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ANNE Y CASTRO MARQUES
AVALIAÇÃO DOS POSSÍVEIS EFEITOS SINÉRGICOS DE ÁCIDO
LINOLEICO CONJUGADO (CLA) E FITOSTEROIS NA
REGULAÇÃO DE PARÂMETROS METABÓLICOS EM
CAMUNDONGOS.
EVALUATION OF POSSIBLE SYNERGIC EFFECTS OF
CONJUGATED LINOLEIC ACID (CLA) AND PHYTOSTEROLS IN
REGULATION OF METABOLIC PARAMETERS IN MICE.
CAMPINAS 2013
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
ANNE Y CASTRO MARQUES
AVALIAÇÃO DOS POSSÍVEIS EFEITOS SINÉRGICOS DE ÁCIDO
LINOLEICO CONJUGADO (CLA) E FITOSTEROIS NA
REGULAÇÃO DE PARÂMETROS METABÓLICOS EM
CAMUNDONGOS.
Orientador: Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Júnior
EVALUATION OF POSSIBLE SYNERGIC EFFECTS OF
CONJUGATED LINOLEIC ACID (CLA) AND PHYTOSTEROLS IN
REGULATION OF METABOLIC PARAMETERS IN MICE.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição, da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, para obtenção do título de Doutora em Alimentos e Nutrição, na Área de Concentração Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos.
Doctorate thesis presented to the Food and Nutrition Post graduation Program, of School of Food Engineering of the University of Campinas, to obtain the Ph.D. grade in Food and Nutrition, in Concentration Area of Experimental Nutrition applied to Food Technology.
CAMPINAS 2013
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANNE Y CASTRO MARQUES E ORIENTADA PELO PROF. DR. MÁRIO ROBERTO MARÓSTICA JÚNIOR.
Assinatura do Orientador
__________________________________________________________
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR
MÁRCIA REGINA GARBELINI SEVILLANO – CRB8/3647 - BIBLIOTECA DA FACULDADE DEENGENHARIA DE ALIMENTOS – UNICAMP
Informações para Biblioteca Digital
Título em inglês: Evaluation of possible synergic effects of conjugated linoleic acid (CLA) and phytosterols in regulation of metabolic parameters in mice Palavras-chave em inglês:
Conjugated linoleic acid Phytosterols
Obesity
Insulin resistance Inflammation
Área de concentração: Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos
Titulação: Doutora em Alimentos e Nutrição Banca examinadora:
Mário Roberto Maróstica Júnior Chiu Chih Ming
Dennys Ésper Cintra
Semíramis Martins Álvares Domene Ursula Maria Lanfer Marquez Data da defesa: 18-02-2013
Programa de Pós Graduação: Alimentos e Nutrição Marques, Anne y Castro.
M348a Avaliação dos possíveis efeitos sinérgicos de ácido linoleico conjugado (CLA) e fitosterois na regulação de parâmetros metabólicos em camundongos / Anne y Castro Marques. -- Campinas, SP: [s.n.], 2013.
Orientador: Mário Roberto Maróstica Júnior.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Ácido linoleico conjugado. 2. Fitosterois 3. Obesidade. 4. Resistência à insulina. 5. Inflamação. I. .Maróstica Júnior, Mário Roberto. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
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BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________ Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Júnior
Orientador - FEA/UNICAMP
_____________________________________________________ Dr. Chiu Chih Ming
Membro Titular - FEA/UNICAMP
_____________________________________________________ Prof. Dr. Dennys Ésper Correa Cintra
Membro Titular - FCA/UNICAMP
_____________________________________________________ Profª. Dra. Semíramis Martins Álvares Domene
Membro Titular - UNIFESP
_____________________________________________________ Profª. Dra. Ursula Maria Lanfer Marquez
Membro Titular - USP
_____________________________________________________ Prof. Dr. Lício Augusto Velloso
Membro Suplente - FCM/UNICAMP
_____________________________________________________ Profª. Dra. Lilia Zago Ferreira dos Santos
Membro Suplente - UERJ
_____________________________________________________ Profª. Dra. Danielle Arisa Caranti
Membro Suplente - UNIFESP
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Dedico este trabalho ao meu eterno
namorado, Diogo Kolinski Silva, e aos meus
pais, José Vitor Marques e Rejane y Castro
Marques, pelo imensurável apoio e amor
durante todos esses anos.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por permitir que eu seguisse pelo caminho que sempre sonhei, e por me dar forças para alcançar meus objetivos.
À UNICAMP, pela estrutura e oportunidades oferecidas durante o Doutorado, assim como às demais Instituições que participaram da minha formação acadêmica: UNIFRA, PUCRS e UFSM. Agradecimentos especiais às minhas queridas orientadoras Cláudia Rosa (no TCC) e Luísa Helena Hecktheuer (no Mestrado), que me guiaram pelo mundo da pesquisa.
Ao CNPq e à FAPESP, pelos recursos financeiros disponibilizados, sem os quais seria impossível executar este projeto.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Júnior, primeiramente pela coragem de orientar uma desconhecida. Também pela autonomia que me deste, pela confiança e pelas expectativas que depositaste em mim. Mas, acima de tudo, pelo ser humano que mostraste ser, preocupado com o presente e com o futuro de tuas orientandas. Obrigada mesmo, chefe!
Ao Prof. Dr. Lício Augusto Velloso, por colaborar com o delineamento deste trabalho, por abrir as portas do Laboratório de Sinalização Celular (Labsincel) sem exigir nada em troca, por dividir o seu imenso conhecimento e por ser um exemplo a ser seguido.
Ao Prof. Dr. Dennys Ésper Cintra, por ter sanado milhares de vezes minhas dúvidas, pelas palavras de incentivo e por me guiar pelo “mundo da expressão gênica”. Foste mais do que um colega ou co-orientador na execução deste trabalho; foste um amigo!
Ao Dr. Chiu Chih Ming, o qual eu conheci durante as aulas no Laboratório de Óleos e Gorduras (LOG), e acabou se tornando meu “conselheiro” sempre que o assunto era Tecnologia de Alimentos. Chiu, obrigada pelas várias ajudas e pela amizade!
Aos demais membros da Banca, Profª. Dra. Semíramis Domene, Profª Dra. Ursula Marquez, Profª Dra. Danielle Caranti e Profª Dra. Lilia dos Santos, pelo tempo despendido
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na correção do trabalho, assim como pelas valiosas contribuições para a melhoria do mesmo. À Lilia um agradecimento em especial, por ter sido, juntamente com a Adriana Botelho, a pioneira em nosso Grupo de Pesquisa a trabalhar com CLA e, consequentemente, por ter influenciado muito a direção desta tese.
Aos servidores da UNICAMP, por toda a ajuda e dedicação ao trabalho. Soely, Susana, Cidinha, Dona Marta, Cosme e Marcos, vocês fazem a máquina girar! Muitíssimo obrigada!
À Cognis do Brasil, pela doação dos suplementos utilizados neste trabalho, assim como aos 40 camundongos que participaram do experimento.
Ao Labsincel, pela estrutura, técnicas, aulas e oportunidades disponibilizadas, assim como pelas pessoas maravilhosas com as quais tive a oportunidade de conviver. Agradecimentos especiais pela colaboração, risadas, cafés e amizade a: Joseane Morari, Carina Sólon, Rodrigo Moura, Letícia Souza, Bruna Bombassaro, Dani Razolli, Érika Anne, Lucas Nascimento e Andrezza Kinote.
Ao LOG, pela parceria em relação às técnicas de determinação de ácidos graxos e de fitosterois. Agradeço, em especial, ao Dr. Renato Grimaldi, à Profª. Lireny Guaraldo, e aos alunos Rodrigo Basso e Júlio César Rocha. Que o LOG continue unindo conhecimento e alegria em sua trajetória!
Ao Grupo de Pesquisa “Nutrição, Compostos Bioativos e Saúde”, do qual fiz parte nestes 4 anos. Gurias, vocês, além da colaboração intelectual e braçal, se tornaram grandes companheiras de laboratório, de viagens e de vida: Nathalia Dragano, Cinthia Cazarim, Vivian Vieira, Glaucia Carielo, Cibele Furlan, Juliana Silva, Ângela Batista, Thalita Colomé (agregada) e Carina Palazzo (nossa querida IC). Vocês estarão sempre no meu coração! Agradecimentos especialíssimos para Cinthia, Ângela e Nathalia, que se encarregaram da entrega física da tese... Sem vocês este momento seria bem mais complexo!
