Identification of the Trichinella species by PCR method

(1)

DOI: 10.2298/VETGL1202041V

UDK 636.09:595.132:616-079

ODRE\IVANJE VRSTA TRIHINELA PRIMENOM PCR

METODE

*

IDENTIFICATION OF THE TRICHINELLA SPECIES BY PCR METHOD

S. Vasilev, Jelena Cvetkovi}, Ivana Radovi},

Ljiljana Sofroni}-Milosavljevi}

**

Srbija je zemlja sa visokom prevalencijom infekcije doma}ih svinja trihinelom (Trichinella spp.) u endemskim regionima, {to pred-stavlja ozbiljan rizik za zdravlje stanovni{tva. Iako je primena PCR uve-dena pre dve godine u INEP-u, do sada je samo za nekoliko izolata larvi trihinela, otkrivenih u mesu svinja, ura|ena genotipizacija. Novi podaci pokazuju da na teritoriji Srbije, u silvati~nom ciklusu postoji vi{e od jedne vrste Trichinella, i to T. spiralis i T. britovi (istovremeno na|eno u Beogradskom okrugu). Zbog rizika od mogu}eg preklapanja silva-ti~nog i doma}eg ciklusa, veliki epidemiolo{ki zna~aj bi imalo dalje ispi-tivanje ovom molekularnom metodom svih larvi koje se otkriju tokom obaveznog pregleda mesa (kako na klanicama, a poreklom su iz doma}instava, tako i sa farmi koje se nalaze u ugro`enim podru~jima Srbije). Iz tog razloga smo ispitali, primenom PCR, larve Trichinella izolovane iz svinjskog mesa, ~ija je konzumacija dovela do infekcije ljudi u Grockoj, Beograd, 2011. g. Ustanovljeno je da larve pripadaju vrsti T. spiralis.

Klju~ne re~i: Trichinella spiralis, Trichinella britovi, PCR

Parazitske nematode iz rodaTrichinellaizazivaju oboljenje ljudi i infek-ciju ìvotinja (sisara, ptica i reptila). To su paraziti sa direktnim ìvotnim ciklusom, infektivni oblik je larva prvog stadijuma (L1) koja moè da parazitira godinama u popre~no-prugastim mi{i}ima doma}ina (Pozio, 2007). Unutar ovog roda

pre-Uvod /Introduction

* Rad primljen za {tampu 06. 06. 2011. godine

(2)

poznajemo inkapsulirane i neinkapsulirane forme. Vrste i genotipovi koji formiraju kapsulu inficiraju samo sisare (T. spiralis, T. nativa, T. britovi, T. pseudospiralis, T. murrelli, T. nelsoni, TrichinellaT6, T8 i T9). Od tri vrste koje pripadaju neinkapsuli-ranoj formi, jedna dovodi do infekcija sisara i ptica (T. pseudospiralis), a dve kod sisara i reptila (T. papuaeiT. zimbabwensis) (Pozio i Murrell, 2006; Zarlenga i sar., 2006). Novi podaci pokazuju postojanje jo{ jednog genotipa (T12) koji formira kapsulu (Pozio i sar., 2009). Prisustvo parazita kod doma}ih i divljih `ivotinja samo po sebi nije dovoljno za infekciju koja se javlja u humanoj populaciji. Trihineloza kod ljudi striktno je vezana za kulturu pripreme hrane, kao i neadekvatan ili izostao pregled mesa na prisustvo larvi. Bolest nastaje kao posledica konzumiranja siro-vog ili nedovoljno termi~ki obra|enog mesa razli~itog animalnog porekla (od doma}ih svinja ili konja, a od divlja~i su to naj~e{}e divlje svinje i medvedi) u kome se nalaze infektivne larve trihinela (Gajadhar i sar., 2009).

Izuzev po postojanju kapsule, vrste i genotipovi koji pripadaju rodu Tri-chinellase morfolo{ki ne mogu razlikovati, pa se zbog toga za identifikaciju geno-tipa parazita mogu koristiti samo molekularne metode. Mnoge metode su raz-vijene u tu svrhu, ali se danas naj~e{}e koristi ona koja se zasniva na lan~anoj reakciji polimeraze (PCR od engl. Polymerase Chain Reactions) (Zarlenga i sar., 1999; Pozio i La Rosa, 2003). Upotreba ove metode za odre|ivanje vrstaTrihinella uvedena je u INEP-u 2009. godine.

