е т о т
ко т ол
о
е ол о
до л . ло ћ1, л ко . ој ло ћ2, . Ko т ћ1, е Љ. л ћ2, . у к 2, е . Ђо ђе ћ1, ко . у к 2
1УниверзитетуБеограду
, Технолошко–металуршкифакултет, Београд, Србија 2УниверзитетуБеограду
, Институтзамедицинскаистраживања, Београд, Србија
Извод
у од , код у ету, ј ју е те оло к по туп оло ње
т укту о о у о оло к кт о е о ло кој о о д е ко т
к о е к к , к о о оло к око кт о е ко о ђ у п е е ј е је код људ от њ , л к о е е у д ј о т . о о ду опт
-о је по туп к оло ње е о ло е т о т по екло отп д е
кл е о еђе к ље до ј њ п еп т е ко о ђ п е е ју
е је код от њ . е т је о етљ о т о еђ е т о т о от ку
л у ље де њ опт л о пу е ко те е к о ођење
ко т ол е е ол е. о је е улт т у пок л д о еђ е т о т ју по ећ у о от ку о етљ о т у од о у у е е т о те, д је опт л
пу е к те ођење њ о е ко т ол е е ол е 35 mM т ју - о
-т /NaCl пу е pH 7,2–7,4. Ко т ол е ол опт о пу е к
те о је еде у е ко е кто ко те у о т е је п о
е-о ле-о од 83±12%. око о о п о е је до ло до о тећењ е е е
-т о -т , т кт е е е п е т о т е о ле ко т т к п
у-л ју оло к кт уп т .
Кључне речи: ко т ол е ол , о еђ е т о т , е о ло , е к о е кто .
К 59:612.111:544.4:66
Хем. Инд.66 (4) 519–529 (2012)
doi: 2298/HEMIND111122008S
ДоступнонаИнтернетусаадресечасописа: http://www.ache.org.rs/HI/
е о ло , до је отп д е кл е о -еђек , о о е, ко п е ођењ уод о -јућу еут ку о у, ко т т к о о оло к око кт о е ко о ђ п е -е ју / л те п ју е је код људ о -т њ . п о е у кл њ , 100 kg е о ед п о -е о едо ј 4,4 л т отп д ек [1]. К које -д л т о еђек д уп о еку 110 g е о -ло [2], 0,4 g око оло к ко т о
е ко о ђ , п те оло ко п о е укој п о од 70%, к јед е от њете е 500 kg е о ло оло т око 6 g оло к око
кт о е ко о ђ . ј њејед о о к о по тупк ло оје ел коеко о кооп -д ње, јућ у ду т л е ел кепот е е п е -п т оло к ко т о о ђ у у ој ете кој ед . то е е о, т о -ј јед о поте ј л о ток о те ј л , кл е к , у оло к ед п о од, п е -п т е ко о ђ , п ед т љ ло
ње о д .
еп к : . у к , е оло ко– ет лу к култет,
-е тету ео ду, К е је 4, 11000 ео д, ј - E-по т: branko@tmf.bg.ac.rs
дп ље : 22. о е , 2011
дп ће : 31. ј у , 2012
по ледњ екол ко де е ј , д о т к т о је о оку поку
-јеп ојекто њ п отокол ду т ј к е -оло ње п е ћ ње е о ло
ље до ј њ окоп е ће о, т укту о у к о л о о у о олекул кој е ко
-т ок опол о до ј ње е к к , к о дод т ку п е е ју/те п ју по о е е је л к о т д д кл ку д ј о т ку. ко е о ло е од 90%
у е ее т о т , п о е ње о о оло њ п е ћ њ је по е ећ оје п о
-ле . О ј олекул је ео о етљ уп о е у оло њ о е доћ до л њ ло ке д е е л о о е е л доок до њ у ет е -о л-о . о д је оп ел к ој п о е -ду оло ње е о ло е т о т [3–8]. ећ п о еду п ко к у о -ло њујео от к л е т о т уде т ло ој од л т о лејо кеј е (т . по -то т о ). л у ођење е т о т у пото е т о е, о л ке у о от ко п т ку, е по т је пе е л о о
-ле т е к тјо е уе т о те ул од ко е о по њуд у е, тј. о л к е ењ од
-њ т то о е ол т ко от о [9] до ко д у дују олекул е о ло , к о ње
л еу ћел ј к п о то . О о лу њедел у ут ћел ј ко д ј њује по е е
е ол т к от о е т . еђут , у по -то у ло е т о т т љ ју д ље д у е, от е о е ол т к от о , -ује е о кол е о ло ћел је. О о еде едотледоке т о т е у едо к т о о , ко ко е е јеу т њу д от ње ло е ол т ко от о ње лекол е е о ло „ко пе -ује“ л кеуо от к п т , е одол допотпу о пу њ ћел ј . л едо т т ко -к о оло њ олекул е о ло је то еп лојп о е о от ко п т к пу -њу е ее т о т едо ј п еп ткој д о олекул е о ло , е о еле -е т-е е е ( еут л л п д , о ол п д , л кол п д , л коп оте д .). О ко т -т , к ко уп ут оут о , о у т ло епо ољ е оло ке е екте [10–14]. л тe етодe л ко је етод е п -ењују укл њ ње т о л ко по е т : е -т у ње, улт лт ј , ек т л ј , ек т к ј о к т ( ло о о , толуе , у ље тет ло д), о л л т е -ј л к о- л улт лт ј , т по
