Diagnóstico molecular de doenças genéticas. Prof. Dr. Michel Naslavsky

Diagnóstico molecular de doenças genéticas

Nota

• Pacientes desidentificados e consentiram uso da imagem para fins acadêmicos; • Não reproduzir o conteúdo destes slides sem autorização expressa;

• Agradecimento ao Laboratório de Diagnóstico Molecular do CEGH-CEL USP e à equipe;

• Agradecimento especial ao Dr. Guilherme Yamamoto e Dra. Débora Bertola pelo compartilhamento dos casos e slides.

Clínica é preponderante

Reunir o máximo de informações clínicas e histórico familiar do paciente:

Decisão sobre o fluxo dos testes de auxílio diagnóstico;

Acondroplasia

• Processo mais comum resultante em baixa estatura

desproporcional (nanismo);

• FGFR3 – AD – de novo (80%)

Hipocondroplasia

• Forma menos severa de acondroplasia: diferenças sutis em

morfologia das vértebras lombares (imagem);

• FGFR3 – AD – de novo (<80%)

Hipocondroplasia

Busca por mutações: ponto específica (DUT 110.1.2)

Clínica  Indicação do teste

?

Probando: Sanger vs. Painel

Mutação conhecida: Sanger

Outras displasias? Síndrome de Muenke  FGFR3

c.749C>G (p.Pro250Arg)

Caso Hipocondroplasia

Busca de vários genes

Caso Ehlers-Danlos

Caso Ehlers-Danlos

Caso Ehlers-Danlos

• WGS na clínica?

• Limitações técnicas?

• Limitações do conhecimento sobre a doença?

• Clínica  Combinação de variantes?

Caso 0



4 anos



Coloboma de retina, cardiopatia congênita, lesão

ictiosiforme em pele, retardo mental, convulsão,

orelhas displásicas.

Caso 1



11 anos

Cariótipo e array CGH do caso 0

 Negativos

Painel de displasias esqueléticas do caso 1

Técnicas vs. custos

Sequenciamento

+/-Painel Focado (2 – 500 genes) Painel Ampliado/ Exoma Focado (6700 genes) Seq Exoma Completo (WES) (20000 genes) Seq Genoma Completo (WGS) Custo (Reais) 1390 3490 5490 >8000 Número de genes - - + + + + + + + + “Excesso de variantes” + - - - -Questões éticas - - - -CNV + + + + + + + +

Patogenicidade de Mutações

Ferramentas para interpretação de mutações e seus

possíveis efeitos fenotípicos

Mutações conhecidas (danosas?)



OMIM (sempre desatualizado)

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/  http://www.omim.org 

HGMD (dados públicos < 75%)

Cosmic (câncer)

Decipher (CNV)

Mutações conhecidas (benignas?)



dbSNP



Cuidado deveria chamar dbSNV, existem variantes

<1% de frequência e/ou patogênicas



1000 genomes / personal genomes



Certeza que os indivíduos não eram doentes? Ou

portadores?



6500 exomes (Washington University)



65000 exomas (Broad-Harvard exac)

http://abraom.ib.usp.br

ABraOM

Arquivo Brasileiro Online de Mutações Online Archive of Brazilian Mutations

2,4 milhões de variantes

>200 mil são nunca antes vistas

Conservação

 Em geral quanto mais conservado nas espécies é o nucleotídeo

ou AA em questão, maior o risco de causar fenótipo

 GERP (Genomic Evolutionary Rate Profiling):

 http://mendel.stanford.edu/sidowlab/downloads/gerp/index.html

 PhyloP (PHAST)

Predição de dano à proteína



Predições calculadas por computação são

chamadas in silico

 LRT (likelihood ratio test) – Usa conservação para prever

mutação deletéria

Introdução – Aplicação clínica Guidelines

Pathogenic

1 Very Strong (PVS1) AND≥1 Strong (PS1–PS4) OR ≥2 Moderate (PM1–PM6) OR

1 Moderate (PM1–PM6) and 1 Supporting (PP1–PP5) OR ≥2 Supporting (PP1–PP5)

≥2 Strong (PS1–PS4) OR

1 Strong (PS1–PS4) AND≥3 Moderate (PM1–PM6) OR 2 Moderate (PM1–PM6) AND ≥2 Supporting (PP1–PP5) OR 1 Moderate (PM1–PM6) AND ≥4 Supporting (PP1–PP5) Likely Pathogenic

1 Very Strong (PVS1) AND 1 Moderate (PM1–PM6) OR 1 Strong (PS1–PS4) AND 1–2 Moderate (PM1–PM6) OR 1 Strong (PS1–PS4) AND ≥2 Supporting (PP1–PP5) OR ≥3 Moderate (PM1–PM6) OR

2 Moderate (PM1–PM6) AND ≥2 Supporting (PP1–PP5) OR 1 Moderate (PM1–PM6) AND ≥4 Supporting (PP1–PP5) Benign

1 Stand-Alone (BA1) OR ≥2 Strong (BS1–BS4) Likely Benign

1 Strong (BS1–BS4) and 1 Supporting (BP1–BP7) OR ≥2 Supporting (BP1–BP7)

Variant of Unknown/Uncertain Significance None of the above

ACMG variant classification 2015

Browsers



Em geral possuem quase tudo o que você

precisa e mais um pouco (além de uma maneira

de visualizar arquivos próprios)



UCSC Genome Browser

 http://genome.ucsc.edu



Ensembl

 http://www.ensembl.org/index.html



IGV

Voltando ao caso 0



4 anos



Coloboma de retina, cardiopatia congênita, lesão

ictiosiforme em pele, retardo mental, convulsão,

orelhas displásicas.

