R E S U M O O imidapril é um inibidor da enzima de conversão da angiotensina I, uma classe de fármacos com reconhecidas propriedades cardioprotectoras. Sabe-se hoje que isso se deve não só à sua actividade anti--hipertensora, mas também ao facto de reduzir os níveis tecidulares e circulantes da angiotensina II, um potente vasoconstritor e indutor de fibrose miocárdica. Estes mecanismos poderão explicar os bons resultados clínicos desta classe de fármacos na terapêutica da doença coronária e insuficiência cardíaca, duas patologias cuja etiopatogenia está profundamente ligada à activação do sistema renina-angiotensina--aldosterona. Porém, o impacto desta classe de fármacos na função mitocondrial cardíaca durante a isquémia miocárdica aguda está ainda largamente por esclarecer. Com o objectivo de estudar o efeito do imidapril na função mitocondrial de corações isquémicos utilizou-se um modelo animal de perfusão ex-vivo com um sistema de Langendorff, seguido de isquemia na presença ou ausência de imidapril. Avaliou--se o potencial eléctrico da membrana mitocondrial, o consumo de oxigénio (O2) pela
cadeia respiratória e a taxa e amplitude de intumescimento mitocondrial. Verificou-se que o imidapril não modificou de
forma significativa o consumo de O2pelas
mitocôndrias cardíacas, avaliado pela velocidade do estado respiratório 3 (o estado correspondente à fase de fosforilação activa). Porém, este fármaco elevou, de forma
Impacto do Imidapril na Função Mitocondrial
Cardíaca num Modelo Animal Ex Vivo
de Isquémia Miocárdica Global
[4]
PEDROMONTEIRO,SÓNIAGALA,SUSANANOBRE,RAQUELCARREIRA, LINOM. GONÇALVES,LUÍSA. PROVIDÊNCIA
Unidade de Investigação Básica em Cardiologia – Serviço de Cardiologia, Hospitais da Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal Clínica de Cardiologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal
53
S U M M A R Y
Impact of imidapril on cardiac mitochondrial function in an ex-vivo animal model of global myocardial ischemia
Imidapril is an angiotensin I converting enzyme inhibitor, a class of drugs with known cardioprotective activity. It is now known that this is due not only to their antihypertensive activity, but also to the fact that they decrease cellular and tissue levels of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and inducer of myocardial fibrosis. These mechanisms may explain the good clinical results of this class of drugs in the treatment of coronary artery disease and heart failure, two diseases whose etiopathogenesis is closely related to the activation of the
renin-angiotensin-aldosterone system. However, the impact of this class of drugs on cardiac mitochondrial function during acute myocardial ischemia is still largely unknown.
With the aim of studying the effect of imidapril on cardiac mitochondrial function during acute ischemia, we used an ex-vivo animal model, perfused in a Langerdorff system and then subjected to ischemia in the presence or absence of imidapril. We
evaluated mitochondrial membrane electrical potential, respiratory chain O2consumption,
and rate and amplitude of mitochondrial swelling.
We conclude that imidapril did not
significantly change oxygen consumption by cardiac mitochondria, as assessed by the rate Recebido para publicação: Agosto de 2004 • Aceite para publicação: Setembro de 2004
Received for publication: August 2004 • Accepted for publication: September 2004
INTRODUÇÃO
A
isquemia miocárdica tem consequências nefastas ao nível da funcionalidade e estru-tura das mitocôndrias cardíacas, supondo-se que a principal causa destes efeitos deletérios seja a indução da transição de permeabilidade mitocondrial(1). Pensa-se que este fenómenoseja provocado por stress oxidativo que ocorre no interior da mitocôndria como resultado de uma sobrecarga de cálcio. De facto, para além da sua bem conhecida função de produção de energia na forma de ATP, as mitocôndrias cardía-cas desempenham uma segunda tarefa menos conhecida, mas igualmente fundamental: regu-lam os níveis de cálcio intracelular, tentando evitar a sua acumulação excessiva no citosol em situações de stress celular, de que a isquemia é talvez o melhor exemplo.
Sob o ponto de vista clínico, é extremamente importante a identificação de fármacos capazes de prevenir ou reverter as alterações mitocon-driais durante a isquemia miocárdica, pois tal permitirá preservar melhor a função cardíaca em portadores de cardiopatia isquémica.