о то ј , п е ује ј њепо ељ е -тод укл њ њ еле е т т о еп е о о
-к т . е њ л ко т ј
еле е т т о е, еке упе уто у у е то л л ње , олекул е о ло оло -л по тепе , ко т ол њ ње јо -ке ј е т о , уп о е у ко т ол е е о -л е [15–17]. о о п о е у, о по тепе о ко т ол о њењ јо ке ј е т о е т о т е у е ло, ећ по тепе о. О о по тепе о ење е е о о ућ пул -јућеот ње е ол т к от о тојеп ће о пул јућ по тепе о ло ђ ње олекул
е о ло , то е к о ј д к о о ло ђ ње е о ло по т ој по
е т о т . о о п о е у, о по тепе о -њењ јо кеј е т о , е е т о т
л д о от к т е е дол до пу њ е е о о о ло ђ њ п оте к л п д ко т т . о ј е ел -т о т е о ло до ј уп о ол о о ко ку. Ко јо п о е ко т ол е е о -л е, к о улт т е ј л е лт је јо о ењ ке о то је Bugarski Dove-zenski у 2000. од едо л п еп тулт то
у о е о ло [17]. оло е о ло је оо у у т укту у оло ку у к ју, оје е п оте к л п д ко т т , те -л п о е . О ко п е ће е о ло је
лу о к о пол те ј л до јење е -к к [18] о о оло к кт о о ђ in vitro in vivo. д т тут ед к т њ е оло ко– ет лу -ко култет е тет у ео ду у т п отокол [17] л од к ј у -пе о п е л оло ње е о ло
отп д е њ кек ( епу л ко е ул -т -т ). О оје ло о уће о ео л ео -ло к к кте т к е е у њ -к е т о т [19]. љ о о д је о опт -о т п о е еп ет еп едло е о п ото -кол оло ње е о ло о еђ е т о -т , јућ у ду екењ о е пе о т .
Ј Л О
е е
Антикоагуланс.К о т ко ул ко ће је
3,8% т ју - т т. 1 l к дод је е 100 ml т ко ул .
Изотонични раствор NaCl (физиолошки рас
-твор). К о ото т о у о о ду је ко
-ће 0,9% т о NaCl у де т ло ој од ( оло к т о ). pH ед о то о т о је 5,62.
Изотонични 10 mМ фосфатнипуфер (PBS, енгл. phosphate buffered saline). 0,8% т о NaCl пу е
-о 2,8 m NaH2PO4 7,2 mM Na2HPO4, pH 7,2–7,4.
Хипотоничан пуферскираствор: 5 mМнатри
-јум-фосфатни (Na-PO4) пуфер, pH 7,2–7,4. о ј
е е ње 5 m NaH2PO4 5 m Na2HPO4уод -о у 1:2,5.
оло к те ј л
Отпаднакланичнаговеђакрв. о еђ к једо
-је у кл у у у. К је п ку -пљ у те л е о еод 500 ml у кој је п е -т од о те л о дод т т ко ул (50 ml 3,8%
т ју - т т ). К је ко у њ , -је т л ојте пе ту т по то до т тут
ед к т њ , де у л од ук -л њ п оте пл е л је к до ут д
у +4 °C.
Хумана крв. о 4,5 ml пе е ек д
д л јеу о кут ј е т ју - -т -то к о т ко ул о (Terumo Europe N.V.,
ел ј ). К је л т туту ед -к т њ у ео ду.
етоде
Одређивање концентрације хемоглобина. Ко
Одређивање концентрације метхемоглобина
(MetHb или HbFe3+). Ко е т ј ет е о ло -од еђ је пект о ото ет ј к од -к јо етодепо Evelyn [21].
Одређивање хематокрита. е ток т, тј. ел -т тупље о те т о т ук јеод еђ
к о е ток т ко етодо [22]. ед о т е -ток т је е к о % е т о т у к (v/v).
Добијање суспензије „пакованих еритроцита“.
у к , у ет т то је, п епо етк по тупк т ло ењ е т о т укл њ њ п оте пл е
т ко ул , лт к о у лте од п у е е, е у укл њ по т о т л у у . т о т у у о лт е пу е
к оло е т у ње к 20 min
3500 rpm ( е т у Megafuge 1.0R, Heraus). о е о е т у њу те (пл ) лој леуко т у оло куу ко п
-јо од . е потпу о укло л п оте пл е т ко ул , т ло е е -т о -т у, у од о у 1:3, е у пе до у ото -о т о у. у пе ј е т о т је о о е -о е ење е т у 15 min 3500 rpm. е т у њеје по о ље о т пут .
у пе ј п ко е т о т је до је к д је т ло е т о т п од п оте
пл епо е ото 10 m о т
пу е о уод о у 1:1. ко е т о т у л од ко ће л е л у о т љ до
ут д +4 °C.
