8 h. ... 78

Figura 41 - Expansão da região em 3,49 ppm do espectro de 2_{H. ... 79} Figura 42 - Expansões da região de H20 nos espectros de 1_{H da amostra de RV}

sob refluxo em D2O por: a) 0 h, b) 12 h, c) 24 h, d) 48 h, e) 72 h. ... 81 Figura 43 – Os espectros superiores de 1_{H antes de tratamento térmico. Os}

espectros do meio são da amostra sob refluxo em D2O por 12h. O espectro inferior

é o de deutério. À direita as ampliações dos espectros da esquerda na região de H20. ... 82

xxix

Figura 45 - Espectros de 1H a 300 MHz dos sinais de N-metil em um derivado de azapropazona em função da temperatura. De baixo para cima: 50°C, 30°C, -20°C, -10°C e 0°C.41 ... 99

Figura 46 - Decomposição do sinal já coalescido (linha espessa) nas duas

transições individuais (linha fina) que representam dois sítios igualmente povoados. As transições são distorcidas em fase e largura de linha, que podem ser descritas em um valor complexo de probabilidade de transição e frequência.41

1

3

1 INTRODUÇÃO

1.1 Produtos de degradação em medicamentos

Os produtos de degradação são um importante tipo de impureza encontrada em medicamentos e podem ter origem na degradação do fármaco durante a estocagem, transporte ou mesmo no decorrer da formulação. Alterações químicas e modificações nas características organolépticas de um medicamento são causadas por agentes ambientais como exposição à luz e ao ar, calor e umidade, culminando em possíveis produtos de reação tóxicos ou na perda da eficácia do medicamento.1,2 Por isso, o método indicativo da estabilidade de medicamentos deve ser específico e seletivo para quantificar o princípio ativo na presença de produtos de degradação e excipientes e também deve ser capaz de analisar os produtos de degradação sem que haja interferência no método pelos princípios ativos e excipientes.3

A degradação forçada ou teste de estresse é uma boa estratégia para demonstrar as rotas de degradação e os produtos formados durante a produção e estocagem do fármaco ou do produto formulado. O principal objetivo desse teste é demonstrar a especificidade dos métodos indicativos de estabilidade.4 Tratam-se de ensaios que visam desafiar e confirmar a especificidade e seletividade da metodologia analítica empregada na quantificação do princípio ativo presente no medicamento e na manutenção dessas características ao longo do estudo de estabilidade. Nos últimos anos, a pesquisa de produtos de degradação em fármacos tem sido um tema bastante explorado, após o surgimento de guias e resoluções publicadas por órgãos regulatórios.5,6,7,8

No exterior, há algum tempo, estes testes já são exigidos através de diretrizes que obrigam os laboratórios fabricantes de matéria-prima ou produto acabado farmacêutico a apresentarem as documentações necessárias para assegurar a identidade, potência, qualidade e pureza do princípio ativo no momento de submissão do registro de um produto, sendo que as submissões

4

devem listar as impurezas e atender aos critérios de aceitação estabelecidos nas especificações para substâncias medicamentosas.6,7,9

No Brasil o tema produtos de degradação em medicamentos é bem mais recente que no exterior e as indústrias farmacêuticas, que se adéquam às necessidades estabelecidas pelas diretrizes, ainda não são devidamente cobradas pelos órgãos fiscalizadores. A Resolução RE 899 de 2003 “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos”, no item que trata da comprovação de especificidade das análises de teor dos produtos de degradação, já exige a comparação dos resultados obtidos de amostras (fármaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impureza e amostras não contaminadas, para demonstrar que o teste não é afetado por esses materiais. Quando os padrões dos produtos de degradação não estiverem disponíveis, essa RE determina que os resultados podem ser comparados com os resultados dos testes de amostras contendo os produtos de degradação com um segundo procedimento validado que inclua amostras degradadas forçadamente.10

Em 2005, a ANVISA publicou a RE n°1, “Guia para a realização dos estudos de estabilidade”, determinando que estes estudos devam contemplar a quantificação dos produtos de degradação assim como o método analítico correspondente.8 A complexidade da exigência gerou em 2008 o Informe Técnico n°1, que indicava como e em quais condições os estudos de estresses em medicamentos deveriam ser conduzidos para obtenção dos produtos de degradação. Entretanto nesta norma a ANVISA não considerou as diferenças estruturais químicas que os princípios ativos dos medicamentos possuem e que as condições definidas poderiam levar à completa degradação do ativo. O Informe Técnico n°1 também determinava limites para que as impurezas formadas fossem notificadas, identificadas e qualificadas.11 _{Ao estabelecer prazos para que esses}

procedimentos fossem colocados em prática pelas indústrias, a ANVISA gerou uma série de questionamentos que culminaram na revogação do informe no mesmo ano de 2008.