U Srbiji su paraziti iz rodaTrichinellaprvi put detektovani kod svinja 1918. godine, dok je prvi slu~aj infekcije kod ljudi zabeleèn 1923. godine (\or|evi}, 2003). Od uvo|enja obaveznog pregleda mesa 1958. godine preva-lencija infekcije kod svinja se smanjivala, kao i broj obolelih ljudi. Me|utim, 90-ih godina XX veka se naglo pove}ao broj inficiranih svinja (sa 0,009% do 0,017%) pa i broj obolelih ljudi, koji u tom periodu dostiè oko 500 godi{nje. Poslednjih go-dina je ovaj broj u opadanju, ali i dalje svake godine u Srbiji oboli od nekoliko de-setina do 200 ljudi od ove bolesti (ûperlovi}, 2005). Kod divljih ìvotinja (vukova, {akala i lisica) u Srbiji nedavno je otkriveno prisustvoT. britovi({to je o~ekivano i karakteristi~no za silvati~ni ciklus), ali iT. spiralis({to ukazuje na preklapanje sa doma}im ciklusom). Samo u jednom okrugu su registrovane obe vrste i to kod lisica uhva}enih na podru~ju op{tine Sur~in, Beogradski okrug (Cvetkovi} i sar., 2011). Ovaj nalaz ukazao je na realnu mogu}nost preno{enja T. britovi, preko zaraènih pacova i mi{eva, na doma}e svinje, a zatim i ljude. U op{tini Grocka, Beogradski okrug, tokom februara 2011. godine evidentirana je epidemija trihine-loze kod ljudi. Do skora se svaka infekcija trihinelom kod ljudi ili ìvotinja pripisi-valaT. spiralis. Savremena saznanja zahtevaju druga~iji pristup tj. jasnu identifika-ciju vrsteTrichinellakoja je dovela do infekcije.

(3)

Ministarstvo zdravlja Republike Srbije donelo je re{enje na osnovu koga je INEP i Odeljenje za imunologiju i imunoparazitologiju, kao njegov odgovorni deo, po-stao Nacionalna referentna laboratorija za trihinelozu (NRLT).U cilju ispitivanja zastupljenosti vrstaTrichinellau Srbiji, INEP je 2009. godine uveo PCR metodu u cilju odre|ivanja vrsta Trichinella. NRLT poseduje sve mogu}nosti za primenu najsavremenijih metoda za dijagnostiku infekcije sa Trichinella spp. i za defini-sanje vrste i/ili genotipovaTrichinellau epidemiolo{ko-epizootiolo{ke svrhe.

Zbog svih navedenih razloga u uzorcima svinjskog mesa koje je izaz-valo epidemiju u Grockoj uradili smo pregled na prisustvo larviTrichinella, kao i odre|ivanje vrste.

U dostavljenim uzorcima mesa i proizvoda od mesa (suvo svinjsko meso, kobasica, suva svinjska rebra) analiza prisustva larviTrichinellaje ura|ena primenom vesta~ke digestije, metoda magnetne me{alice, u skladu sa direktivom Evropske komisije 2075/2005. godine.

U cilju odre|ivanja vrsteTrichinella ura|ena je izolacija DNK iz po-jedina~nih larvi koje su dobijene iz navedenih uzoraka i, zatim, multipleks PCR.

Ekstrakcija DNK / Extraction of DNA–Genomska DNK je izolovana iz pojedina~nih larvi upotrebom komercijalnog kita QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) prema uputstvu proizvo|a~a. Iz svakog uzorka je ura|ena izolacija DNK iz najmanje 5 larvi.

Multipleks PCR /Multiplex PCR –Multipleks PCR analiza je ura|ena prema protokolu Evropske referentne laboratorije za parazite (EURLP), Rim, Italija (http://www.iss.it/crlp). Ukratko, u ovom ispitivanju reakciona smesa (30 ml) je

sadr`ala: 2 x PCR Master Mix, 4 µl H2O, 1 µl SetB (set od 10 razli~itih prajmera) i 10ml genomske DNK. Uslovi PCR reakcije su se sastojali od inicijalne

denatura-cije na 95oC tokom 4 minuta, 35 ciklusa od tri koraka – denaturacije DNK na 95oC tokom 10 sekundi, hibridizacije prajmera na 55oC tokom 30 sekundi i ekstenzije prajmera na 72oC tokom 30 sekundi i finalne elongacije na 72oC tokom 3 minuta. Kao pozitivne kontrole kori{}ene su pojedina~ne referentne larve tj. dve inkapsuli-rane (T. spiralis, ISS3; T. britovi, ISS2) i jedna neinkapsulirana vrstaTrichinella(T. pseudospiralis, ISS13) dobijene od EURLP.