À minha família formada em Campinas: Daniela Gasparetto, Elisa Bernardes, Nathalia Dragano e Paula Uggioni (e Miguelzinho). Nós compartilhamos momentos alegres
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e tristes, a saudade das nossas famílias, os desafios do dia-a-dia como alunas de pós-graduação, os feriados trabalhando (e alguns fazendo festa, é claro)... Amo vocês, e tenho certeza de que nem o tempo nem a distância reduzirão nossa amizade. Nada que eu escreva aqui vai representar realmente a importância de vocês na minha vida! E como não poderia deixar de ser, agradecimento também aos maridos Miguel e Adriano, por me “emprestarem” por várias e várias horas semanais essas preciosidades!
Neste momento especial, agradeço novamente à Nathalia Dragano. Minha Baby, tu foste fundamental, desde o princípio, para a elaboração e execução deste trabalho! Apesar de não estudarmos inicialmente o mesmo assunto, quis o destino que conseguíssemos unir nossas forças e interesses em uma só direção. Ganhei uma colaborada dedicada, um braço esquerdo (e direito) forte, uma colega verdadeira, uma amiga para sempre. Digo e repito que tu és tão responsável por este trabalho quanto eu; ele é NOSSO. Obrigada, obrigada e obrigada por TUDO!
Às minhas amadas irmãs de coração do RS, que ficaram, de longe, torcendo pelo meu sucesso: Ana Paula Silva, Geovana Bolzan, Giane Silva, Juliana da Costa, Larissa Alves, Luana Alves, Tessa Valente, Tiffany Hautrive e Treice Lima. O carinho e a amizade de vocês foram alicerces para que eu superasse a distância, a saudade, e pudesse executar meu trabalho. Obrigada por todos esses anos de caminhada juntas, mesmo que não próximas fisicamente!
À Milena Bagetti, que vivenciou comigo a experiência de sair de Santa Maria para fazer doutorado na FEA. Obrigada pela companhia e por me apresentar Campinas!
Aos entes queridos dos quais não consegui me despedir devido à distância, agradeço pelo carinho durante o tempo que passamos lado a lado. Vô Dalvi, Vó Elmira e Pancita, saudade de vocês!
A toda minha família pelo carinho, amor e apoio. Pai e mãe, vocês me ensinaram desde cedo que a única coisa que se leva da vida é a educação. Vocês me mostraram desde o princípio que a existência não tem valor se não formos úteis. Vocês me ensinaram que o sucesso é importante, mas que não vale nada se para isso tiver que usar de má fé ou de meios escusos. E vocês me deram todas as armas para que eu buscasse os meus ideais.
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Marcelo (maninho), obrigada por ter segurado as “pontas” em casa enquanto eu estava longe!
Ao Diogo agradeço pelo companheirismo, amor, carinho, amizade e todos os sentimentos bons com os quais me presenteia diariamente. Tu fizeste parte de todos os momentos importantes da minha vida, sempre me confortando nas horas difíceis e comemorando comigo as vitórias. Obrigada por deixar teus objetivos de lado para seguir comigo nesse sonho maluco chamado Doutorado! Essa tese certamente também é fruto teu, já que participaste, mesmo que não oficialmente, da sua construção. Nem todos os obrigadas do mundo são suficientes para te agradecer!
Mais uma vez, obrigada a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste trabalho.
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“O importante é não
“O importante é não
“O importante é não
“O importante é não parar de questionar.”
parar de questionar.”
parar de questionar.”
parar de questionar.”
Albert Einsten
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RESUMO
As mudanças no estilo de vida da população, tais como as alterações no hábito alimentar e o maior sedentarismo, levam ao aumento da prevalência de doenças crônicas não transmissíveis, entre as quais se destaca a obesidade. Com o intuito de controlar esse grande problema de saúde pública, vários compostos bioativos têm sido investigados. O ácido linoleico conjugado (CLA), família de isômeros do ácido linoleico, apresenta diversas funções biológicas positivas, tais como anticarcinogênico, imunomodulador e regulador do balanço energético e da composição corporal. Apesar de sua potencialidade na redução do peso corporal, o CLA também apresenta efeitos biológicos adversos (resistência à insulina e aumento da oxidação lipídica), os quais limitam sua utilização. Os fitosterois, lipídios encontrados em alimentos de origem vegetal, reduzem os níveis de colesterol sérico, a inflamação e o risco de doenças cardiovasculares. Por se tratarem de substâncias com comprovado efeito biológico, é possível que a interação entre CLA e fitosterois melhore ou potencialize seus efeitos. Este trabalho teve como objetivo investigar a ação destes compostos na prevenção da obesidade induzida por dieta rica em gordura. Quarenta camundongos Swiss machos receberam dietas hiperlipídicas suplementadas com CLA e/ou fitosterois, na concentração de 2%, por nove semanas. Foram avaliados ingestão energética, ganho de peso, composição corporal, perfil lipídico sérico (colesterol total, HDL-colesterol, triglicérides e ácidos graxos livres), leptina sérica, testes de tolerância à glicose e à insulina, via da insulina no fígado e no tecido adiposo (proteínas Akt, FoxO e JAK-2), inflamação no fígado, tecido adiposo e hipotálamo (JNK, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α), além da modulação dos receptores ativados por proliferadores peroxissômicos (PPARs) α e γ no fígado, tecido adiposo e hipotálamo. Os dados paramétricos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de
Kruskal-Wallis. Quando aplicável (p < 0,05), foram realizados os respectivos testes post-hoc (Tukey
ou Dunns). A suplementação concomitante de CLA e fitosterois não alterou a ingestão energética, mas reduziu significativamente o ganho de peso, e aumentou a concentração de massa magra e de minerais. Foram reduzidos os níveis de massa gorda, de leptina sérica e dos PPARs no fígado e no tecido adiposo dos animais. Neste grupo não se observou alteração no perfil lipídico. Apesar dos animais terem desenvolvido resistência à insulina, a utilização de CLA mais fitosterois apresentou efeito sinérgico, com redução da inflamação hepática e melhora na via insulínica no fígado e no tecido adiposo, em relação ao grupo obeso. A suplementação de CLA e fitosterois reduziu, em camundongos, os danos causados pela ingestão de dieta hiperlipídica, entretanto mais estudos são necessários para compreender os mecanismos de ação e definir as melhores doses.
Palavras-chave: Ácido linoleico conjugado, fitosterois, obesidade, resistência à insulina,
inflamação.
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ABSTRACT
The changes in the population lifestyle, such as bad eating habits and more sedentarism, led to increased prevalence of chronic diseases, including obesity. Various compounds have been investigated in order to control this major public health problem. Conjugated linoleic acid (CLA), a family of isomers of linoleic acid, has various positive biological functions, such as anticarcinogenic, immunomodulatory and energy balance and body composition regulations. Despite the potential in reducing body weight, CLA also has adverse biological effects (insulin resistance and increased fat oxidation), which limit it use. Phytosterols, lipids found in vegetable foods, reduce serum cholesterol levels, inflammation and cardiovascular disease risk. CLA and phytosterols are related to substances with proven biological effect. It is possible that the interaction between then improves and/or enhance these effects. This study aimed to investigate the action of these compounds in the prevention of obesity induced by high-fat diet. Forty male Swiss mice received a high-fat diet supplemented with CLA and/or phytosterols, at a concentration of 2%, for nine weeks. Energy intake, weight gain, body composition, serum lipid profile (total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides and free fatty acids), serum leptin, glucose and insulin tolerance tests, insulin pathway in liver and adipose tissue (Akt, FoxO and JAK-2 proteins), inflammation in liver, adipose tissue and hypothalamus (JNK, IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α), and modulation of peroxisomal proliferator activated receptors (PPARs) α and γ in liver, adipose tissue and hypothalamus were assessed. Parametric data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and nonparametric data were analyzed by Kruskal-Wallis test. When applicable (p <0.05) were performed its post-hoc tests (Tukey or Dunns). Concomitant supplementation of phytosterols and CLA did not alter energy intake, but significantly reduced weight gain, and increased lean mass and minerals concentration. Fat mass, serum leptin and PPARs, in liver and adipose tissue, were reduced in the animals. In CLA plus phytosterols group there was no change in lipid profile. Although the animals have developed insulin resistance, the use of CLA plus phytosterols showed a synergistic effect, with reduction in hepatic inflammation and improvement in the insulin pathway in liver and adipose tissue, compared to the obese group. CLA and phytosterols supplementation reduced, in mice, the damage caused by the intake of high-fat diet, however, more studies are needed to understand the mechanisms of action and define the best doses.