Visando a elaboração de uma Resolução que normatizasse os estudos de estabilidade em medicamentos no Brasil, a ANVISA publicou a Consulta Pública

5

n°11 de 2012 estabelecendo os parâmetros para verificação de produtos de degradação em medicamentos.12 A Consulta Pública deu origem à Resolução RDC n°58 de 2013 que “Estabelece parâmetros para a notificação, identificação e qualificação de produtos de degradação em medicamentos com substâncias ativas sintéticas e semissintéticas, classificados como novos, genéricos e similares”. Esta resolução define degradação forçada como o estudo que permite a geração de produtos de degradação através da exposição dos fármacos e medicamentos às condições de estresse como luz, temperatura, calor, umidade, hidrólise ácida/básica e oxidação. As empresas ficam obrigadas a apresentar estes estudos nos moldes da legislação, ou justificar a ausência deles se houver alguma característica inerente à amostra que os impossibilite. Os testes devem degradar o fármaco em concentração suficiente (mínimo 10%) para promover o suporte para o desenvolvimento e validação da metodologia de análise dos produtos de degradação formados e para análise crítica do perfil de degradação do medicamento, que por sua vez deve promover a verificação da pureza cromatográfica do pico do insumo farmacêutico e a avaliação dos fatores que comprometem a estabilidade do medicamento. Considerando o limite de identificação o valor acima do qual um produto de degradação deverá ter sua estrutura química identificada, limite de notificação o valor acima do qual um produto de degradação deverá ser reportado no estudo de estabilidade e limite de qualificação o valor acima do qual um produto de degradação deverá ser avaliado biologicamente; o estudo de degradação forçada possibilitará que os métodos indicativos de estabilidade possam enquadrar os produtos de degradação nas necessidades de notificação, identificação e qualificação da Tabela 1.13

6

Tabela 1 - Necessidade de notificação, identificação e qualificação de produtos de

degradação segundo a dose diária.13

A RDC n°58 encontra grande relevância no panorama do mercado de medicamento no Brasil, que além de ter os genéricos respondendo por 25,6% das vendas, ainda prevê investimentos até 2014 de 1,5 bilhão de dólares, visando o vencimento das validades das patentes de vários medicamentos de marca de sucesso, deixando um total de US$ 30 bilhões em vendas anuais suscetíveis à concorrência dos genéricos.14

As exigências da RDC nº58 entram em vigor em dezembro de 2015, o que faz com que as indústrias tenham pressa no delineamento dos testes de degradação forçada que ainda é um tema muito controverso, pois nenhum órgão regulatório determina claramente quais melhores práticas para conduzi-los, visto a dependência das características do fármaco e do medicamento, cabendo à empresa fabricante garantir a detecção das impurezas nos produtos.4,13,15

A escolha das condições para degradação forçada determina os efeitos causados pela variação da temperatura, umidade, oxidação, fotólise e hidrólise em

7

ampla faixa de pH. A hidrólise forçada é importante à medida que a água é considerada um dos principais catalisadores em reação de degradação e muitos fármacos são instáveis nesse meio. Devem-se utilizar no teste condições fortemente ácida e básica, pois em pH 7 demandar-se-ia muito tempo e altas temperaturas. Também a oxidação é uma das reações mais significativas em drogas na presença de oxigênio molecular; pode-se no experimento utilizar uma faixa de concentração de 1 a 30% de peróxido de hidrogênio, o mais popular agente oxidante para esse propósito. Quanto à fotólise, ocorre devido à absorção de energia pela molécula e é importante, pois a radiação ultravioleta é capaz de clivar alguns tipos de ligações e, portanto promover uma série de reações na molécula de fármaco.16

Na ausência de procedimentos padronizados para a realização dos estudos de degradação forçada dificuldades são enfrentadas pelos profissionais ao decidir sobre as condições de estresse a serem utilizadas para os fármacos. Alguns estudos propõem um sistema assumindo que o fármaco seja instável, portanto, deve estar sujeito a condições mais amenas. Dependendo dos resultados obtidos, aumenta-se ou diminui-se a concentração dos reagentes, temperatura ou o tempo de exposição às condições de reação utilizada, obtendo-se assim esquemas como os das Figuras 1, 2 e 3 que representam tipos de fluxogramas propostos para que se alcancem condições ideais de degradação em meio neutro, ácido ou básico e oxidante respectivamente.17

8

Figura 1 - Fluxograma das condições neutras de degradação (Adaptado de Singh

& Bakshi, 2000).