Тест осмотске фрагилности. е то о от ке
л о т [23] де е е о етљ о т е т о -т о от ку е ол у. е то е е тепе е ол е е т о т у оп д јућ ко е т -ј т о (од 0,85 до 0% NaCl). у пе јее -т о -т у т о NaCl у о о е о е е -ње , по ле 20 min ку је о ојте пе -ту , у е т у е 5 min 2000 rpm ( е -т у Megafuge 1.0R, Heraus). упе т т , кој
д е е о ло л е т о т уп -пет ње п љ оод оје одт ло ел -е т о т у њ је е е п о 540 nm (A540) UltroSpec 3300pro пек -т о о-то е-т у (AmershamBioscience, ед к ). те -пе , тј. п о е т е ол еу ко од п т
т о је у тп е ледећој о ул :
e t
100 /
EH= Hb Hb (1)
де ед о тHbeп ед т љ п о уA540кој је п опо о л кол е о ло (Hb) у упе т ту, Hbtп ед т љ ед о тА540кој је п опо о л кол Hb о ло ође о уде т -ло ој од , тј. п 100% е ол е.
о о у до је под т к ко т у е у к е о от ке л о т које п ед т љ ју о т % е ол е од ко е т ј (%) NaCl.
Ко е т ј NaCl п којој е по т е 50% од к л е е ол е, о е к оH50, до је је о о у Boltsman-о е о д л е ел е е е е о е л еек пе е т л одо је по -д т к GraphPad Prism о т е о .
Одређивање степена осмотског бубрењаговеђих
еритроцита. тепе о от ко у ењ тј.
„swel-ling“ дек о еђ е т о т од еђ јеко -ћење д e л те ек пе е т л еп о е -ду е. п ој, ђе ој по од ко ој етод коју у д л Vitvitsky . [24], тепе о от ко у ењ јеод еђ е ење е ток т те -пе е ол ее т о т у т о оп д ју -ћ ко е т ј јо кој у п ље е
-ње у л т од о ото о 0,9%
т о NaCl пото о 5 m т ју - о -т о пу е . у од еђ њ тепе о от ко у ењ је ђе етодо п ото е -то ет је. о о удо је е улт т о е -ењ к о о о у к о коп ке л ее т о -т у у пе ј , од еђе је тепе о от ко у -ењ е т о т , к о ко е т ј т о п ко е у е т о т л (тј. у т о у у о т ле о ео теће е е ее т о т , т . „ду о “).
Одређивање степена осмотског бубрењаговеђих
еритроцитамодификованом методомпо Vitvitsky
и сар.Јед ке п е е у пе је п ко о -еђ е т о т ( едњ ед о т е ток т 70±11) о т пу е оп д јућ ко е -т ј (155, 139, 124, 109, 94, 80, 65, 50, 35, 20, 12 5 mM) у по е е до је е у пе је у
о о е о е е ње ку е 30 min о ој те епе ту . Ко е т је пу е до -је е о ј у д те у т ел 1 (коло 1).
око ку је у ке од у пе ј у ет у о од еђ ње е ток т . о теку 30 min лоје о уће е т у т у пе јее -т о -т ут ј њуод 15 min п од 3500 rpm ( е т уa Megafuge 1.0R, Heraus). о е о
е т у њу, упе т т у п љ о покуп -ље п пето у њ је е е ед о т п -о е 540 nm (A540) UltroSpec 3300pro пек -т о о-то е-т у (AmershamBioscience, ед к ). о -ко т ј њ е т у њ у пе ј е т о -т , од еђе је е ток т ку од о у -пе ј . Кол е т о т по е ток т кој
е је л ∼5×107.
тепе у ењ е т о т (swelling index) у ко од п т т о је у т по ледећој о ул :
(
)
(
(
)
)
0 t 0 t0
/ 100 / 100
V V =H −EH H −EH (2)
тепе е ол е у п т о т о у, EH0 те -пе е ол еу ото о т о у.
тепе е ол е је у т п е јед (1).
Одређивање степена бубрења проточномцито
-метријом. К од у етод од еђ ње тепе
у ењ е т о т ко ће је п ото то -ет ј . О етод о о ућ д е, оу ко појед о л о е т о т (до 105 л е т о т по у о ку), е
те тет п њ етло т токо п ол к ће -л ј у т уј лу д к о п ото то ет . е -ењ у ђе CyFlow CL п ото о то ет у (Paratec, е к ). Л е к етло ткој еодће -л ј од ј под л у ло (0,5 до 10°), тј. ет -ло т од је у п у л е ко к (forward light scatter, FSC) је п опо о л ел ће -л је. Л е к етло ткој еодћел ј од ј под у ло од 90° (side light scatter, SSC) де е те -пе ње е у ут ње ул о т . FSC SSC
јујед т е е ед о т к л
е т о т у у о ку, ко ј о д п -ет ко т д еде ле л те по -пул је ћел ј у у о ку. е улт т о е л е п к уу дуд оп ет ко FSC-SSC -то уко е е, ку л ућел ју,
п л е FSC ед о т (де у ел у ћел ј ), док е о д т л е SSC ед о т (де уу ут њу ул о т ћел ј ). о
-е у п е е е т о т у т о л -те јо кеј е, тј. тепе у ењ оод еђ -л т ко то о по 10 µl у пе је п ко е т о т дод л у 2 ml о т о пу е оп д јућо ко е т јо . о ле 20 min ку
-је о ој те еп ту е т о т у л
-п ото о то ет јо . тепе у ењ куодде уп е т о т је о уће у т по о ул :
t 0
0
/ /
V V =FSC FSC (3)
де јеFSCt ед о т FSC у п т о т о у FSC0 ед о т FSC у ото о т о у.