Keywords: Conjugated linoleic acid, phytosterols, obesity, insulin resistance,
inflammation.
15 SUMÁRIO INTRODUÇÃO……… 18 1 OBJETIVOS……….. 20 1.1 OBJETIVO GERAL……… 20 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………... 20 CAPÍTULO I……… 21 2 REVISÃO DE LITERATURA... 21 2.1 OBESIDADE... 21
2.2 ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA)... 25
2.2.1 Efeito do CLA na composição corporal e no metabolismo de carboidratos e lipídios... 30
2.2.2 Efeitos do CLA no cérebro... 33
2.2.3 CLA na oxidação lipídica... 35
2.3 FITOSTEROIS... 36
2.3.1 Efeito hipocolesterolêmico... 38
2.3.2 Outros efeitos biológicos dos fitosterois... 42
2.3.3 Ácido linoleico conjugado e fitosterois... 44
REFERÊNCIAS... 46
CAPÍTULO II... 59
3 REDUÇÃO DO PESO E DA GLICEMIA RESULTANTE DA SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO E FITOSTEROIS À DIETA HIPERLIPÍDICA DE CAMUNDONGOS... 59
RESUMO... 60
ABSTRACT... 61
3.1 INTRODUÇÃO... 62
3.2 MATERIAL E MÉTODOS... 64
3.2.1 Suplementos utilizados no estudo... 64
3.2.2 Determinação do perfil de ácidos graxos... 64
3.2.3 Análise dos fitosterois... 64
3.2.4 Dietas... 65 3.2.5 Animais... 65 3.2.6 Análise estatística... 66 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 67 CONCLUSÃO... 75 AGRADECIMENTOS... 75 COMITÊ DE ÉTICA... 75 REFERÊNCIAS... 76 xv
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CAPÍTULO III... 80
4 CONJUGATED LINOLEIC ACID AND PHYTOSTEROLS AFFECT MICE’S CARCASSE COMPOSITION………..…….. ABSTRACT……….. 80 81 4.1 INTRODUTION……….. 82
4.2 MATERIALS AND METHODS………. 83
4.2.1 Supplements………. 83
4.2.2 Diets……….…. 83
4.2.3 Animals and biological analysis………. 85
4.2.4 Statistical analysis………... 85
4.3 RESULTS……… 86
4.3.1 Diets……….. 86
4.3.2 Energy intake and weight gain……….. 86
4.3.3 Body composition……… 87 4.4 DISCUSSION……….. 90 CONCLUSION………. 93 ACKNOWLEDGMENT... 93 REFERENCES... 94 CAPÍTULO IV... 98
5 CONJUGATED LINOLEIC ACID (CLA) PLUS PHYTOSTEROLS COULD ACT SINERGISTICALY TO AMELIORATE THE HEALTH OF HIGH-FAT FED MICE?... 98
ABSTRACT……….. 99
5.1 INTRODUCTION………... 100
5.2 MATERIAL AND METHODS………... 102
5.2.1 Antibodies, chemicals, and buffers……… 102
5.2.2 Supplements………. 102
5.2.3 Animals and diets……… 103
5.2.4 Intraperitoneal glucose tolerance test (iGTT) and insulin tolerance test (ITT)………... 104
5.2.5 Serum and tissues……… 105
5.2.6 Protein blotting analysis………. 105
5.2.7 RNA extraction and quantitative real-time PCR………. 106
5.2.8 Statistical analysis………... 106
5.3 RESULTS……… 107
5.3.1 Energy intake, body weight, and serum leptin concentration………… 107
5.3.2 Glucose intolerance and insulin resistance………... 108
5.3.3 Insulin signal transduction………. 109
5.3.4 Inflammation………... 111 5.3.5 Lipid metabolism………. 114 5.4 DISCUSSION……….. 116 CONCLUSION………. 120 ACKNOWLEDGMENTS... 120 REFERENCES………. 121 xvi
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CONCLUSÃO... 126
REFERÊNCIAS... 127
ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA... 130
ANEXO B – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO... 131
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INTRODUÇÃO
A dieta e a nutrição são fatores que atuam diretamente na promoção e na manutenção de uma boa saúde, em todos os estágios da vida. As mudanças no estilo de vida da população na última década, tais como a ingestão de alimentos hipercalóricos, sobretudo ricos em gorduras saturadas, combinados com o declínio do gasto energético associado ao sedentarismo e a fatores de ordem psicossocial, levaram ao aumento da prevalência de doenças crônicas não transmissíveis (VELLOSO, 2009; GARCÍA-CAÑAS et al., 2010).
A obesidade traz consigo comorbidades associadas, tais como hipertensão, diabetes
mellitus, dislipidemia, intolerância à glicose e câncer (MOKDAD et al., 2003; GALIC;
OAKHILL; STEINBERG, 2010), sendo por isso responsável por grande parte dos casos de invalidez e mortes prematuras, tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (WHO, 2002). O aumento da prevalência da obesidade e do sobrepeso vem acarretando consequências socioeconômicas substanciais aos já sobrecarregados orçamentos nacionais de saúde. Mais preocupante é o fato que, de acordo com projeções da Organização Mundial de Saúde, caso nenhuma modificação importante das tendências atuais ocorra, as prevalências deverão atingir níveis maiores que 50% nos Estados Unidos e maiores que 25% no Brasil, no ano de 2025 (VELLOSO, 2006; WANG et al., 2011; BRASIL, 2012).
A tendência das pesquisas em Nutrição vem perdendo o enfoque epidemiológico e fisiológico clássicos. Atualmente é reconhecida a importância de se compreender o efeito dos nutrientes e compostos bioativos presentes nos alimentos em concentrações moleculares e como estes podem atuar na prevenção de patologias, principalmente àquelas diretamente relacionadas à ingestão alimentar (MEAD, 2007).
O ácido linoleico conjugado (CLA) vem recebendo destaque devido a sua função biológica como anticarcinogênico, imunomodulador e, principalmente, regulador do balanço energético e da composição corporal (BASSAGANYA-RIERA; HONTECILLAS; BEITZ, 2002; OBSEN et al., 2012; PARK; PARK, 2012) . Apesar dos efeitos benéficos apontados, o CLA também vem sendo investigado por seus efeitos biológicos adversos,
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como causar ou favorecer a resistência à insulina e atuar como pró-oxidante in vivo (SANTOS-ZAGO; BOTELHO, OLIVEIRA, 2008; PARK, 2009).
Outros compostos classificados como lipídio que vem recebendo a atenção da mídia e de pesquisadores são os fitosterois, substâncias presentes em plantas e análogas ao colesterol (
KRITCHEVSKY; CHEN, 2005)
. Os fitosterois promovem a redução dos níveis de colesterol sérico, consequentemente reduzindo o risco de doenças cardiovasculares (ACÍN et al., 2007), além de atuarem como antioxidantes (MANNARINO et al., 2005) e anticarcinogênico (LLAVERIAS et al., 2012).Por se tratarem de substâncias com comprovado efeito biológico, é possível que a interação entre CLA e fitosterois melhore ou potencialize seus efeitos. Entre as respostas esperadas com a suplementação concomitante dos compostos está a maior absorção dos fitosterois pelo organismo, pois a união de um fitosterol a um ácido graxo de cadeia longa aumenta a solubilidade do composto. Tanto o CLA como os fitosterois ultrapassam a barreira hematoencefálica, o que poderia culminar na redução da inflamação hipotalâmica e no melhor controle do metabolismo energético. Além disso, é admissível a redução dos efeitos adversos causados pelo CLA, tais como esteatose hepática, atividade pró-oxidante e hiperglicemia, assim como a melhora da composição corporal (COULTATE, 2002; NTANIOS et al.; 2003; JANSEN et al.; 2006).
Nesse sentido, o escopo do presente trabalho é investigar a ação do ácido linoleico conjugado (CLA) e dos fitosterois sobre os mecanismos fisiológicos e moleculares, na prevenção da obesidade in vivo.