Figura 2 - Fluxograma das condições ácidas ou básicas de degradação (Adaptado

de Singh & Bakshi, 2000). H2O; 12h; Refluxo Sem Degradação H₂O; 1 dia; Refluxo H2O; 2 dias; Refluxo H2O; 5 dias; Refluxo Considerar o fármaco praticamente estável Aceito Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente H2O; 8h; 40 C Degradação Total H2O; 2h; 25 C Conduzir os testes em condições mais brandas Degradação Suficiente HCl/NaOH 0,1 M; 8h; Refluxo Sem Degradação HCl/NaOH 1 M; 12h; Refluxo HCl/NaOH 2 M; 24h; Refluxo HCl/NaOH 5 M; 24h; Refluxo Considerar o fármaco praticamente estável Aceito Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente HCl/NaOH 0,01 M; 8h; à 40 C Degradação Total HCl/NaOH 0,01 M; 2h; à 25 C Conduzir os testes em condições mais brandas Degradação Suficiente

9

Figura 3 - Fluxograma das condições oxidantes de degradação (Adaptado de

Singh & Bakshi, 2000)

Devido às exigências de separação de múltiplos componentes na mesma amostra nos estudos de estabilidade, análises cromatográficas normalmente são inerentes a todos os métodos desse tipo de ensaio, por isso a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido amplamente empregada nos estudos de estabilidade devido à alta resolução, sensibilidade e especificidade.15 É um dos itens da RDC nº58 a necessidade da utilização de cromatografia nos estudos de estabilidade, a medida que a RDC exige a chamada ”pureza dos picos cromatográficos”.13

Os métodos cromatográficos tradicionalmente empregados na indústria farmacêutica para análise de impurezas, seja cromatografia líquida ou gasosa, trabalham através da co injeção de padrões de referência. Quando a CLAE é empregada com o detector UV-Vis, este é ajustado no comprimento de onda máximo das substâncias conhecidas ou no comprimento de onda onde todos os componentes apresentem boa absorbância, então é imprescindível conhecer o comprimento de onda do fármaco e dos produtos de degradação em diferentes solventes e em diferentes faixas de pH. Esta é uma tarefa simples quando se tratam de produtos de degradação conhecidos e disponíveis em suas formas puras. Entretanto, quando se trata de um medicamento novo ou um medicamento

H2O2 3%; 6h; Temp. Ambiente Sem Degradação H₂O2 3%; 24h; Temp. Ambiente H2O2 10%; 24h; Temp. Ambiente H2O2 30%; 24h; Temp. Ambiente Considerar o fármaco praticamente estável Aceito Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente Degradação Suficiente H2O2 1%; 3h; Temp. Ambiente Degradação Total H2O2 1%; 30 min; Temp. Ambiente Conduzir os testes em condições mais brandas Degradação Suficiente

10

cuja patente esta vencida, com perfil de degradação ainda não estabelecido, basear-se no comprimento de onda máximo do fármaco, pode representar um problema. Neste último caso, pode-se recorrer aos estudos de degradação forçada e conduzir a análise utilizando o detector photodiode array (PDA), para obtenção do espectro UV-Vis dos componentes, conforme eles são separados através da fase estacionária no sistema cromatográfico. Nos casos em que são formados produtos de degradação sem grupos cromóforos, ou com peso molecular muito baixo, pode-se fazer uso de um sistema LC-MS. Quanto aos cromatogramas obtidos, os tempos de retenção, ou os tempos de retenção relativos devem sofrer uma análise mais rigorosa quando forem muito próximos e quando o PDA ou o LC-MS demonstrar haver co-eluição de substâncias. Neste caso um método cromatográfico novo deverá ser estabelecido a fim de separa-las. Além disso, a análise do fármaco ou dos produtos de degradação requer que eles sejam solúveis nos solventes compatíveis à CLAE para estabelecimento da fase móvel adequada e as amostras devem ser tratadas para preservação da coluna cromatográfica, principalmente quando essas amostras estão em meios ácidos ou básicos fortes, necessitando de neutralização antes da análise. A técnica de ressonância magnética nuclear (RMN) é versátil em relação aos solventes utilizados nas análises porque não é uma técnica dependente de uma matriz sólida. Por isso, a RMN tem se tornado uma aliada dos métodos convencionais para os estudos de produtos de degradação.18,19,20

Atualmente a quantificação de produtos de degradação de estrutura química desconhecida é realizada através da curva de calibração do próprio ingrediente ativo do medicamento, ou de substâncias relacionadas. Isto é realizado considerando que o composto desconhecido tem a estrutura química muito semelhante ao ingrediente ativo, devido à análise dos dados de UV/Vis. O analito, neste caso é diluído em concentrações bem inferiores às concentrações utilizadas na quantificação do ingrediente ativo, pois não se pode assegurar a ampla faixa linear entre a concentração do fármaco e dos produtos de degradação. Entretanto, sabe-se que o melhor mesmo seria construir uma curva de calibração com o analito correto, tarefa esta que demanda muito mais trabalho

11

e gastos às indústrias que necessitam estar equipadas e preparadas com uma tecnologia de identificação de moléculas.