Микроскопска анализа еритроцита и празних
мембрана еритроцита („духова“). т о т
„ду о “ е т о т у л под к о -копо ко т то (AhioScop 2+ (Carel Zeiss, е к )) поду ећ ње о јект 40× укуп
-у ећ ње 400×. ото к о је удо је е о ђ епо оћу AxioVision 4.7 о т е (Carel Zeiss, е к ).
Контролисана хемолиза говеђих еритроцита у
мембранскомреактору. е к ј е ол е еод
-ј л у е ко е кто укој е опу о у пе јо е т о т . е кто к одул, п е -е 104 ml, е тој од т ел епло еп -те то о л к које е п ј јупо оћу ј к ( л к 1 ). е п ј њ пло ј , еђу пло е по т љ ју, п ет од о топље е оло к
т о о , елуло о- ет т е е е ел -о по од 0,8 μm п е ко од 142 mm (Sar-torius AG, Goettingen, е к ). т ље е кто
-к одулјеп к л 1 . о ј е
еђу е о п о то у ко е ће е од ј т е к ј ко т ол е е ол е. кође, п е п ј њ пло , уп о то еђуд е е е е у ује ет о о д е ј 3 cm×0,7 cm, којео е еђује е ње у ут е ко е к -то . еупотпу о т од т ок ео к
Табела 1. Зависностхематокрита (Hct), степена хемолизе(%) истепенабубрења одконцентрацијепуфера. Резултати
представљајусредњувредностпетнезависнихексперимената
Table 1. Hematocrit (Hct), the extent of hemolysis (%) and swelling index as a function of buffer concentration. Results are presented as mean ±SD values of five experiments
Ко е т ј пу е е ол у Hct тепе е ол е тепе у ењ
(m ) (%) (%) (V/Vo)
155 35±5 1,0±1,7 1,00±0,00
141 37±4 1,1±1,8 1,01±0,02
129 37±5 1,1±1,9 1,04±0,04
116 39±4 1,6±2,1 1,06±0,06
103 40±5 2,7±2,5 1,08±0,10
91 41±5 6,0±4,3 1,15±0,12
78 38±5 22,3±9,8 1,32±0,17
65 23±5 68,1±12,0 1,85± 0,58
53 11±5 87,8±6,5 1,84± 0,60
40 5±1 93,5±4,5 1,88± 0,46
34 .д. 96,2±2,2 је детекто о
27 .д. 98,96±3,6 је детекто о
те , пу е у пе ј е т о т уп е пуњењ одул от ото .
у је ло 100 ml у пе је п ко е т о т кој у епо ед оп е е ол епо е
-оло к т о о уод о у 1:1. у -пе ј е т о т је у е кто у еде по оћу пл т о п ( л к 1 ). е к о одул
у пе јо е т о т јепот п у „ е к о упо -уду“ ( т кле п е к 220 cm п е е од 10 l п ет од о пуње у 950 ml оло ко
т о ) – л к 1 . о оћу пе т лт кепу пе ( у о пу п , IP610, о ед , ео д), п отоко од 900 ml/min у одул еу од о ко
-ол пу е л у, до је е ње 8 дело 5 m т ју о т о пу е , pH 7,2–7,4 2 дел 0,9% т о NaCl. то е е о укљу -ње пу пе, укљу е је л о то ј к о о -т л от о е л a, (Yellow line OS 5 basik (Iкa Werbe GMBH & Co, е к )) ј је
л 320 о/min. њ ње јо кеј е т о -у одулу, о ло ђ о е е о ло е т о -т д у до о к о е е е т о т у
оло к т о у е кто кој .
ок е ол ејеп ће е ење п о е 540 nm (A540) т о у е кто којпо уд , тј. е
-ење п о е е ол т . е ење је ђе о UltroSpec 3300pro пект о ото ет у
(Amersham-Bioscience, ед к ). о у е п 15 min е к јеу л у е е к те л од 1 min, до 30 min у е е к те л од 3 min, до 60 min у е е к те л од 5 min, т је т ље оу е е к те л од 10 min. е к ј јеп ек ут ко 90 min.
о е о ло (PR) у јед о п о е о клу ује у т о о у ледећејед е:
h
i % 100m
PR
m
= (4)
де је mi по ет е о ло у у пе ј е т о т п е е ол е mh е о ло у
е ол ту к јуп о е .