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1 OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar as possíveis alterações causadas pela suplementação de ácido linoleico conjugado (CLA) e de fitosterois no perfil lipídico, na composição corporal, na resistência à insulina e no processo inflamatório, em camundongos.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a composição em ácidos graxos e de fitosterois dos suplementos óleo de cártamo, CLA Tonalin® e fitosterois Vegapure 95FF;
determinar a composição centesimal das dietas experimentais; avaliar a ingestão energética e o ganho de peso de camundongos;
determinar a composição corporal assim como o perfil lipídico, bioquímico e hormonal dos animais;
analisar a atividade da via da insulina no fígado e no tecido adiposo dos camundongos;
determinar a expressão de proteínas da via inflamatória e dos receptores ativados por proliferadores peroxissômicos (PPARs) α e γ, no hipotálamo e no fígado de camundongos submetidos às diferentes dietas experimentais.
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CAPÍTULO I
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OBESIDADE
No princípio de 2012, o Ministério da Saúde divulgou um estudo, com duração de seis anos, sobre a saúde dos brasileiros. Este documento, intitulado “Vigitel Brasil 2011: vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico” trouxe dados alarmantes: mais da metade da população brasileira está acima do peso, sendo 48,5% com sobrepeso (IMC > 25) e 15,8% com obesidade (IMC > 30) (BRASIL, 2012). Para mensurar o avanço do problema, em 1993, aproximadamente 32% da população brasileira apresentava sobrepeso e 8% obesidade (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007); o número de obesos duplicou em pouco mais de uma década. E a estimativa para o futuro próximo não é animadora: acredita-se que em 2025 em torno de 25% dos brasileiros estarão obesos (KOPELMAN, 2000).
A obesidade, uma doença crônica não transmissível, é a consequência do desequilíbrio entre a ingestão e o gasto energético, no qual ocorre balanço calórico positivo e excessivo acúmulo de gordura (FLIER, 2004; CABALLERO, 2007). Entre as implicações do excesso de peso encontram-se dislipidemias, diabetes mellitus, doenças cardiovasculares, asma, apneia, problemas ortopédicos, câncer, esteatose hepática e distúrbios psicológicos (GALIC; OAKHILL; STEINBERG, 2010). Wang et al. (2011) estimaram que os gastos com o tratamento da obesidade e de suas doenças associadas, em 2030, será entre 48 e 60 bilhões de dólares por ano no Estados Unidos, e de aproximadamente 2 bilhões de libras por ano no Reino Unido.
Além do envelhecimento da população (com o avançar da idade, a gordura é facilmente adquirida e dificilmente eliminada) e do maior sedentarismo, outra importante causa para a alta prevalência da obesidade é a alteração dos padrões alimentares, com o maior consumo de dietas excessivamente calóricas. De acordo com os dados do Vigitel
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Brasil 2011, cerca de 80% dos sujeitos entrevistados ingerem refrigerantes diariamente, em contrapartida, menos de 70% consomem uma porção de feijão ou leguminosas por dia. O alto consumo de gordura saturada, presente em alimentos como carnes e leite integral, também foi identificado na pesquisa (BRASIL, 2012). Somando-se às causas apontadas anteriormente, a genética também apresenta papel crucial no crescimento da epidemia da obesidade. Sabe-se atualmente que a obesidade depende mais da carga genética do que várias outras doenças, entre as quais esquizofrenia e problemas cardiovasculares (CINTRA; ROPELLE; PAULI, 2011).
Estudos têm mostrado que o hipotálamo, responsável pela regulação do mecanismo fome-saciedade, é o órgão primeiramente afetado na obesidade. A ingestão de dietas ricas em lipídios saturados induz à ativação de uma resposta inflamatória nas áreas hipotalâmicas envolvidas com o controle da fome e da termogênese, lesando os circuitos neuronais que mantêm o controle homeostático das reservas corporais de energia. Com o tempo, grupos de neurônios vão sendo destruídos, o controle homeostático da energia corporal é perdido e aumenta o ganho de massa adiposa (VELLOSO, 2009; MILANSKI et al., 2009).
Além das alterações do controle hipotalâmico na fome-saciedade e no gasto energético, o reconhecimento e a utilização de insulina pelo organismo sofrem mudanças em decorrência do tecido adiposo excessivo. A insulina atua sobre o metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios, exercendo um efeito dominante na regulação da homeostase da glicose (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2009). A obesidade e a resistência à insulina, somadas a outras características tais como acúmulo de gordura na região mesentérica, dislipidemia, diabetes mellitus tipo 2 (DM 2), hipertensão arterial sistêmica e/ou microalbuminúria, compõe um quadro conhecido como síndrome metabólica ou síndrome X. A prevalência dessa síndrome vem aumentando exponencialmente, e seu diagnóstico requer a presença de obesidade abdominal, como condição essencial, e dois ou mais dos critérios citados anteriormente (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007). Diversos mecanismos fisiológicos são alterados na síndrome metabólica: ativação ou redução na secreção de hormônios (insulina, leptina e adiponectina), ativação das vias inflamatórias, modificações na expressão gênica dos
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receptores ativados por proliferadores peroxissômicos (PPARs) e no metabolismo dos lipídios (CARVALHO; COLAÇO; FORTES, 2006; CARVALHO-FILHO et al., 2007).
A leptina é uma proteína de 167 aminoácidos secretada pelo tecido adiposo, que regula o apetite e o gasto de energia, via sistema hipotalâmico. Ela é codificada pelo gene
ob, o qual é predominantemente expresso pelos adipócitos, e seus níveis plasmáticos se
correlacionam bem com a massa de gordura corporal e com a ingestão de alimentos, aumentando no período pós-prandial (CARVALHO, COLAÇO; FORTES, 2006; ROSADO et al., 2006). Este hormônio é, sem dúvida, o mais importante sinal periférico responsável por estabelecer uma conexão entre os sítios de estoque de energia e o sistema nervoso central. Por esta razão, a leptina é considerada uma molécula-chave na regulação da homeostase energética e controle da ingestão alimentar, juntamente com a insulina, considerada o segundo mais importante sinalizador periférico para o hipotálamo (VELLOSO, 2006).
O tecido adiposo foi considerado, por longo período, como um simples depósito energético, na forma de triglicérides. Atualmente, ele é conhecido como um órgão endócrino ativo que se comunica com o sistema nervoso central e com tecidos periféricos por meio da secreção de substâncias chamadas adipocinas ou citocinas (FRANSSEN et al, 2008). Estas substâncias são proteínas de baixo peso molecular, com diversas funções metabólicas e endócrinas, que participam da inflamação e da imunomodulação. Assim, o aumento da massa de tecido adiposo está associado com alterações da produção de citocinas, com aumento da expressão dos mediadores inflamatórios fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e diminuição da expressão de adiponectina. A adiponectina é uma proteína plasmática de aproximadamente 30KDa, também secretada pelo tecido adiposo, que exerce efeito antiinflamatório e antidiabético. A redução da massa de tecido adiposo, por redução de peso, reduz TNF-α, IL-6 e aumenta os níveis de adiponectina, melhorando a sensibilidade à insulina. Por estes motivos, a obesidade e a DM II vem sendo consideradas pelos especialistas como condições inflamatórias (MATSUZAWA et al., 2004; WELLEN; HOTAMISLIGIL, 2005; CARVALHO, COLAÇO; FORTES, 2006).
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Os PPARs são proteínas pertencentes à superfamília dos receptores nucleares de hormônios, sendo fatores de transcrição dependentes de ligantes. Estes receptores regulam diversos aspectos da homeostase energética, dos metabolismos lipídico, proteico e glicídico, da síntese de ureia e da imunomodulação, podendo funcionar como moléculas-chave em diversas alterações metabólicas. Foram identificadas até o momento 3 isoformas de PPARs (α, β e γ), as quais apresentam distinta distribuição tissular, refletindo em diferentes funções biológicas (LEMBERGER et al., 1996; PANADERO et al., 2008). O PPARα é expresso predominantemente em tecidos com alto nível de catabolismo de ácidos graxos, como fígado, coração e músculo, e sua ativação aumenta a oxidação de ácidos graxos, diminui os níveis de triglicérides circulantes e consequentemente reduz a hipertrofia e a hiperplasia dos adipócitos (YOON, 2009). O PPARγ é o maior fator de transcrição adipogênico, responsável por induzir a captação de glicose e de ácidos graxos, assim como estimular a diferenciação dos adipócitos (TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN, 1995). Diversos compostos são reconhecidos como ligantes dos PPARs e, por conseguinte, apresentam a capacidade de modular sua atividade. Entre estes compostos estão o ácido linoleico conjugado e os fitosterois, os quais serão explanados nos tópicos 2.2 e 2.3 deste capítulo.