A dificuldade das indústrias de medicamentos em desenvolver metodologias utilizadas para estabelecimento dos perfis de degradação faz parte da cultura das organizações. As metodologias não são adaptadas tão rapidamente quanto os produtos são desenvolvidos, registrados e colocados à venda. A alta competitividade da área faz com que o tempo seja um dos mais críticos fatores de um projeto. Por isso, a espectroscopia de RMN tem demonstrado um papel importante relativo aos perfis de impurezas em fármacos em vários aspectos. O desenvolvimento e avanços promissores no campo da metabolômica em que é possível detectar as variações entre amostras e dessa forma caracterizar biomarcadores em biofluidos sem a necessidade de uma separação prévia, é um exemplo, cujo o mesmo conceito pode ser aplicado aos perfis de impurezas em fármacos ou formulações vindos de diferentes fontes. Além disso, com relação à quantificação, grandes avanços têm sido realizados na sensibilidade e precisão do processamento de sinais, bem como nos protocolos de validação dos processos, tornando a RMN uma ferramenta quantitativa importante, baseado no fato de ser esta uma técnica de análise primária.21

1.2 Ressonância Magnética Nuclear

A Ressonância Magnética Nuclear estuda a interação da radiofrequência (RF) com a matéria quando esta última é submetida a um campo magnético. Trata-se de um método perturbativo, ou seja, irradia-se a matéria, perturbando-se o equilíbrio e então se mede o efeito gerado após tal perturbação.

1.2.1 Spin Nuclear

Em um campo magnético, sob determinadas condições, uma amostra pode, quando irradiada, absorver radiação eletromagnética na região de

12

radiofrequências. Essa absorção é função direta dos tipos de núcleos presentes nas moléculas que compõem a amostra. A propriedade física que esses núcleos possuem e que possibilita que eles sejam alvo do estudo por RMN é conhecida como spin nuclear. Devido a sua configuração nuclear certos núcleos atômicos possuem um comportamento característico de momento angular magnético o qual é capaz de interagir diretamente com campos magnéticos (Figura 4).

Figura 4 – Similaridade entre um núcleo, momento angular (Sul-Norte) girando a uma frequência angular ω e uma pequena barra magnética com suas linhas de

campo (B).

O momento angular de uma partícula em movimento é uma grandeza fundamental em mecânica, normalmente associado à rotação e à translação desta partícula. No caso específico onde existe uma rotação ao redor de seu próprio eixo esta rotação pode ser associada a sua massa e velocidade angular.

O momento magnético ou momento de dipolo magnético de um elemento pontual (por exemplo, o núcleo) é definido como sendo um vetor que em presença de um campo magnético (outra grandeza vetorial) produz um torque () no ponto onde se situa este elemento. A Figura 5 representa o vetor torque em função da distância radial e da força exercida.

13

Figura 5 - À esquerda representação vetorial do torque (em função do raio

(r) e da força (F). À direita força gerada por um torque.

Os núcleos apresentam momentos magnéticos e angulares μ e J

respectivamente que são paralelos entre si e respeitam a expressão , onde é o fator giromagnético (normalmente em rad T-1 s-1) e representa a constante que liga o momento angular ao momento magnético ( , onde

, onde e é a carga e M é a massa do próton. O símbolo é conhecido como fator g nuclear). O momento angular J é definido por onde I é denominado momento angular de spin, número quântico de momento angular de spin, ou simplesmente spin nuclear, cujo valor pode ser números inteiros ou semi-inteiros e é a constante de Planck. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de núcleos atômicos e seus respectivos spins nucleares.

Tabela 2– Núcleos atômicos e seus respectivos spins.