Voltando ao caso 0

1 SNV patogênica em PIGL +



4 anos



Coloboma de retina, cardiopatia congênita, lesão

ictiosiforme em pele, retardo mental, convulsão,

orelhas displásicas.



CHIME

 #MIM 280000

Voltando ao caso 0

(ou: outros CNV hard

core); 1 SNV patogênica em PIGL +

Voltando ao caso 1



F8123, 11 anos

Voltando ao caso 1

Voltando ao caso 1



Displasia espôndilometafisária com distrofia de cones e

bastonetes



Exoma completo em 4 pacientes

Family 1 Family 2

Number of variants in both individuals 20160 Number of variants in both individuals 17341 Number of homozygous variants 6873 Number of homozygous variants 5243 Rare (<0.01 allele freq. external controls) 307 Rare (<0.01 allele freq. external controls) 326 <0.05 allele freq. internal controls 18 <0.05 allele freq. internal controls 17

Gene Variant Mutation type dbSNP137 Gene Variant Mutation type dbSNP137

APOD NM_001647:c.383A>G:p.Y128C missense rs150664052 PNRC2 NM_017761:c.237A>C:p.S79S sense rs10493018

PCYT1A NM_005017:c.996C>G:p.P332P sense rs61737911 ATP13A5 NM_198505:c.1831G>A:p.A611T missense rs143477252

PCYT1A NM_005017:c.385G>A:p.E129K missense . ATP13A4 NM_032279:c.2895G>T:p.R965R sense rs150429290

FAM170A NM_001163991:c.665G>T:p.G222V missense rs200846075 MUC4 NM_018406:c.10220T>C:p.M3407T missense .

USP17L8 NM_001256872:c.534C>T:p.P178P sense . MUC4 NM_018406:c.8733G>C:p.T2911T sense rs28385894

USP17L8 NM_001256872:c.146T>A:p.V49D missense rs201927052 MUC4 NM_018406:c.8405C>T:p.P2802L missense .

IL33 NM_001199641:c.273C>T:p.F91F sense . MUC4 NM_018406:c.7320G>A:p.S2440S sense rs71321826

CCDC73 NM_001008391:c.3050T>A:p.I1017K missense rs199847743 MUC4 NM_018406:c.7313T>C:p.V2438A missense .

DACT1 NM_001079520:c.1193T>C:p.L398P missense rs114859205 MUC4 NM_018406:c.7312G>A:p.V2438I missense .

SYNE2 NM_015180:c.15021C>T:p.A5007A sense rs148113884 MUC4 NM_018406:c.7295G>C:p.R2432P missense .

PPP1R36 NM_172365:c.1016T>C:p.V339A missense rs149477152 MUC4 NM_018406:c.7275T>A:p.A2425A sense .

PPP1R36 NM_172365:c.1166T>C:p.F389S missense rs149234804 MUC4 NM_018406:c.6111T>C:p.D2037D sense rs199853476

PLEKHG3 NM_015549:c.461G>A:p.R154Q missense rs149822835 MUC4 NM_018406:c.6096G>T:p.P2032P sense .

PLEK2 NM_016445:c.588G>T:p.V196V sense . MUC4 NM_018406:c.6081T>A:p.T2027T sense .

ARG2 NM_001172:c.1051C>T:p.R351C missense rs112748595 PCYT1A NM_005017:c.968dupG:p.S323Rfs*38 frameshift insertion .

ZFYVE26 NM_015346:c.5799C>T:p.S1933S sense rs145858625 RNF168 NM_152617:c.1481C>T:p.P494L missense rs35132476

Limitações atuais

• Alterações Equilibradas

• Translocações • Inversões

• Dissomia uniparental (ex: Silver Russell)

• Metilação (ex: Prader-Willi)

• Mutações de expansão (ex: CGG X-frágil)

• Haplótipo (cis x trans)

Implicações

• Domínio da informação

– Ética, leis, familiares, médicos, seguro saúde • Busca por saúde

– Todos somos doentes, basta procurar de perto

• Extrapolação célula-tecido-organismo-população-etnia-espécie – Risco cardio vascular x Filipinos

• Capacidade de entendimento do pesquisador+médico+paciente de somatória de riscos, variantes de significado incerto (VUS) e erros possíveis no processo

• Há um algoritmo para escolher um teste?

• Quando chegamos a um pedido de exoma?

Doenças genéticas monogênicas (padrão “mendeliano” de herança)

• Cromossômicas microscópicas

• Cromossômicas submicroscópicas que você acha que sabe o

locus que está mutado

• Cromossômicas submicroscópicas que você sabe que não sabe

o locus que está mutado

• Em um único gene nuclear que você acha que sabe qual é

• Em um entre vários genes nucleares que você acha que sabe qual

é o conjunto de genes

• Em um entre 22 mil genes nucleares que você não tem nem ideia

qual deles pode estar mutado • Em um gene fora do núcleo • Completamente inesperadas

Wright CF, FitzPatrick DR, Firth HV. Paediatric genomics: diagnosing rare disease in children. Nature Reviews Genetics 2018; 19: 253.

Uma questão de escala

Wright CF, FitzPatrick DR, Firth HV. Paediatric genomics: diagnosing rare disease in children. Nature Reviews Genetics 2018; 19: 253.

Conclusões

•Uma técnica revolucionária que talvez será suficiente para identificar

mutações (variantes) tanto de ponto como estruturais

•Antecedente familiar daqui em diante não vai bastar para investigação de hereditariedade

•A medicina vai ficar personalizada em torno das variantes de cada

paciente (e são os profissionais de saúde quem terão que saber interpretar estas variantes...)

•Genética na medicina não é mais apenas uma matéria básica

•Genética na medicina não é mais apenas o estudo de doenças raras que poucos entrarão em contato