Na Figura 1 são resumidos os principais mecanismos de ação relacionados ao desenvolvimento da obesidade. Conforme foi mencionado anteriormente, a obesidade é uma doença multifatorial, que vem crescendo vorazmente em todo o mundo. É medida urgente que se conheça melhor os mecanismos envolvidos com o surgimento e manutenção do quadro, assim como se reconheçam formas de tratá-la e evitá-la. Além disso, políticas públicas precisam ser pensadas e executadas com o intuito de controlar essa epidemia, visando sempre a qualidade de vida da população.
Figura 1. Principais mecanismos de ação relacionados ao desenvolvimento da obesidade.
2.2 ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA)
O ácido linoleico conjugado (CLA) é uma mistura de ácidos graxos insaturados da família dos ácidos octadecadienóicos, isômeros geométricos e d
(C18:2, 9c,12c), sendo que as duas ligações insaturadas conjugadas iniciam, predominantemente, nos carbonos 9, 10 ou 11. Em relação à isomeria geométrica, o CLA pode ser encontrado nas configurações
na configuração cis (GUNSTONE; HERSLÖF, 2
al., 2005). Na Figura 2 é possível observar as diferenças entre o ácido linoleico e os isômeros 9c,11t e 10t,12c do ácido linoleico conjugado
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Principais mecanismos de ação relacionados ao desenvolvimento da obesidade.
.2 ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA)
conjugado (CLA) é uma mistura de ácidos graxos insaturados da família dos ácidos octadecadienóicos, isômeros geométricos e de posição do ácido
), sendo que as duas ligações insaturadas conjugadas iniciam, predominantemente, nos carbonos 9, 10 ou 11. Em relação à isomeria geométrica, o CLA pode ser encontrado nas configurações cis e trans, enquanto o ácido linoleico
GUNSTONE; HERSLÖF, 2000; COULTATE, 2002; MOURÃO et Na Figura 2 é possível observar as diferenças entre o ácido linoleico e os
do ácido linoleico conjugado.
Principais mecanismos de ação relacionados ao desenvolvimento da obesidade.
conjugado (CLA) é uma mistura de ácidos graxos insaturados da e posição do ácido linoleico ), sendo que as duas ligações insaturadas conjugadas iniciam, predominantemente, nos carbonos 9, 10 ou 11. Em relação à isomeria geométrica, o CLA linoleico existe apenas , 2002; MOURÃO et Na Figura 2 é possível observar as diferenças entre o ácido linoleico e os
Figura 2. Estrutura química do ácido linoleico, do CLA
O CLA é formado a partir da biohidrogenação de ácidos graxos poliinsaturados provenientes da dieta, por meio da ação de bactérias específicas (tais como a
fibrisolvens) presentes no trato gastrointestinal de animais ruminantes. Também pode ser
formado por ação das enzimas isomerases e dessaturases no rúmen e na glândula mamária em lactação, passando a compor principalmente a gordura e o leite de
(GUNSTONE; HERSLÖF, 2000; MOURÃO
mar apresentam concentrações baixas de CLA, entretanto o aquecimento do óleo pode aumentar a quantidade dos isômeros
As quantidades de CLA encontradas em alguns alimentos de cream cheese; 140,0 mg CLA/100
mozzarella; 14,2 mg CLA/ 100
1,9% de gordura (LIN et al., 1995).
variam de 140 mg a 1g dia, dependendo da metodologia utilizada e dos hábitos alimentares da população avaliada (BRASIL, 2007
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Figura 2. Estrutura química do ácido linoleico, do CLA 9c,11t e do CLA 10t,12c
O CLA é formado a partir da biohidrogenação de ácidos graxos poliinsaturados provenientes da dieta, por meio da ação de bactérias específicas (tais como a
presentes no trato gastrointestinal de animais ruminantes. Também pode ser formado por ação das enzimas isomerases e dessaturases no rúmen e na glândula mamária em lactação, passando a compor principalmente a gordura e o leite de
2000; MOURÃO et al., 2005). Os óleos vegetais e frutos do mar apresentam concentrações baixas de CLA, entretanto o aquecimento do óleo pode aumentar a quantidade dos isômeros trans (ALASNIER et al., 2002; COULTATE,
s quantidades de CLA encontradas em alguns alimentos lácteos são: 143,0 mg CLA/100 g de queijo cheddar; 92,0 mg CLA/100 100 g de leite integral; e 8,0 mg CLA/100 g de
(LIN et al., 1995). As estimativas de consumo de CLA por seres humanos mg a 1g dia, dependendo da metodologia utilizada e dos hábitos alimentares da população avaliada (BRASIL, 2007a).
10t,12c.
O CLA é formado a partir da biohidrogenação de ácidos graxos poliinsaturados provenientes da dieta, por meio da ação de bactérias específicas (tais como a Butyrovibrio presentes no trato gastrointestinal de animais ruminantes. Também pode ser formado por ação das enzimas isomerases e dessaturases no rúmen e na glândula mamária em lactação, passando a compor principalmente a gordura e o leite destes animais et al., 2005). Os óleos vegetais e frutos do mar apresentam concentrações baixas de CLA, entretanto o aquecimento do óleo pode COULTATE, 2002). 143,0 mg CLA/100 g CLA/100 g de queijo g de iogurte com As estimativas de consumo de CLA por seres humanos mg a 1g dia, dependendo da metodologia utilizada e dos hábitos alimentares
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O CLA ainda pode ser produzido industrialmente por aquecimento do ácido linoleico em condições alcalinas, ou por hidrogenação parcial do ácido linoleico (BANNI, 2002). Entre os isômeros, o mais abundante é o CLA 9c,11t (denominado trivialmente como ácido rumênico), o qual tem mostrado ser antimutagênico e antioxidante (GUNSTONE; HERSLÖF, 2000; COULTATE, 2002; MOURÃO et al., 2005). Além do ácido rumênico, outro isômero bastante estudado é o 10t,12c; esse isômero é apontado, principalmente, como redutor da gordura corporal (OBSEN et al., 2012), e sua atividade biológica será elucidada no item 2.2.1 deste capítulo.
Desde que foi descoberto, o CLA vem sendo estudado devido a sua atividade biológica, entre as quais se destaca o efeito inibitório sobre o crescimento de células cancerígenas mamárias, de cólon, leucêmicas, de próstata e gástricas (PARIZA et al., 1979; SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2008). Nas últimas décadas, as pesquisas ainda têm como enfoque a atuação do CLA no câncer, mas principalmente na obesidade, na atividade antioxidante e na imunomodulação, conforme pode ser observado na Tabela 1.
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Tabela 1. Estudos sobre a atividade biológica do ácido linoleico conjugado (CLA) Atividade
biológica Condições Resultados Referência
Proteção contra tumor mamário
Ratas Sprague-Dawley alimentadas com 10% a 20% de lipídios (blend de origem vegetal, óleo de milho ou banha). Mistura de isômeros de CLA, 1% da dieta, por 8 semanas.
Ação anti-carcinogênica do CLA independe da quantidade e da qualidade dos lipídios dietéticos.
IP et al., 1996.
Proteção contra tumor mamário
Camundongos BALB/c fêmeas, dieta hiperlipídica (40% do VCT), com diferentes proporções de mistura de óleos vegetais e de banha. Mistura de isômeros de CLA, 0,1% da dieta, por 11 semanas.
Regressão significativa da metástase do tumor mamário; eficácia do CLA ↓
à medida que ↑ ácido linoleico. HUBBARD; LIM; ERICKSON, 2006. Obesidade
Ratos Wistar suplementados com 1%, 2% ou 4% do VCT com mistura de isômeros de CLA, por 28 dias. A suplementação nas concentrações de 2,0% e 4,0% promoveu redução de gordura corporal em 18,0%. BOTELHO et al., 2005. Obesidade
Ratos Wistar com dieta hiperlipídica e suplementados com 0,75, 1,5 e 3,0 g de CLA/100g de ração, por 12 semanas. Mistura de isômeros de CLA.
↓ ganho peso corporal e gordura branca; ↓ níveis plasmáticos de AG livres, triglicérides, colesterol total, leptina, insulina e glicose sanguínea; ↑ expressão do PPARγ RNAm; e ↑ os níveis de aP2, FATP, acil-CoA sintetase e adiponectina no t. adiposo. CLA pode melhorar a resistência à insulina.
ZHOU et al., 2008.