Núcleo 1_H 2_H 12_C 13_C 14_N 15_N

Spin, I 1/2 1 0 1/2 1 1/2

Núcleos que possuem número atômico (Z) e número de massa (A) pares, por exemplo, o 12C6 e o 16O8, sempre apresentam I nulo e por isso não são

mensuráveis em RMN. Núcleos que têm Z ímpar e A par, por exemplo, o 14N7 e o 2_H

1, possuem I inteiro. Núcleos que possuem A ímpar possuem I=1/2, I=3/2 ou

14

Quando núcleos isolados estão sob a ação de um campo magnético, a energia de interação do momento magnético μ com o campo magnético B é dada

por:

. (1)

Considerando B com magnitude B0 e alinhado ao longo da direção z,

obtém-se o hamiltoniano que governa esse fenômeno:

. (2)

Como resultado deste hamiltoniano encontram-se os possíveis níveis de energia:

(3)

onde e é denominada Frequência de Larmor.

O desdobramento nos níveis de energia é denominado efeito Zeeman. Para I=1/2, o número quântico direcional mI pode ser -1/2 e +1/2. Como mostra a Figura

6, quando esses núcleos são colocados em um campo magnético os estados energéticos α e β antes degenerados tornam-se distinguíveis, efeito Zeeman, e pode-se associar a cada um destes estados um valor discreto de energia que pode ser obtido pela relação:

e . (4)

B

E







I

B











2

1

B

E







_

2

1

B

E















B

m



m

E









15

Figura 6 – Valores da energia de um núcleo com momento magnético μ em um campo magnético B0.

Dessa forma a diferença de energia entre os dois níveis é dada por:

. (5)

Usando-se as relações de Bohr e Planck da Eq. 6 na Eq. 5:

(6)

obtém-se a equação fundamental da RMN da Eq. 7.

ou . (7)

O que significa que quando se aplica uma frequência em um núcleo contido em um campo magnético B0 é possível excita-lo alterando seu momento

magnético. Assim, a frequência de excitação usada em um espectrômetro de RMN é dependente do campo magnético aplicado. Por exemplo, para que núcleos de

(

α)

(

β)







2

B



B

E

E

E













E

E

E

h











B

h

E













16

1_{H entrem em sintonia (ressonância) com a frequência utilizada em um campo de}

9,4T é necessário irradia-los com radiofrequência da ordem de 400 MHz de acordo com o exemplo abaixo:

.

Uma mesma amostra contém muitos núcleos magnéticos do mesmo tipo distribuídos pelos vários estados de spin de acordo com a lei de distribuição de Boltzmann. Assim, para I=1/2, considera-se que os núcleos com m = +1/2 (spins α) possuem menor energia, pois precessionam orientados a favor do campo, enquanto os núcleos com m = -1/2 (spins β) possuem maior energia, pois precessionam orientados na direção oposta ao campo magnético. A Equação 8 exprime a _{razão das populações em equilíbrio dos estados de spin α e β para um} determinado núcleo num grande número de moléculas idênticas.

(8)

onde N é o número de núcleos em um dado estado, _{é a}

constante de Boltzmann e T a temperatura da amostra. A diferença entre os níveis de energia dos spins é muito pequena, então a população em excesso à temperatura ambiente pode ser calculada pela Eq. 8:







2

B







E

_{k T}

k T

E

N

N

_









exp

1

17

,

para uma amostra em um campo magnético de 11,75 T (500 MHz para o 1H). Ou seja, , o que equivale a dizer que a cada 12200 spins (1/0,0000820), apenas 1 encontra-se em excesso no estado de menor energia (α). Este é o motivo pelo qual a técnica de RMN é tão menos

sensível que técnicas como UV e IV, onde as diferenças de energia entre o estado fundamental e o estado excitado são substancialmente maiores.

A pequena diferença entre as populações α e β de spin nucleares determina um momento magnético total que pode ser representado por um vetor M0 alinhado com B0, ao longo do eixo z como mostra a Figura 7.

Figura 7 – Vários spins representados pelo vetor magnetização resultante.

1.2.2 Pulso de RF

Para realização de um experimento de RMN é preciso que a magnetização saia do estado de equilíbrio. Isto é alcançado, aplicando-se um segundo campo magnético perpendicular ao campo magnético estático B0 e oscilante no plano

transversal com uma frequência igual à frequência de Larmor. Por essa razão, esse segundo campo é denominado campo de radiofrequência (B1). Dessa forma

é gerado um campo magnético B resultante da aplicação simultânea dos campos magnéticos estático e de RF. Para retirar o sistema de spins do estado de equilíbrio, o que significa alterar a população dos níveis de energia, ou alterar a

18

orientação da magnetização, deve-se aplicar o campo RF durante um curto período de tempo (entre mili e s), o qual se denomina pulso de RF. Ao aplicar um pulso de RF com duração Tp, a magnetização irá precessionar em torno de B1

através de um ângulo , sendo os ângulos _{β mais utilizados são /2 e ,} levando a magnetização para o eixo y ou invertendo sua orientação original, respectivamente, como mostra a Figura 8.