Л
е то от ке л о т
о о дује јп е п т о от к л -о т о еђ е т о т . то ејео от к -л о т п ко е т о т е к о п о -е п о е т (%) е ол е у о т од ко -е т је NaCl. е улт т до је о еђе е т о те у упо еђе о от ко л -о ћу у е т о т ( л к 2). е то от ке
л о т јед от п у о д л ук у.
(а) (б) (в) (г)
Слика 1. Мембранскиреактор: a) деловимодула, б) састављенмодул, в) пуњењемодулаиг) процесхемолизеуреактору. Figure 1. Membrane reactor: a) module elements, b) constructed module, c) charged module and d) process of hemolysis.
Слика 2. Кривеосмотскефрагилностиговеђихихуманихеритроцита.
е улт т о де ек пе е т л о до је е улт т (Boltsman-о о д л ел е е е о л ) пок л уд по тој т т -т к ј л к еђу о еђ у е т о т у о етљ о т о от ку л у, п
е у у о еђ е т о т л ј од у . Ко е т ј NaCl п којој е по т е 50% од
к л е е ол е (H50) у ее т о теје 0,45%, докје о еђет ед о т 0,63% NaCl.
е улт т у у л о т л те ту под [25–28]. ећ о от к л о т о еђ е т о т уод о у у е ео ј њ пе
-о т у т укту е е: е о е -ђ е т о т је ње ко е у од о у у -е [29], д ње о т д л ол е о јел [28], о д т лет ол је ко е т у л о у пољ ње лоју е -е [30], по тоје л ке у у ут ћел ј кој ко е т ј јо Na+ K+.
Од еђ ње тепе о от ко у ењ о еђ
е т о т
тепе о от ко у ењ о еђ е т о т је од еђе од ко о етодо по Vitvitsky
. [24]. О етод под у е е ење е -ток т о ло ође о е о ло (тј. тепе
е ол е) е т о т у упу е к т о оп д јућ ко е т ј NaCl. т ел 1 је
п к о т е ток т , тепе (%) е о -л е тепе у ењ од ко е т је пу е .
е улт т о оло ке л ее т о т п -е е т о т о т л ко е о -л еп к у л 3.
л о до је е улт т п к ут -ел 1 пок о јед е њење ко е т -јепу е ењ ед о т е ток т , ту те -пе е ол е тепе у ењ о еђ е т о -т . е улт т к о коп ке л е ( л к 3) у пок л д о еђ е т о т , ооду о к , потпу о л ју п е оде е у „ду о е“ е пу
-њ е еупу е ј је ол о т о -л 52,7 40 m . о о у о е улт т je oдлу е о д еп о е ко т ол е е ол е
-од у о т о пу е о до је е ње 2 дел 0,9% т о NaCl 8 дело 5 m т ју
-о т о пу е , pH 7,2-7,4, ј је л ко -е т ј о л 34,8 m .
M к л тепе у ењ о еђ е т о -т је о ∼1,8 (п ко е т ј пу е од 40 m ) тоје о ео ек е улт т јућ у ду д у е т о т , које е пок ло д у ње л од о еђ е т о т , ју п -л о т тепе у ењ [31]. о то јеодлу -е од е тeпe у eњa o eђ e т o тa од -ед п oтo o тo eт jo кој п ед т љ o т a у eтoду a aл ућeл ja.
(а) (б) (в)
(г) (д) (ђ)
Сликa 3. Микрoскoпскa aнaлизa гoвeђих eритрoцитa (свeтлe ћeлиje) имeмбрaнe лизирaних eритрoцитa (тамнећeлиje) у
пуфeримa oпaдajућe joнскe jaчинe: a) 155, б) 91, в) 78, г) 65, д) 53 иђ) 34 mМ. Oбjeктивсa фaзнимкoнтрaстoм, увeћaњe oбjeктивa ×40, укупнo увeћaњe ×400.
Oд eђ aњe тeпe a o oт кo у eњa o eђ e т o тa п oтo o тo eт jo
e ултaт a п oтo e тo eт je, п кa a у o л куд oпa a eтa к FSC-SSC д ja a a пoк a-a o je дa e у oтo o a т o ууo a ajуд e у пoпулa je o eђ e т o тa, R1 R2, кoje e eђу o o a л куjу пo eд o т FSC, тj. пo eл ( л кa 4a). о тој ње е у попул ј
је о ео ек е улт т o o тодa je пojк лo тo a (п у т ое т о т л те е -л е о оло је) кa aктe т a a o eђe e т o тe [2]. пото т о (124 109 m ) ет кођеуо јуд е у попул јее -т о -т ( л ке 4 4 ). пу e у ja je ко е т -ј о л 94 m , уо е је т eћa „ћeл j кa“ у пoпулa ja o a e a кao R5, a кoja у т a п eд тa љa п a e e a e e т o тa ao тaлe пo лe e oл e, тj. „ду o e“ ( л кa 4 ). О ћел ј к
у попул ј по т једо т ј д љ -њење ол о т пу е ( л ке 4д 4ђ).