Antioxidante
Ratos Wistar suplementados com 2% da dieta de CLA e/ou 30mg/dia de DL-α-tocoferol-acetato, por 49 dias. Mistura de isômeros de CLA.
A influência do CLA na autooxidação lipídica foi dependente do tipo de suplemento, da dosagem e do tecido analisado. SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2007. Antioxidante
Ratos Wistar suplementados com 2% da dieta de CLA, por 49 dias. Mistura de isômeros de CLA.
CLA reduziu a oxidação lipídica; o conteúdo dos lípidios hepáticos totais não aumentou e a morfologia do órgão permaneceu íntegra.
SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009.
29 Tabela 1. Continuação
Atividade
biológica Condições Resultados Referência
Alteração no metabolismo e incorporação no cérebro
Camundongos fêmeas grávidas e filhotes. Mistura de isômeros de CLA, 3% da dieta. Fêmeas suplementadas por 1 semana antes de acasalar; filhotes por 8 semanas.
Os filhotes não apresentavam diferença de peso corpóreo, de peso do cérebro e de composição em ácidos graxos do cérebro; ↓ de prostaglandinas E2 nos filhotes do grupo CLA.
NAKANISHI et al., 2003.
Em 2007, por meio da Resolução nº 833, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) proibiu a fabricação, a comercialização e a importação do CLA isolado ou como ingrediente alimentar, até que requisitos legais que exigem a comprovação de sua segurança de uso, mecanismos de ação e eficácia sejam atendidos (BRASIL, 2007a). Essa medida foi tomada devido às incertezas referentes à ação do ácido linoleico conjugado no organismo humano, assim como pela recomendação realizada pela maioria das empresas, de consumo vinte vezes superior às quantidades normalmente ingeridas do composto (BRASIL, 2007b). Em 2009, a ANVISA interditou, por medida cautelar, alguns lotes de óleo de cártamo comercializados no país, por serem detectados nesses produtos quantidades superiores a 70% de ácido linoleico conjugado. O óleo de cártamo é um óleo vegetal com registro obrigatório, enquadrado na categoria de novos alimentos ou ingredientes, e que não possui CLA em sua composição. No entanto, esse óleo é uma matéria-prima utilizada para produção sintética de CLA devido à quantidade elevada de ácido linoleico (BRASIL, 2009). Atualmente, a venda indiscriminada de CLA, com o nome fantasia de óleo de cártamo ou de ácido linoleico, continua ocorrendo. Para ter acesso ao produto, basta acessar qualquer site de busca. A população leiga, devido às propagandas relacionadas à perda de peso e ganho de massa magra, utiliza-os sem qualquer orientação, ficando exposta a riscos. É válido ressaltar que propagandas que atribuam propriedades terapêuticas ao óleo de cártamo são proibidas (BRASIL, 2010).
Em 2012, a Codex Alimentarius Commission aceitou o pedido da Austrália para reavaliar a isenção do ácido linoleico conjugado, com base em estudos e descobertas
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recentes. A revisão deverá considerar os efeitos benéficos à saúde relacionados às doenças cardiovasculares, dislipidemias, mortalidade por todas as causas e diabetes, bem como os efeitos adversos (FAO; WHO, 2012).
A seguir, serão abordados alguns dos principais efeitos fisiológicos, tanto positivos como adversos, do ácido linoleico conjugado.
2.2.1 Efeito do CLA na composição corporal e no metabolismo de carboidratos e lipídios
O CLA, especialmente o isômero 10t,12c, apresenta grande capacidade de alterar a composição corporal e o metabolismo de carboidratos e lipídios in vivo. A modulação de hormônios relacionados ao controle do peso corporal e do gasto energético (YAMASAKI et al., 2003; PÉREZ-MATUTE et al., 2007), o aumento da lipólise e/ou a redução da lipogênese (SO; TSE; LI, 2009; CAI et al., 2012) e a regulação da homeostase energética e do metabolismo lipídico via PPARs (PURUSHOTHAM et al., 2007; PANADERO et al., 2008; LEE et al., 2009) podem ser citados como os principais mecanismos de ação envolvidos.
Vários estudos mostraram, in vitro e in vivo, que o CLA causa alteração na secreção de hormônios envolvidos na regulação do metabolismo energético e imunológico. Segundo Yamasaki et al. (2000), Rahman et al. (2001) e Park e Park (2012), o ácido linoleico conjugado inibe a expressão gênica e secreção da leptina. Conforme mencionado anteriormente, a leptina é um dos hormônios mais importantes na regulação da ingestão e do gasto energético, sendo seu adequado funcionamento fundamental para a manutenção do peso corporal. Além da leptina, a ingestão de CLA também exerce influência nos níveis secretados de adiponectina, mas ainda sem resultados conclusivos (AHN et al., 2006; SCHAEFFLER et al., 2009).
Em relação à concentração de tecido adiposo, o CLA parece agir reduzindo o acúmulo de gordura, por meio do aumento da lipólise e/ou redução da lipogênese. Entretanto, estudos realizados em seres humanos ainda não são conclusivos e as evidências
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sugerem que os diferentes isômeros do CLA possam apresentar efeitos variados na perda de peso e na composição corporal. Em animais, já foi demonstrado que o isômero 10t,12c é o que tem maior influência em modular ações relacionadas a mudanças na composição corporal. De acordo com Obsen et al. (2012), o isômero 10t,12c altera a atividade dos fatores de transcrição lipogênicas. Segundo os autores, isto pode ocorrer por meio da ativação de sinais inflamatórios como o fator nuclear-kappa B (NF-κB), que antagonizará ao receptor X hepático (LXR) α, ao PPARγ e possivelmente também à proteína ligadora do elemento regulado por esterois (SREBP) 1, acarretando a diminuição da atividade de enzimas essenciais para a lipogênese. É válido ressaltar que os efeitos deste isômero dependem da concentração de lipídios na dieta e são independentes da redução da ingestão energética (MOURÃO et al., 2005; SO; TSE; LI, 2009). Além da redução de tecido adiposo, o aumento de massa magra também é um dos efeitos que pode ser ocasionado pela suplementação de CLA (BOTELHO et al., 2005; SANTOS-ZAGO; BOTELHO, OLIVEIRA, 2008). A maior concentração muscular, por sua vez, aumenta o gasto energético basal, funcionando como um facilitador na perda de peso ou na manutenção do peso corporal. Recentemente, Park e Park (2012) observaram que camundongos suplementados com uma mistura de isômeros de CLA apresentaram aumento dos movimentos voluntários; é possível que a maior quantidade de atividade física resulte tanto no maio gasto energético quanto no aumento de massa magra.
A identificação dos PPARs foi determinante para o entendimento dos mecanismos moleculares responsáveis pelos efeitos do CLA, os quais parecem estar todos relacionados com a ativação ou a inibição das isoformas e, por conseguinte, com a modulação da expressão dos genes controlados pelas mesmas. O CLA é conhecimento como um ligante promíscuo dos PPARs, por se ligar a todas as isoformas facilmente (SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2008). Inúmeros trabalhos têm mostrado que o ácido linoleico conjugado é capaz de modular a expressão dos PPARs, principalmente das isoformas α (MOYA-CAMARENA et al., 1999; PETERS et al., 2001; PURUSHOTHAM et al., 2007) e γ (PÉREZ-MATUTE et al., 2007; ZHOU et al., 2008; LEE et al., 2009; MOON et al., 2009).
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Apesar dos efeitos benéficos do ácido linoleico conjugado mencionados, este composto também pode apresentar efeitos adversos, entre os quais a resistência à insulina (WANG; JONES, 2004; RISÉRUS et al., 2004; SIMÓN et al., 2006). A ação do CLA sobre o metabolismo lipídico, caracterizada pela inibição do armazenamento de ácidos graxos (os quais serão oxidados para fornecer energia) e associada à inibição da entrada de glicose nos adipócitos, pode levar à alteração no metabolismo da insulina e causar hiperinsulinemia. A inibição do armazenamento de ácidos graxos e glicose, especialmente pelo isômero 10t,12c, leva ao acúmulo desses substratos na corrente sanguínea, caracterizando um estado de lipodistrofia (particularmente pelo acúmulo de ácidos graxos não esterificados), que, por sua vez, está relacionado com a resistência à insulina local e geral, propiciando o desenvolvimento de diabetes lipoatrófica (SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2008). Outro mecanismo possivelmente envolvido na resistência à insulina oriunda da suplementação de CLA é a menor secreção dos já mencionados hormônios leptina e adiponectina, o que estimularia a secreção de insulina pelo pâncreas (PÉREZ-MATUTE et al., 2007).