Figura 8 - À esquerda pulso de 90° e à direita pulso de 180°.

1.2.3 O Sinal de RMN

Após aplicação de um pulso de RF de /2, a magnetização M precessiona no plano xy como um pequeno imã que gera um fluxo de campo magnético no interior da bobina de RF, fazendo surgir uma força eletromotriz, que é determinada pela Eq. 9.

(9)

onde A é uma constante diretamente proporcional ao valor da magnetização de equilíbrio do sistema de spins.

A livre precessão dos spins após o pulso de RF faz surgir o sinal conhecido como FID (Free Induction Decay) que após sofrer o tratamento matemático da Transformada de Fourier (TF), é apresentado em um espectro, cuja intensidade de sinal é proporcional ao número de spins que formam a magnetização resultante em função da frequência.

)

cos(

)

(

t

A

t

V





19

1.2.4 Deslocamento químico

A aplicação de um campo magnético sobre um núcleo encontra os elétrons ao redor deste, e devido ao movimento destes, um campo magnético induzido (B)

é gerado, oposto e proporcional ao campo aplicado (Figura 9).

Figura 9 - Geração de um campo magnético induzido devido à presença de um

campo magnético aplicado e ao movimento eletrônico.

O deslocamento químico representa a dependência de uma frequência de absorção característica de um núcleo com a nuvem eletrônica que o rodeia. Quando uma molécula é inserida em um campo magnético, os elétrons que a rodeiam protegem o núcleo dos efeitos do campo. Essa proteção ou blindagem varia de acordo com a posição e a densidade eletrônica sob este núcleo na molécula. Dessa forma tudo o que afetar a densidade eletrônica na molécula, também afeta a blindagem.

O campo magnético induzido BI é uma função do campo aplicado B0 e da

constante de proporcionalidade do tensor blindagem σ, chamado também de constante de blindagem:

B0

aplicado

20 0

B

B





I local

B

B

B





. (12)

Dessa forma, quanto maior for o valor do tensor blindagem, menor será o valor do deslocamento químico, pois quanto maior a densidade eletrônica próxima ao núcleo em estudo, maior é a blindagem, ou seja, maior é a proteção em relação ao campo aplicado.

Substituindo B0 da Eq. 07 por B0(1 – σ), obtém-se a Eq. 13, que leva em

consideração a blindagem nuclear criada pelos elétrons.

. (13)

A grandeza deslocamento químico descrita em ppm, δ, é uma maneira mais

usual de representar a influência da constante de blindagem, _{σ, para que os dados} de frequência não tenham que ser relacionados com o campo magnético utilizado. É típico analisar um espectro de RMN usando um material de referência como padrão, tal como um composto de calibração interna, e medir o deslocamento químico dos núcleos da amostra analisada em relação a esse padrão interno. Para que se obtenha valores ppm, utiliza-se a Eq. 14.

0 0





























B

B

B

1

B















1



2

B

21

Onde:





1.2.5 RMN, Sensibilidade e Resolução de Sinais

Devido à mistura de componentes existente em um meio de degradação, a sobreposição de sinais é esperada em espectros de 1_{H, o que pode inclusive}

dificultar a contagem do número de compostos presentes em uma amostra. No presente trabalho, a escolha da RMN de 19F, no objetivo de calcular a porcentagem de degradação baseia-se na presença de um único átomo de flúor na molécula do fármaco em estudo, o que facilita a pesquisa dos produtos de degradação à medida que cada molécula que contém um átomo de flúor gera um único sinal no espectro. A RMN de 19F é uma técnica que oferece várias vantagens, pois a abundância isotópica é de 100%, trata-se de uma metodologia extremamente sensível (razão magnetogírica 0,83 relativa ao 1H), há ampla dispersão de deslocamento químico que possibilita sinais sem sobreposição e esse núcleo é extremamente sensível ao ambiente químico na molécula possibilitando a análise de misturas complexas.22

Ao contrário da espectroscopia de absorção UV-Vis e espectrometria de massas, onde a análise quantitativa só é possível através da comparação do sinal do analito com a resposta obtida para um padrão de análise, a análise quantitativa pode ser realizada com RMN usando qualquer composto não relacionado que contenha o núcleo de interesse. Considerando que em RMN quantitativo a área de cada núcleo ressonante é proporcional apenas à concentração molar da substância a qual pertence e ao número de núcleos que dá origem à ressonância, a análise quantitativa é possível para analitos novos ou desconhecidos presentes em misturas complexas, desde que haja resolução entre os sinais dos analitos e dos compostos de referência e que estes últimos forneçam padrões de deslocamento químico e largura da linha adequados para proporcionar a boa integração dos sinais.23