Gel elektroforeza / Gel elektrophoresis – Analiza amplifikovanih PCR

produkata je ura|ena gel elektroforezom u 2% agaroznom gelu (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) u TAE puferu. Za bojenje i vizuelizaciju DNK fragmenata na gelu kori{}en je etidijum bromid i transluminator za detekciju.

(4)

U dostavljenim uzorcima ustanovljeno je prisustvo larviTrichinellai to: 1) u uzorku suvog svinjskog mesa 4,76 larvi po gramu; 2) u uzorku kobasice 6,74 larvi po gramu, i 3) u uzorku suvih svinjskih rebara 0,006 larvi po gramu.

Rezultati PCR analize pojedina~nih larvi izolovanih iz dobijenih uzo-raka su{enog svinjskog mesa i kobasice pokazali su prisustvoT. spiralisu uzor-cima. Zaklju~ak je baziran na postojanju trake od 173 bp iz ispitivanih uzoraka koja se nalazi na identi~noj poziciji kao i pozitivna kontrola dobijena iz larviT. spi-ralis-ISS3, za razliku od polo`aja traka nastalih nakon analize drugih referentnih uzoraka vrstaTricihinella,tj. 127 i 253 bp zaT. britovii 310 bp zaT. pseudospiralis.

Problemi koji trihineloza izaziva su ekonomske prirode kada je u pi-tanju infekcija kod ìvotinja, odnosno zdravstvene, ali i ekonomske prirode kada do|e do razvoja bolesti kod ljudi. U Srbiji je najve}i broj epidemiolo{kih podataka i ad hocistraìvanja na prisustvoTrichinellakod doma}ih i/ili divljih ìvotinja vezan za pojavu epidemija kod ljudi (ûperlovi}, 2005; Cvetkovi} i sar., 2011). Zastuplje-nost vrstaTrihinellarazlikuje se unutar balkanskih zemalja. U Srbiji, Rumuniji, Bu-garskoj i Hrvatskoj, trihineloza je veoma rasprostranjena i predstavlja ozbiljan hu-mani zdravstveni problem, ali i ekonomski problem u uzgoju svinja (Pozio, 2007). [irenje trihineloze bilo je zabeleèno u ovim zemljama kao posledica politi~kih i socijalnih promena koje su se de{avale tokom poslednje dve decenije, a naro~ito kao posledica velike migracije stanovni{tva (ûperlovi}, 2003; Gajadhar, 2009). Od drugih zemalja koje se grani~e sa Srbijom umerena ra{irenost trihineloze je zabeleèna u Bosni, a sporadi~na u Makedoniji. Do skoro je u Srbiji zahvaljuju}i saradnji sa svetskom referentnom laboratorijom za trihinelozu (ITRC), istovre-meno i Evropskom referentnom laboratorijom za parazite (EURLP) pri Istituto Su-periore di Sanita, Rim, Italija, u uzorcima mesa bilo potvr|eno prisustvo samo Tri-chinella spiralis.Me|utim, rezultati najnovijeg istrazivanja ostvarenog u saradnji sa EURLP, Fakultetom veterinarske medicine i Biolo{kim fakultetom, Univeziteta u Beogradu ukazuju na prisustvo iT. britoviu Srbiji, za sada potvr|eno samo kod divljih ìvotinja (Cvetkovi} i sar., 2011). Podaci o tome koje su vrsteTrichinella zas-tupljene postoje za ve}inu balkanskih zemalja sa izuzetkom, Bosne i Crne Gore. U Rumuniji su prisutne: T. spiralis, T. britovi,T. pseudospiralis iT. nativa (Olteanu, 1996); u Hrvatskoj i Bugarskoj otkrivene su:T. spiralis, T. britoviiT. pseudospiralis; u Ma|arskoj i Makedoniji:T. spiralis iT. britovi,dok su za Bosnu podaci o prisustvu T. spiralisiT. britovi,dati na bazi predpostavke EURLP (Pozio, 2007a).