Os inibidores da enzima de conversão da an-giotensina (iECA), dado o seu papel modulador
54
INTRODUCTION
M
yocardial ischemia has deleterious conse-quences for mitochondrial function and structure and it is thought that these effects are mainly caused by induction of the mitochon-drial permeability transition(1). Thisphenome-non is triggered by oxidative stress that occurs within mitochondria as a result of calcium over-load. Besides their well-known role in produ-cing energy in the form of ATP, cardiac mito-chondria perform a second, less well known but equally essential task, that of regulating intra-cellular calcium levels in order to prevent ex-cessive accumulation in the cytosol in situa-tions of cellular stress, of which ischemia is perhaps the best example.
From a clinical point of view, it is extremely important to identify drugs that are able to pre-vent or reverse mitochondrial alterations caused by myocardial ischemia, as this will help pre-serve cardiac function in patients with ischemic heart disease.
Due to their role in modulating the renin-angiotensin-aldosterone system, angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEIs) have been shown in various clinical trials to play an
Palavras-Chave
Isquemia; Imidapril; Mitocôndria
Key words
Ischemia; Imidapril; Mitochondria
significativa, o potencial eléctrico transmembranar e preveniu, em mitocôndrias cardíacas isquémicas, o aumento, induzido pelo cálcio, da taxa e amplitude de intumescimento mitocondrial, o que permitiu assegurar uma maior integridade das estruturas membranares mitocondriais, com manutenção do potencial eléctrico após o ciclo fosforilativo. Estes achados permitem compreender melhor os mecanismos inerentes aos efeitos citoprotectores do imidapril em portadores de cardiopatia isquémica, demonstrando claramente, ao nível da biologia celular, a importância da modulação farmacológica da função mitocondrial cardíaca durante a isquemia aguda.
of respiratory state 3 (the state that corresponds to the active phosphorylation phase). However, imidapril significantly increased transmembrane electrical potential and, in ischemic cardiac mitochondria, was able to prevent the calcium-induced increase in the rate and amplitude of mitochondrial swelling, thus enabling better preservation of mitochondrial membrane structure, with consequent improvement of electrical potential after the phosphorylation cycle. These findings enabled a better
understanding of the mechanisms behind the cytoprotection provided by imidapril during ischemic cardiomyopathy, clearly
highlighting, at a cellular biology level, the importance of pharmacological modulation of cardiac mitochondrial function during acute ischemia.
do sistema renina-angiotensina-aldosterona, são uma classe farmacológica que demonstrou em diversos ensaios clínicos ter um papel funda-mental na terapêutica da insuficiência cardíaca e doença coronária, duas das cardiopatias onde ocorre maior compromisso da função mitocon-drial cardíaca.
Estudos prévios, realizados em modelos ani-mais de isquemia aguda e cardiopatias cróni-cas, como a hipertensão e insuficiência car-díaca, demonstraram já um impacto positivo de alguns iECA na produção de ATP2 e no
con-sumo eficiente de O2.(2, 3). Porém, pouco se sabe
sobre o impacto dos iECA na homeostase do cálcio no contexto de isquémia aguda prolon-gada.
Foi, pois, nosso objectivo, estudar melhor os mecanismos de acção de um iECA, o imidapril, ao nível da função mitocondrial cardíaca, desig-nadamente na sua capacidade de regularizar os níveis de cálcio intracelular, tendo sido utili-zado um modelo animal ex-vivo de isquemia miocárdica global, precedida de perfusão num sistema de Langendorff.
MATERIAL E MÉTODOS
Este protocolo experimental foi desenvol-vido de acordo com o Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals, publicado pelos US National Institutes of Health (NIH publication No. 85-23, revised 1996).
Grupos experimentais
Trinta ratos Wistar do sexo masculino foram distribuídos por três grupos: Controlo (n = 10) – não submetido a isquemia; Isquémico (n = 10) – submetido a perfusão e isquemia, na ausência de imidapril; Imidapril (n = 6) – submetido a perfusão e isquemia, ambas na presença de imidapril 4 µM.
Montagem do sistema de perfusão ex-vivo
Os ratos Wistar foram mortos por inalação de CO2. O coração foi rapidamente extraído da
cavidade torácica e foi suspenso pela porção superior da aorta torácica ascendente na extre-midade do sistema de perfusão do tipo Langen-dorff. Cada coração foi posteriormente perfun-dido com um meio de Krebs modificado (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2 mM,
NaHCO325 mM, MgSO41,2 mM, Na2EDTA 0,5
mM, Glicose 10 mM e CaCl2 3 mM), contendo 55
important part in the treatment of heart failure and coronary artery disease, two cardiopathies in which there is significant impairment of cardiac mitochondrial function.