22

Infelizmente, a RMN é uma técnica sabidamente menos sensível que diversas outras, por exemplo, a espectrometria de massas. Avanços tecnológicos que permitam o aumento do campo magnético aplicado têm permitido melhorias substanciais na sensibilidade, o que se trata de um problema importante, à medida que na análise de impurezas em medicamentos como produtos de degradação, estes estão disponíveis em concentrações extremamente baixas na amostra. A RMN pode ser considerada um detector universal para hidrogênio e carbono, assim como outros núcleos magneticamente ativos, o que pode ser considerada uma vantagem, e por vezes uma desvantagem, já que há detecção dos sinais de solventes e substâncias majoritárias na amostra, por exemplo, o material de partida. A quantificação é precisa acima de quatro ordens de grandeza, embora não seja tão precisa quanto outras técnicas analíticas em baixas concentrações, o que faz com que a aplicação da RMN no estudo de misturas contendo componentes pouco concentrados, seja um desafio.24

Desde sua descoberta até os dias de hoje a RMN passa por inúmeros avanços quanto à sensibilidade como introdução de funções de apodização no processamento do FID, melhorias na eletrônica da sonda de RMN, melhorias nos pré-amplificadores, melhorias nos detectores de quadratura, digitalização em alta freqüência, melhorias nos magnetos, introdução dos supercondutores, transferência de polarização, cryo-sondas e DNP, levando ao aumento na relação sinal ruído o que a torna uma ferramenta importante na análise química de produtos de degradação que podem estar em baixas concentrações nas amostras (entre nano e pico molar).

Um dos problemas encontrados na técnica de RMN consiste na sobreposição dos sinais de ressonância, o que é típico de sistemas complexos e grandes moléculas. Analisando o caso do núcleo amplamente empregado, 1_{H: a}

espectroscopia de RMN de 1_{H é bastante sensível devido a abundância natural do}

isótopo (99,98%) e alta razão giromagnética [26,75 rad (sT) -1_{], porém a janela ou}

faixa espectral onde se observam os sinais de RMN de 1_{H é de aproximadamente}

20 ppm, enquanto os sinais da maior parte dos compostos orgânicos apresentam-se entre 0 e 8 ppm. No caso do núcleo 13_{C, as frequências de ressonância são}

23

observadas em uma faixa espectral muito maior (200 ppm), com sinais mais dispersos entre si, entretanto, a abundância isotópica e a razão giromagnética são baixas (1,1% e 0,25 da razão giromagnética do 1H respectivamente), tornando a espectroscopia de RMN de 13C muito menos sensível. Usando a RMN em campos magnéticos altos pode ser possível alcançar a sensibilidade e resolução necessárias, mas em espectros de RMN de amostras mais complexas os sinais podem continuar sobrepostos até mesmo em equipamentos de altas frequências como de 800 MHz que, além disso, ainda têm elevado custo financeiro.25

Outra estratégia para elucidação estrutural quando há sinais sobrepostos são os espectros bidimensionais que traçam mapas da correlação entre os núcleos envolvidos e através da correlação obtêm-se o deslocamento químico que, em um espectro unidimensional, não seria obtido em um mesmo campo magnético.

As mais variadas técnicas multidimensionais têm sido aprimoradas pela evolução dos equipamentos de RMN. Magnetos supercondutores com maior estabilidade do campo magnético e versatilidade no ajuste da homogeneidade, e

hardwares que permitem eficientes elaboração e precisão na programação das

sequências de pulsos são exemplos dos avanços que estão auxiliando nas metodologias de análise de compostos análogos que merecem cautela no mapeamento estrutural. As técnicas 2D permitem correlacionar hidrogênios e/ou carbonos que possuam alguma relação escalar (nJH-H, nJC-H, nJC-C) ou espacial

(H,H- ou H,C-NOE) entre si. Desta forma é possível fazer um mapeamento estrutural mais preciso do que utilizando somente as técnicas 1D na análise de estruturas mais complexas. Algumas técnicas de RMN 2D homonucleares estão resumidas abaixo:

COSY (homonuclear COrrelation SpectroscopY): com esta técnica pode-se

estabelecer as correlações entre os hidrogênios que estão acoplados por 2JH-H e 3_J

H-H (acoplamentos geminais e vicinais, mensuráveis no espectro de 1D) e assim

discernir a multiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN de 1_H.