Dobijeni rezultati, nalaz larveT. spiralisu uzorcima zara`enim trihine-lom, u saglasnosti su sa do sada dobijenim podacima o vrstama larvi kod doma}ih svinja. Zbog rizika od mogu}eg preklapanja silvati~nog i doma}eg cik-lusa parzita, naro~ito kod svinja koje se gaje van obora – u dvori{tu ili se pu{taju na `iriranje u {umu, za dobijanje potpune slike i savremenog pra}enja stanja

(5)

onih uzorka u kojima su larve na vreme otkrivene tokom obaveznog pregleda mesa, te je tako spre~ena pojava epidemija. Ove analize bi omogu}ile i eventu-alno otkrivanje prisustva drugih vrstaTrichinella,pre svegaT. pseudospiralis. Na kraju, isti~emo da je od posebne va`nosti da ~itava veterinarska struka sagleda zna~aj ovakvog, savremenog pristupa u pra}enju ra{irenosti infekcije sa Tri-chinellaspp. u Srbiji, te da se uzorci (bilo inficiranog mesa ili slobodnih larvi do-bijenih nakon digestije) proslede laboratorijama osposobljenim za PCR moleku-larnu dijagnostiku (a obavezno i odgovaraju}oj referentnoj laboratoriji u kojoj treba da postoji banka izolata). U tom cilju pozivamo sve zainteresovane po-jedince i/ili organizacije na saradnju na ovom veoma va`nom polju rada veterinar-ske i lekarveterinar-ske struke a sve u okviru veoma zna~ajne svetveterinar-ske inicijative: jedno zdravlje – jedna medicina.

Ovim prikazom slu~aja se potvr|uje da infekciju trihinelom kod ljudi u Srbiji izazivaT. spiralis. Zbog prisustva i drugih vrsta trihinela u okruènju, a i kod nas, bilo bi zna~ajno sprovo|enje sistematskog istraìvanja zastupljenosti vrsta Trichinella. Angaòvanje ljudskih i materijalnih resursa u Srbiji, saradnja sa drugim referentnim laboratorijama u regionu, EURLP i Svetskom referentnom laboratori-jom za trihinelozu u Rimu, treba da doprinese boljoj kontroli trihineloze.

ZAHVALNOST /ACKNOWLEDGEMENTS:

Ovaj rad je finansiran sredstvima projekta 173047 Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije. Zah-valjujemo se Veterinarskoj inspekciji Republike Srbije./

This work was financed by funds within Project 173047 of the Ministry for Education and Science of the Repub-lic of Serbia. We wish to thank the Veterinary Inspection of the RepubRepub-lic of Serbia for their help.

1. Cvetkovi} J, Teodorovi} V, Marucci G, Vasilev D, Vasilev S, ]irovi} D, Sofroni}-Mil-osavljevi} Lj. First report ofTrichinella britoviin Serbia. Acta Parasitol 2011; 56(2): 232-5.

2. ^uperlovi} K, \or|evic M, Pavlovic S. Re-emergence of trichinellosis in southeastern Europe due to political and economic changes. Vet Parasitol 2005; 132: 159-66.

3. \or|evic M, Baci} M, Petri}evi} M, ^uperlovi} K, Malakauskas A, Kapel CM, Murrell KD. Social, political, and economic factors responsible for the reemergence of tri-chinellosis in Serbia: a case study. J Parasitol 2003; 89: 226-31.

4. Gajadhar AA, Pozio E, Gamble HR, Nockler K, Maddox-Hyttel C, Forbes LB, Vallee I, Rossi P, Marinculic A, Boireau P.Trichinelladiagnostics and control: Manda-tory and best practices for ensuring food safety. Vet Parasitol 2007; 159: 197-205.

5. Olteanu G. Trichinellosis in Romania: a short review over the past twenty years. Parasite 2001; 8(2S): S98-9.

Zaklju~ak/Conclusion

(6)

6. Pozio E. Taxonomy, biology and epidemiology of Trichinella parasites. In: (Eds. J. Dupouy-Camet and K.D. Murell) FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveil-lance, management, prevention and control of trichinellosis. World Organisa-tion for Animal Health (OIE), Paris, France, 2007; 1-35.