Os resultados referentes à relação do consumo de CLA e a sensibilidade à insulina ainda são controversos, não havendo um consenso sobre a real atuação do ácido linoleico conjugado e sobre os mecanismos de ação pelos quais ele atua. Parra; Serra e Palou (2010), por exemplo, mostraram que uma mistura de isômeros de CLA não aumentou a resistência à insulina, quando suplementado oralmente em ratos. Choi et al. (2004) e Zhou et al. (2008) observaram que ratos obesos suplementados com CLA apresentaram menor resistência à insulina quando comparados ao grupo controle, possivelmente pela ativação e maior expressão do PPARγ. Já Halade; Rahman e Fernandes (2010) observaram, em camundongos C57B1/6J, um efeito antagônico dos diferentes isômeros de CLA: enquanto o
10t,12c aumentou a resistência à insulina, o 9c,11t reduziu. Recentemente, Mohankumar et
al. (2012) investigaram a ação do CLA na captação de glicose pelo músculo; os autores observaram que os isômeros mimetizam a ação da insulina estimulando a captação de glicose via translocação da GLUT-4, e exercendo possível atividade antidiabetogênica.
Entende-se que a melhor solução para reduzir a incidência de obesidade e de doenças associadas seja a prevenção. Além disso, são necessários mais estudos objetivando
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investigar a suplementação de CLA na redução da gordura corporal, visto ser esta propriedade fisiológica bastante desejada pela população que busca uma vida mais saudável (SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2008).
2.2.2 Efeito do CLA no cérebro
Estudos que relacionam a ingestão de CLA com sua incorporação no cérebro iniciaram neste milênio e são em número bastante reduzido. Até o momento, sabe-se que o ácido linoleico conjugado é incorporado ao tecido cerebral, mas em pequenas concentrações. Alasnier et al. (2002) investigaram a ação dos isômeros 9c,11t, 9t,11t,
10c,12t e 10t,12t em diferentes tecidos de ratos Wistar suplementados com 150 mg/dia de
CLA, durante 6 dias. O peso e a concentração de lipídios totais no cérebro foram semelhantes entre os grupos, os valores de CLA foram inferiores a 0,04% e apenas os isômeros 9c,11t e 9t,11t foram detectados. Especula-se que alguns fatores possam causar baixa concentração de CLA no tecido nervoso: a pobre incorporação em fosfolipídios, a baixa ingestão, a incorporação seletiva de outros ácidos graxos, a seleção incomum de ácidos graxos na configuração trans e o curto período do experimento (FA et al., 2005).
Após três anos da publicação de Alasnier e colaboradores, Fa et al. (2005) investigaram a ação dos dois isômeros mais comuns de CLA (9c,11t e 10t,12c) no cérebro de ratas Sprague-Dawley e em culturas de astrócitos cerebelares. Os autores observaram que o cérebro das ratas incorporou os dois isômeros ativamente, em concentrações semelhantes. Também verificaram que o isômero 10t,12c foi metabolizado por beta-oxidação de forma mais eficiente no cérebro do que nos outros tecidos, além de ter sido considerado melhor substrato do que o isômero 9c,11t. A incorporação do CLA e o consequente aumento da beta-oxidação peroxissomal reduziu a produção de eicosanoides inflamatórios provenientes do ácido araquidônico. Os resultados in vitro ratificaram os dados encontrados no experimento in vivo. Outro dado relevante apontado pelos pesquisadores é de que os PPARs, por estarem presentes em diferentes áreas do cérebro, podem ser ativados pelo CLA, ocasionando a melhora do quadro inflamatório comum em desordens como a adenoleucodistrofia e a doença de Parkinson. Joo e Park (2003) já
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haviam demonstrado anteriormente que uma mistura de isômeros 9c,11t e 10t,12c é capaz de desempenhar efeito neuroprotetor em células de ratos tratadas com glutamato, substância com conhecido efeito neurotóxico. Os autores atribuíram o efeito neuroprotetor do CLA tanto à alteração da membrana fosfolipídica das células como à possível ação antioxidante dos isômeros.
A incorporação do ácido linoleico conjugado detectada nos estudos com ratos não parece ocorrer da mesma forma em todas as espécies animais. Cordain et al. (2002), por exemplo, determinaram a concentração de ácidos graxos em diferentes tecidos (músculo, cérebro, medula e tecido adiposo subcutâneo) em ruminantes. Isômeros de CLA foram encontrados na medula, no tecido adiposo subcutâneo e no músculo, mas não foram detectados no cérebro dos animais.
Mais recentemente, Cao et al. (2007) investigaram a relação da presença de CLA no cérebro com o controle da ingestão energética, visto ser a regulação do metabolismo e da ingestão alimentar parcialmente realizado a nível hipotalâmico. Ratos Sprague-Dawley, durante 14 dias, receberam 150 nmol de ácido linoleico conjugado ou de ácido linoleico por via intra-cérebro-ventricular. Os resultados mostraram que o CLA pode inibir a ingestão alimentar, sendo esta inibição relacionada ao decréscimo da expressão dos neuropeptídios Y (NPY) e das proteínas relacionadas ao gene agouti (AgRP) no hipotálamo. O nível de leptina circulante foi aumentado, provavelmente como uma reação fisiológica à redução da ingestão alimentar e tentativa de manutenção do peso corporal. O metabolismo da glicose, entretanto, não foi alterado pela injeção ventricular de CLA. Com o mesmo objetivo, So; Tse e Li (2009) suplementaram com CLA camundongos alimentados com dietas normolipídicas (5%) e hiperlipídicas (30%), observando alterações no apetite relacionadas a modificações na expressão dos NPY, proteína quinase ativada por AMP (AMPKα2) e pro-opiomelanocortina (POMC) hipotalâmicos.
Apesar dos estudos com CLA e sua ação no hipotálamo serem iniciais, é evidente que o acúmulo desse ácido graxo no tecido cerebral e as possíveis alterações causadas por ele na regulação do apetite a nível hipotalâmico podem ajudar a esclarecer os mecanismos de ação do ácido linoleico conjugado na alteração da composição corporal. Se a ingestão
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energética é alterada pelo CLA, é importante determinar o envolvimento dos mecanismos cerebrais que afetam o apetite e a alteração da composição corporal (SO; TSE; LI, 2009).
2.2.3 CLA na oxidação lipídica
Antioxidantes são substâncias usadas, em alimentos, como aditivos para retardar as reações de autoxidação. O envolvimento das reações de peroxidação lipídica no desenvolvimento de doenças cardiovasculares faz com que, atualmente, a preocupação não esteja somente em aumentar a vida de prateleira dos produtos alimentícios, mas também esteja em melhorar a qualidade de vida dos consumidores (COULTATE, 2002; FRANKEL, 2005).
O mecanismo de autoxidação do ácido linoleico conjugado ainda é controverso. A presença de duplas ligações na configuração trans em isômeros do CLA contribui para a estabilidade do mesmo à oxidação, se comparado ao ácido linoleico. Porém, ao levar em consideração o fato de que a conjugação das duplas ligações é um dos primeiros passos da autoxidação lipídica, e que a partir daí se iniciam as reações em cadeia do processo oxidativo, o CLA poderia atuar como pró-oxidante. A partir de 2000, os pesquisadores começaram a afirmar que o CLA aumenta o estresse oxidativo em sistemas biológicos, atuando como pró-oxidante particularmente no organismo humano (COULTATE, 2002; FRANKEL, 2005; SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009). Tholstrup et al. (2008) observaram aumento nos marcadores de oxidação lipídica e inflamação em mulheres saudáveis pós-menopausa suplementadas com CLA.
A suplementação com CLA também influencia o processo de oxidação lipídica em roedores, sendo a atividade pró ou antioxidante dependente do tipo e da dose do suplemento, assim como do indicador analisado (AKAHOSHI et al., 2003, SANTOS-ZAGO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2008). Javadi et al. (2004) concluíram, após suplementar camundongos durante 12 semanas, que o ácido linoleico conjugado aumenta a oxidação lipídica no fígado, como consequência da maior lipólise. Macarulla et al. (2005) observaram que somente o isômero 10t,12c aumentou a oxidação lipídica no fígado, em
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Oliveira (2009) analisaram a oxidação lipídica em ratos, sendo que os indicadores malondialdeído sérico e atividade sérica da catalase mostraram que o CLA pode atuar como um agente antioxidante, enquanto os valores do eicosanoide da série F 8-iso-PGF2αisoprostana e de peróxidos hepáticos mostraram uma potencial atividade
pró-oxidante.