Eventualmente, sinais devidos a 4-6_J

24

TOCSY (Total Correlation SpectroscopY): a sequência TOCSY é um experimento

de correlação homonuclear que utiliza a técnica conhecida como “spin lock” para manter a magnetização no plano XY e estabelece as condições de Hartmann-Hahn, onde ocorre a transferência de polarização de um núcleo para outro, durante um período de tempo que é chamado de “tempo de mistura”. A magnetização se espalha a partir de um membro de um determinado sistema de spin para todos os outros membros desse sistema. Dessa forma em um mesmo espectro de TOCSY é possível obter-se correlações do tipo 1J, 2J, 3J,...NJ (onde

N≤7, dependendo do sistema estudado). Essa técnica é amplamente utilizada no estudo de peptídeos e oligossacarídeos, pois permite que até spins que não estejam diretamente acoplados, mas façam parte de uma mesma rede de acoplamentos, possam transferir polarização entre si. O experimento unidimensional TOCSY seletivo é uma versão do método bidimensional TOCSY em que um próton é excitado por um pulso formatado e este produz uma resposta para todos os prótons que estão conectados por acoplamento de spins numa mesma cadeia. Os experimentos TOCSY seletivos podem produzir resultados ainda mais claros quando realizados com gradiente (gs-TOCSY seletivo) que promove a perda ou ganho de coerência, não necessitando grandes ciclos de fases para seleção de coerências ou melhoria da relação sinal/ruído.27, 28, 29

NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY): têm o aspecto de um

COSY, contudo as correlações envolvem interações devidas ao NOE entre os hidrogênios que estão espacialmente próximos (em geral, menor que 6Å). Através desta técnica é possível estabelecer a configuração relativa de cada hidrogênio na molécula e geralmente a geometria molecular como um todo. A mesma informação pode ser obtida da difração de Raio-X, mas apenas para compostos na forma de um sólido cristalino.26

A maior diferença entre RMN unidimensional e bidimensional é a inserção do tempo de evolução, ou do tempo de evolução nesta última, onde se pode provocar a interação entre diferentes núcleos de várias maneiras dependendo da sequência de pulsos aplicada. Dessa forma, o FID resultante pode ser submetido a dois conjuntos de transformações de Fourier (t2, ou período de aquisição, em

25

função de t1, de evolução) para fornecer um espectro de RMN bidimensional em

dois eixos que se correlacionam através de uma dada propriedade desejada, oferecendo versatilidade e eficácia em uma série de vantagens como a diminuição do problema da sobreposição das linhas espectrais e a correlação de pares de ressonância.

Espectros de 2D heteronucleares como HETCOR (HETeronuclear

CORrelation spectroscopy) e COLOC (COrrelation spectroscopy for LOng-range

Couplings) assinalam carbonos que contêm hidrogênios com acoplamentos 1JC-H e

n_J

C-H respectivamente. Desta forma, eles fornecem informações quando são

executados juntos e caso já tenham sido assinalados todos os hidrogênios do espectro de RMN de 1H. Esses tipos de espectros demandam muito tempo de máquina, principalmente quando se analisam amostras diluídas. Esse problema ocorre porque a detecção é feita por intermédio do heteronúcleo pouco sensível onde o eixo horizontal (dimensão F2) corresponde ao deslocamento químico do núcleo 13C e o eixo vertical (dimensão F1) corresponde ao núcleo 1H. Essa limitação pode ser contornada com técnicas 2D heteronucleares em que a detecção é feita por intermédio do núcleo mais sensível. Sequências de pulsos envolvendo transições múltiplo-quânticas, denominadas de HMQC (Heteronuclear

Multiple Quantum Coherence) e HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

substituíram respectivamente os experimentos HETCOR e COLOC. Os espectros de HMQC e HMBC são editados com o eixo horizontal (dimensão F2)

correspondendo aos deslocamentos dos 1H e o eixo vertical (dimensão F1)

correspondendo aos deslocamentos dos 13_{C. O aumento de sensibilidade}

propiciado foi otimizado com a criação das sondas inversas em que a bobina do canal de 1_{H fica posicionada mais próxima ao tubo de amostra e a bobina do canal}

do núcleo menos sensível é a mais externa, conseguindo-se mais sensibilidade levando ao uso de menor tempo de máquina.26

Comunmente, o canal indireto é usado de duas formas: a primeira com a aplicação de pulsos duros e curtos com alta potência, a segunda maneira é aplicando uma sequência de desacoplamento pulsado (“composite pulse