т ел 2 јеп к о т тепе у -ењ е т о т од ко е т је пу е ко -т о . то еје тепе у ењ е к о е
-л т п о е eд o т FSC у од о у FSC ед о ту oтo o a т o у. e ултaт п к a-a у тa eл 2 пoкa уjу дa у пoпулa ja aњ e т o тa R1 у , тj. пo eћa a oj п е к у oд o у a по ет у eд o т до ∼20%. oпулa ja
ећ е т о т R2 a aњ тепе у eњa пo eћa a oj п е ку oд o у a по ет у eд o т до∼10%. eђут , aкo e тeпe у eњa у попу -л је R2 a к o jeд у eд o т a пoпу -лa jу R1, до ј ед је aк aл тeпe у e-њa ∼80%, тo oдo a a тeпe у у eњa oд eђе -o eтoдo пo Vitvitsky a . [24] (т ел 1). О о ук ује тодa oкa eд o т a тeпe у eњa дo je a eтoдo пo Vitvitsky a . [24] aп a o je eaл a eд o т, e o п eд тa љa e ултaт e a e o т eтoдe кoja e o e дa a д oj ћeл j кe пoпулa je пo eл ћел ј . о еђење
е улт т o e кo ћe e eтoдe је к п ед -т ље о a л 5, a тeпe кo eлa je e ултaтa o e д e eтoдe je o o 0,95 a пoпулa jу R1 0,83 a пoпулa jу R2.
(а) (б) (в)
(г) (д) (ђ)
Сликa 4. Рeзултaти aнaлизe гoвeђих eритрoцитa прoтoчнoмцитoмeтриjoмупуфeримa oпaдajућe joнскe jaчинe: a) 155,
б) 124, в) 109, г) 94, д) 80 иђ) 78 mM. Прикaзaнисурeзултaти jeднoгрeпрeзeнтaтивнoг oдтри eкспeримeнтa.
o e ко т ол е e oл e o eђ e т o тa у e a кo eaктo у
Ко т ол e oл a је еде у e a -кo eaктo уп е ује пoo oт к пу e у о -ђе п oтoкo oд 900 ml/h. o e je т ajao 90 min. O лo aђaње e oлo a e т o тa, тj. п o e
e oл e, je п aћe a o o уп o e e aп o a e (A540) a т o a у eaктo кoj пo уд ( e oл aтa). л 6 је п к ток п о е е ол е у jeд o eп e e тaт o eк пe e ту.
о е д јеп отекло 5 min до детекто њ о ло ође о е о ло . aк aл a ко е т
-Сликa 6. Тoкконтролисанехeмoлизe гoвeђих eритрoцитa.
Figure 6. The time course of hemoglobin release during hemolysis process in the membrane reactor.
Тaбeлa 2. Стeпeнбубрeњa двe пoпулaциje гoвeђих eритрoцитa ухипooсмoтскимрaствoримa. Рeзултaтипрeдстaвљajу
срeдњуврeднoсттринeзaвиснa eкспeримeнтa
Table 2. The swelling index of two populations of bovine erythrocytes in hypoosmotic solution. Results are presented as mean ± SD values of three experiments
Ко е т ј пу e a, m 0
1/ 1
t
R R
FSC FSC 0
2/ 2
t
R R
FSC FSC 0
2/ 1
t
R R
FSC FSC
155,0 1,00±0,00 1,00±0,00 1,62±0,09
139 1,01±0,04 1,04±0,07 1,67±0,04
124 1,07±0,07 1,08±0,07 1,74±0,07
109 1,07±0,08 1,12±0,12 1,80±0,11
94 1,19±0,05 1,09±0,09 1,76±0,07
80 1,23±0,11 1,12±0,09 1,81±0,09
1,00 1,30 1,60 1,90 2,20
0 40 80 120 160
М л е (mM)
С
е
е
ењ
V/Vo (Vitvitsky 2000)
FCS R1/R1
FCS R2/R2
FCS R2/R1
Сликa 5. Стeпeнбубрeњa гoвeђих eритрoцитa oдрeђeнмoдификoвaнoммeтoдoмпo Vitvitsky исaр, (2000) (срeдњa врeд
ј е о ло je до т ут у 45. min. eђут , п o e ко т ол е е ол е je ође дo 90 min то је о о ућ ло д е по т е п о е о ло
-од 83±12% (п о е ед о т петп о е -клу ).
о е е ол е е е о једо -је к о д е е ј л п о е ко е т је е о ло (aп o a e a т o a A540). a л 7 уo a a e д је ко т ол е ол е т о
-п о е .
пeкт aл e кa aктe т кe e oл aтa у пoк a-aлe дa je дo je e oлo у o oлo к aкт o oк e oлo a (удео eт e oлo a je
о aњ oд 5%) ( л кa 8).
к o кoп к a aл е ол т до је о к ју п о е ко т ол е е ол е је пок л п у т o п a , eo тeћe e a a e т
o-тa, т . „ду o a“ (л кa 9).