Diante das divergências encontradas em relação ao efeito do CLA na oxidação lipídica in vivo, é indispensável que se estude exaustivamente a atuação do ácido linoleico conjugado nos processos oxidativos, a fim de evitar riscos à saúde da população.
2.3 FITOSTEROIS
Os esterois são compostos que têm como estrutura básica o núcleo de ciclopentanoper-hidrofenantreno, nos quais o hidrogênio na posição 3 é substituído por um grupo hidroxílico, os hidrogênios nas posições 10 e 13 por grupos metílicos, e o da posição 17 por um radical R (Figura 3). Eles constituem, em grande parte dos óleos e das gorduras, o componente principal da fração insaponificável. Em geral, são substâncias cristalinas, podendo ser encontradas no estado livre ou esterificadas a ácidos graxos de alto peso molecular. São classificados, de acordo com sua origem, em zoosterois (origem animal), fitosterois (origem vegetal) ou micosterois (oriundos de microrganismos) (TOIVO et al., 2001; KRITCHEVSKY; CHEN, 2005).
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Os fitosterois, ou esterois de plantas, são um grupo formado por mais de 40 compostos, que desempenham funções estruturais análogas ao colesterol em tecidos animais. Entre os mais comuns, encontram-se fitostanois, estanois, sitosterol, β-sitostanol, campesterol, campestanol, estigmasterol e brassicasterol. Entre as fontes alimentares de fitosterois, destacam-se a soja, as oleaginosas e os óleos vegetais. Alguns alimentos fonte de fitosterois que se sobressaem pela quantidade de esterois totais são o óleo de milho (entre 500 e 1.600 mg.100-1), o óleo de girassol (entre 370 e 730 mg.100-1), o óleo de soja (entre 230 e 460 mg.100-1), a semente de girassol (cerca de 300 mg.100-1) e as nozes (aproximadamente 130 mg.100-1) (PIIRONEM et al., 2000; COULTATE, 2002; MARANGONI; POLI, 2010). É válido ressaltar que os processos de extração e de refino dos óleos vegetais podem alterar a concentração de fitosterois no produto final. A moagem ou aquecimento das sementes, por exemplo, podem melhorar a recuperação de fitosterois. A degomagem, processo usado para remover sais, metais, fostatídios e produtos mucilaginosos, por sua vez, diminui as quantidades de fitosterois e tocoferóis em diferentes tipos de óleo vegetal. A neutralização e a clarificação, processos finais do refino, também contribuem significativamente para a redução de esterois (COULTATE, 2002; HIDALGO; ZAMORA, 2006).
Mensura-se consumo, entre os povos ocidentais, de 100 a 300 mg/dia de fitosterois. Os indivíduos vegetarianos são os que ingerem diariamente maiores quantidades, mesmo assim com valores inferiores a 1g/dia (MARTINS et al., 2004, SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007; SANCLEMENTE et al., 2012).
Embora o β-sitosterol tenha sido usado para reduzir os níveis de colesterol sérico em pacientes hipercolesterolêmicos há muitos anos, é recente a possibilidade de aplicá-lo como uma substância bioativa em alimentos. Descobriu-se que uni-lo a um ácido graxo de cadeia longa aumenta a solubilidade do composto em óleos e gorduras, sendo eficiente em doses muito baixas. No leste europeu, o consumo de manteiga, margarina e de produtos ricos em lipídios é superior a 20 g/dia. Diante deste alto consumo, tem-se suplementado margarinas e produtos similares com até 20% de fitosterois na forma éster. Nos Estados Unidos, o FDA permite a adição de fitosterois nessa concentração (COULTATE, 2002).
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Quando avaliada a toxicidade da suplementação de fitosterois, observou-se que uma dose diária de 8,1% de ésteres de fitosterol (equivalente a 5% de fitosterois) na dieta de ratos, durante 90 dias, não foi suficiente para causar efeitos indesejáveis (HEPBURN; HORNER; SMITH, 1999). Os fitosterois ingeridos são absorvidos em quantidades pequenas no trato gastrointestinal das diferentes espécies animais: 0% em coelhos, 4% em ratos e cerca de 6% em humanos (KRITCHEVSKY; CHEN, 2005). Além disso, são rapidamente excretados via bile (COULTATE, 2002), o que praticamente impossibilita a intoxicação por doses elevadas. Dessa forma, como os fitosterois não podem ser sintetizados endogenamente por animais e humanos, seus níveis circulantes são baixos e dependem da dieta e da eficiência de absorção.
2.3.1 Efeito hipocolesterolêmico
Desde a década de 1950 têm-se atribuído aos fitosterois a capacidade de atuarem como hipocolesterolêmicos, sendo este seu efeito biológico mais conhecido e estudado. Após a ingestão, eles competem com o colesterol para serem absorvidos na luz intestinal; esta competição torna a absorção de colesterol ineficiente, diminuindo consequentemente, seus níveis circulantes e o risco de doenças cardiovasculares (POLLAK, 1953; KATAN et al., 2003; RACETTE et al., 2010).
A diferença nas taxas de absorção entre os esterois varia de acordo com o tamanho da cadeia carbônica e com o grau de saturação, sendo que as maiores cadeias e mais saturadas são menos absorvidas, devido à característica hidrofóbica destes compostos (MARTINS et al., 2004).
A absorção dos esterois no intestino é um processo rápido. Como grande parte dos fitosterois naturalmente presente nos alimentos estão esterificados, estes necessitam inicialmente ser clivados em esterois livres e ácidos graxos. Para que os fitosterois se tornem solúveis e possam ser absorvidos, também precisam ser incorporados a micelas com membrana fosfolipídica; caso contrário, seriam eliminados totalmente nas fezes. As micelas, então, se aproximam da borda em escova das microvilosidades e, em contato com a membrana, transferem seu conteúdo para o interior da célula. Os mecanismos moleculares
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implicados na absorção dos esterois ainda são pouco conhecidos, mas já foi esclarecido que a proteína Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1) apresenta papel chave no transporte de esterois ao enterócito. Após a absorção, os fitosterois são reesterificados na célula intestinal e transportados ao fígado (ALTMANN et al., 2004; VALENZUELA; RONCO, 2004).
Posteriormente, os fitosterois se ligam a receptores hormonais nucleares, como os LXRs, os quais modulam a transcrição de genes envolvidos no metabolismo do colesterol. Um destes genes codifica uma molécula – adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) – a qual realiza o transporte reverso do colesterol (dos enterócitos de volta ao lúmen intestinal), limitando assim a absorção do mesmo (CHEN, 2001). De acordo com a hipótese de Plat e Mensink (2002), os fitosterois aumentam a expressão do transportador ABCA1, ativando a expressão das proteínas ABC. No fígado, os fitosterois, assim como o colesterol, podem ser transportados para os tecidos periféricos pelas lipoproteínas VLDL-c e LDL-c, podem ser convertidos em sais biliares ou apenas transportados para a vesícula biliar para serem excretados. Nos tecidos periféricos, o transportador ABCA1 também pode participar desse processo, entregando o colesterol para que o HDL-c transporte-o de volta ao fígado (ALLAYEE; LAFFITTE; LUSIS, 2000).
De acordo com o trabalho de Hernández-Mijares et al. (2011), a absorção de esterois em indivíduos saudáveis e com síndrome metabólica é distinta. Os indivíduos saudáveis absorvem maiores quantidades de colesterol proveniente da dieta e, consequentemente, maiores quantidades de fitosterois. Em contrapartida, sujeitos com síndrome metabólica apresentam uma menor capacidade absortiva de ambos. Além disso, a produção de colesterol é aumentada em pacientes com resistência à insulina, fator que se sobrepõe a não resolução da dislipidemia por meio dos fitosterois. O fluxo maior de colesterol produzido no fígado poderia regular negativamente os receptores de LDL-c e torná-los refratários à regulação adicional pelos ácidos graxos da dieta; ao mesmo tempo, o fluxo de colesterol pelos enterócitos seria reduzido. Em outras palavras, a suplementação com fitosterois é benéfica especialmente para pessoas com alta absorção intestinal de colesterol e baixa síntese de colesterol endógeno.