7. Pozio E. World distribution ofTrichinella spp.Infections in animals and humans. Vet Parasitol 2007a; 149: 3-21.

8. Pozio E, La Rosa G. PCR-derived methods for the identification ofTrichinellaparasites from animals and human samples. Methods in Molecular Biology 2003; 216: 299-309.

9. Pozio E, Hoberg E, La Rosa G, Zarlenga DS. Molecular Taxonomy, Phylogeny and Bio-geography of nematodes belonging to theTrichinellagenus. Infect Gen Evol 2009; 9: 606-16.

10. Pozio E, Murrell KD. Systematics and epidemiology ofTrichinella. Adv Parasitol 2006; 63: 367-439.

11. Zarlenga DS, Chute MB, Martin A, Kapel CM. A multiplex PCR for unequivocal differen-tiation of all encapsulated and non-encapsulated genotypes ofTrichinella. Int J Parasitol 1999; 29: 1859-67.

12. Zarlenga DS, Rosenthal B, La Rosa, G, Pozio E, Hoberg EP. An old genus learns new tricks: late Tertiary colonization and speciation of Trichinella nematodes among Eutheria Proc Nat Acad Sci USA 2006; 103: 7354-9.

IDENTIFICATION OF THE TRICHINELLA SPECIES BY PCR METHOD

S. Vasilev, Jelena Cvetkovi}, Ivana Radovi}, Ljiljana Sofroni}-Milosavljevi}

Serbia is country with a high prevalence ofTrichinellainfection in pigs, which continues to be a serious human health problem. In Serbia, only a few isolates ofTrichinella found in pork have been genetically specified to date, and all were proven asT. spiralis. New data shows that in the sylvatic cycle in Serbia, at least in the Belgrade district, more than oneTrichinellaspecies co-exist (T. spiralisandT. britovi). Increased awareness of the possible overlap among sylvatic and domesticTrichinella cycles indicates the need for continuous monitoring ofTrichinellaspecies circulation and strongly points to the need that all isolates ofTrichinellafound in meat for human consumption should be subject to a de-termination of theTrichinellaspecies (due to the risk of transmission of infection withT. bri-tovito domestic pigs and humans). This is why we examined using PCR theTrichinella lar-vae found in pig meat that caused a human outbreak (Trichinellainfection) in Grocka (Bel-grade district) during February 2011. The isolated larvae belonged toT. spiralis.

Key words:Trichinella spiralis, Trichinella britovi, PCR

(7)

MOLEKULÂRNOE OPREDELENIE VIDOV TRIHINELL

S. Vasilev, Jelena Cvetkovi~, Ivana Radovi~, LilÔna Sofroni~-Milosavlevi~

SerbiÔ strana s vìsokim preobladaniem infekcii doma{nih sviney trihinelloy (Trichinella spp.) v Ìndemi~eskih regionah, ~to predstavlÔet soboy serÍëznìy risk dlÔ zdorovÝÔ naseleniÔ. HotÔ primenenie PCR vvedeno dva goda tomu nazad v INEP-e, do sih por tolÝko dlÔ neskolÝko izolÔtov li~inok trihi-nell, otkrìtìh v mÔse sviney sdelana genotipizaciÔ. Novìe dannìe pokazìvaÓt, ~to na na{ey territorii, v slÓnnom cikle suçestvuet bolÝ{e odnogo vida Tri-chinella, a imennoT. spiralisiT. britovi(odnovremennoe prisutstvie, naydennoe v Bel-gradskom okruge. Iz-za riska ot vozmo`nogo sovpadeniÔ slÓnnogo i doma{nego cikla, bolÝ{oe Ìpidemiologi~eskoe zna~enie bì imelo dalÝney{ee ispìtanie Ìtim molekulÔrnìm metodom vseh li~inok, kotorìe otkroÓtsÔ v te~enie obÔ-zatelÝnogo osmotra mÔsa (kak na skotoboynÔh, a proisho`deniem iz doma{nih hozÔystva tak i s ferm, nahodÔçie v ugro`aemìh rayonah Serbii). Po Ìtoy pri~ine ispìtano nami, primeneniem PCR, li~inkiTrichinella, izolirovannìe iz svinogo mÔsa, ~Íë potreblenie privelo do infekcii lÓdey v Grocke, Belgrad, 2011 g. Us-tanovleno, ~to li~inki prinadle`at viduT. spiralis.

KlÓ~evìe slova:Trichineela spiralis, Trichinella britovi, PCR