КЉ Ч К
п о е у ко т ол е е ол е о еђ е -т о -т по екло отп д екл ек о уће је, п о е о ко т ол е е ол е у е -ко е кто у (укуп е п е е 1,4 l) оло т е о ло п о о од ∼83%. Опт о п о е п ет у ледећ : ко е т ј -пото о пу е ко т о је 35 m , п оток
Сликa 7. Брзинa oслoбaђaњa хeмoглoбинa изгoвeђих eритрoцитa уфункциjиврeмeнa упрoцeсукoнтрoлисaнe хeмoлизe
тoкoм 90 min трajaњa циклуса . Figure 7. Differential hemolysis curve.
Сликa 8. Aпсoрбциoниспeктaрхeмoглoбинa изхeмoлизaтa дoбиjeнoгпрoцeсoмконтролисанехeмoлизe гoвeђих eритрoцитa.
т о е ол у 900 ml/min т ј њеп о е 90 min. оло е о ло је оу о о -ло к кт о ок е о ло , д ј ет е
-о л-о јеп ел о 5%. К о е улт тп о е ко т ол е е ол е, о е о ло , до -ј -ју е т кт е п е е е е т о т т . „ду о “ кој п ед т љ јупоте ј л е о е
к п ул ју оло к кт уп т . о ј е до ле потпу о о е леко те
о ул је потпу о оло ке е е т е ку л т пе то е л уп е у.
л
О ј д је е л о у ок у о л о п ојект 46010 кој т т о п о ете уке епу л ке је еђу од о Eу eкa п ојект О !4486. уто љују кл „ “ у у у до је у о к к д пл. . ј е ћ дњ .
LITERATURA
[1] de Oliviera Roça, Humane slaughter Of Bovine. Emb-rapa: First Virtual Global Conference on Organic Beef Cattle Production; September 02 to October 15, 2002, vailable from: http://www.cpap.embrapa.br/agencia/ /congressovirtual/pdf/ingles/02en03.pdf
[2] N.C. Jain, Essentials of Veterinary Hematology, Lea & Febiger Philadelphia, 1993.
[3] S.M. Christensen, F. Medina, R.W. Winslow, S.M. Snell, A. Zegna, M.A. Marini, Preparation of human hemoglo-bin Ao for possible use as a blood substitute, J. Biochem. Biophys. Methods. 17 (1988) 143–154.
[4] H. Sakai, S. Takeoka, H. Yokohama, Y. Seino, H. Nishide, E. Tsuchida, Purification of concentrated hemoglobin using organic solvent and heat treatment, Protein. Expr. Purif. 4 (1993) 563–569.
[5] R.M. Winslow, K.W. Chapman, Pilot-scale preparation of hemoglobin solutions, Methods Enzymol. 231 (1994) 3– –16.
[6] C.T. Andrade, L.A. Barros, M.C. Lima, E.G.Azero, Purifi-cation and characterization of human hemoglobin: ef-fect of the hemolysis conditions, Int. J. Biol. Macromol.
34 (2004) 233–240.
[7] M.L. Dimino, A.F. Palmer, Purification of bovine hemo-globin via fast performance liquid chromatography, J. Chromatogr., B 856 (2007) 353–357.
[8] G. Sun, A.F. Palmer, Preparation of ultrapure bovine and human hemoglobin by anion exchange chromatography, J. Chromatogr., B 867 (2008) 1–7.
[9] P. Seeman, Transient holes in the erythrocyte mem-brane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponian and lysolecithin, J. Cell Biol. 32 (1967) 55–70.
[10] N.I. Birndorf, H. Lopas, S.J. Robboy, Disseminated intra-vascular coagulation and renal failure: Production in the monkey with autologous red blood cell stroma, Lab. Invest. 25 (1971) 314–319.
[11] M. Relihan, M.S. Litwin, Effects of stroma-free hemoglo-bin solution on clearance rate and renal function, Sur-gery 71 (1972) 395–399.
[12] W. Odling-Smee, C. McLarnon, Haemoglobin solution as an oxygen-carrying resuscitation fluid in haemorrhagic shock, Ir. J. Med. Sci. 153 (1984) 385–388.
[13] M. Feola, J. Simoni, P.C. Canizaro, R. Tran, G. Rasch-baum, F.J. Behal, Toxicity of polymerized hemoglobin solutions, Surg. Gynecol. Obstet. 166 (1988) 211–222. [14] R. Lee, N. Atsumi, E.E. Jr Jacobs, W.G. Austen, G.J.
Vla-hakes, Ultrapure, stroma-free, polymerized bovine he-moglobin solution: evaluation of renal toxicity, J. Surg. Res. 47 (1989) 407–411.
[15] D. Danon, Osmotic hemolysis by a gradual decrease in the ionic strength of the surrounding medium, J. Cell Comp. Physiol. 57 (1961) 111–117.
[16] R.D. MacGregor, C.A. Tobias, Molecular sieving of red cell membranes during gradual osmotic hemolysis, J. Memb. Biol. 10 (1972) 345–356.
[17] B. Bugarski, N. Dovezenski, Hemofarm Koncern. Ver-fahren zur Herstellung von Hemoglobin, Deutsches Pa-tentamt DE 19707508, 2000.
[18] B. Bugarski, N. Dovezenski, N. Stojanovic, D. Bugarski, Hemofarm Koncern. Emulsion containing hydrophobic
(а) (б)
Сликa 9. Микрoскoпскa aнaлизa гoвeђих eритрoцитa прe пoчeткa хeмoлизe (a) имeмбрaнe лизирaних eритрoцитa oстaлихумeмбрaнскoмрeaктoрунaкoнхeмoлизe (б). Oбjeктивсa фaзнимкoнтрaстoм, увeћaњe oбjeктивa ×40,
укупнo увeћaњe ×400.
nanodrops with bound hemoglobin molecules in a hyd-rophilic phase as a blood substitute, Deutsches Patent-amt DE 2002-10209860 WO 2003074022, 2003.
[19] A.V. Cardoso, A.O. Camargos, Geometrical aspects during formation of compact aggregates of red blood cells, Mat. Res. 5 (2002) 263–268.
[20] O.W. Van Assendelft, A.H. Holtz, S.M. Lewis, Recom-mended method for the determination of the hemoglo-bin content of blood. I.C.S.H. Publications World Health Organization, 1984, 1.4.1.
[21] K.A. Evelyn, H.A.T. Malloy, Microdetermination of oxy-hemoglobin, methemoglobin and sulfhemoglobin in a single sample of blood, J. Biol. Chem. 126 (1938) 655– –662.
[22] J.C. Sabine, D.J. Nickolai, A microhematocrit method and its use with citrated blood, Blood. 7 (11) (1952) 1128– –1131.
[23] A.K. Parpart, P.B. Lorenz, E.R. Parpart, J.R. Gregg, A.M. Chase, The osmotic resistance (fragility) of human red cells, J. Clin. Invest. 26 (1947) 636–640.
[24] V.M. Vitvitsky, E.V. Frolova, M.V. Martinov, S.V. Koma-rova, F.I. Ataullakhanov, Anion permeability and er-ythrocyte swelling, Bioelectrochemistry 52 (2000) 169– –177.
[25] S.P. Burger, T. Fujii, D.J.Hanahan, Stability of the bovine erythrocyte membrane. Release of enzymes and lipid components, Biochemistry 7 (1968) 3682–3700.
[26] W.W. Christie, in: Lipid metabolism in ruminant animals W.W. Christie, Ed., Pergamon, Oxford, 1981, pp. 95–191. [27] M. Matsumoto, M. Miwa, Study on the new
phospho-lipid, n-acyl-1-alkyl glycerophosphorylethanolamine, from bovine erythrocytes, Biochem. Biophys. Acta 296
(1973) 350–364.
[28] J. Florin-Christensen, C.E. Suarez, M. Florin-Christensen, M. Wainszelbaum, W.C. Brown, T.F. McElwain, G.H. Palmer, A unique phospholipid organization in bovine erythrocyte membranes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98
(2001) 7736–7741.
[29] S.P. Burger, T. Fujii, D.J. Hanahan, Stability of the bovine erythrocyte membrane. Release of enzymes and lipid components, Biochemistry7 (1968) 3682–3700.
[30] G. Gimenez, M. Florin-Christensen, M.L. Belaunzarán, E.L. Isola, C.E. Suárez, J. Florin-Christensen, Evidence for a relationship between bovine erythrocyte lipid mem-brane peculiarities and immune pressure from ruminal ciliates, Vet. Immunol. Immunopathol. 119 (2007) 171– –179.
[31] A.W. Jay, Geometry of the human erythrocyte, I. Effect of albumin on cell geometry, Biophys. J. 15 (1975) 205– –222.
SUMMARY
OPTIMIZATION OF GRADUAL HEMOLYSIS FOR ISOLATION OF HEMOGLOBIN FROM BOVINE ERYTHROCYTES
Radoslava Pravilović1, Slavko Mojsilović2, Ivana Kostić1, Vesna Ilić2, Diana Bugarski2, Verica зorđević1, Branko Bugarski1
1
University of Belgrade, Faculty of Technology and Metallurgy, Department of Chemical Engineering, Belgrade, Serbia 2
University of Belgrade, Institute for Medical Research, Belgrade Serbia
(Scientific paper)
In this work, we describe an optimized procedure based on gradual hemolysis for the isolation of hemoglobin derived from bovine slaughterhouse erythrocytes in a membrane bioreactor. The membrane bioreactor system provided high yields of hemoglobin (mainly oxyhemoglobin derivate) and its separation from the empty erythrocyte membranes (ghosts). Ten different concentrations of hypoto-nic media were assessed from the aspect of the extent of hemolysis, hematocrit values of the erythrocyte suspensions, cell swelling and membrane deformations induced by decreased salt concentration. Effective gradual osmotic hemolysis with an extent of hemolysis of 83% was performed using 35 mM Na-phos-phate/NaCl buffer of pH 7.2–7.4. Under these conditions most of the cell mem-branes presented the appearance of the normal ghosts under phase contrast microscope. The results show that isolation process yielded predominantly to oxy-hemoglobin. Kinetic studies showed that maximal concentration of hemoglobin was reached after 40 min, but the process cycle at which recovery of 83% was achieved lasted for 90 min.