Previous studies performed in animal mo-dels of acute ischemia and chronic cardiopathy, such as hypertension and heart failure, have demonstrated the positive effects of some ACEIs on ATP production(2) and efficient O2
consumption(2, 3). However, little is known of the
impact of ACEIs on calcium homeostasis in acute prolonged ischemia.
It was therefore our aim to study more thoroughly the mechanism by which an ACEI, imidapril, acts on cardiac mitochondrial func-tion, particularly its ability to regulate intracel-lular calcium levels, using an ex vivo animal model of global myocardial ischemia, following perfusion in a Langendorff system.
METHODS
The experimental protocol was developed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the US National Institutes of Health (NIH publication no. 85-23, revised 1996).
Experimental groups
Thirty male Wistar rats were divided into three groups: Control (n = 10) – not subjected to ischemia; Ischemic (n = 10) – subjected to per-fusion and ischemia, without imidapril; Imida-pril (n = 6) – subjected to perfusion and ische-mia, both in the presence of 4 µM imidapril.
Preparation of ex vivo perfusion system
The Wistar rats were killed by CO2
inhala-tion. The heart was rapidly removed from the chest cavity and connected by the upper section of the ascending aorta to a Langendorff-type perfusion system. Each heart was then perfused with a modified Krebs solution (NaCl 118 mM, KCl 4.7 mM, KH2PO41.2 mM, NaHCO325 mM,
MgSO41.2 mM, Na2EDTA 0.5 mM, glucose 10
mM and CaCl23 mM), containing O2in solution
and maintained at a temperature of 37 ºC, for 75 minutes in the control group and 15 minutes in the other groups. Imidapril (4 mM) was ad-ded to the solution in the experimental group. Except for the control group, all the hearts were subsequently subjected to 60 minutes of ische-mia at 37 ºC, in the same solution as that used in the perfusion stage but without glucose or O2.
O2em solução e mantido à temperatura de 37 ºC,
por um período variável (75 minutos para o grupo controlo e 15 minutos para os restantes grupos). A esta solução foi adicionado imidapril (4 µM), no respectivo grupo experimental. Com excepção do grupo controlo, todos os corações de rato foram submetidos de seguida a 60 mi-nutos de isquemia a 37 ºC numa solução idên-tica à do período de perfusão, mas sem glicose e O2.
Preparação de material biológico
Isolamento de mitocôndrias de coração de rato:
No final dos 75 minutos, a fracção mitocon-drial foi isolada a partir do coração de rato de acordo com o método descrito por Rickwood e colaboradores(4).
Métodos laboratoriais utilizados Determinação do potencial transmembranar mitocondrial
O potencial eléctrico transmembranar (³ ψ) foi avaliado através do registo permanente da distribuição do catião lipofílico tetrafenilfosfó-nio (TPP+) através da membrana mitocondrial(5).
Este registo, obtido graças à utilização de um eléctrodo selectivo para TPP+.
As reacções realizaram-se a 25 ºC, numa câ-mara de reacção aberta, termoestável, em 1 mL de meio de reacção (sacarose 130 mM, KCl 50 mM, KH2PO4 2 mM, Ácido (N-[2-hidroxietil]
piperazina – N’ – [2-etanosulfónico]) (HEPES) 5 mM, EDTA 50 µ, pH 7.2), suplementado por 3 µ de TPP+ e a suspensão mitocondrial. Os
cálculos do ³ ψ mitocondrial foram executados de acordo com a seguinte equação (a 25 ºC): ³ ψ (mV) = 59 log (v/V) – 59 log (10³ E/59 – 1),
onde v, V e ³ E representam, respectivamente, o volume mitocondrial, o volume do meio de in-cubação e a deflexão do potencial do eléctrodo desde a linha basal. Para o volume mitocondrial usou-se o valor de 1,1 µ l/mg de proteína.
Avaliação da actividade respiratória mitocondrial
Os ensaios decorreram à temperatura de 25 ºC, numa câmara de reacção fechada, termosta-tizada e com a capacidade de 1 mL. O consumo de O2 foi avaliado polarograficamente com um
eléctrodo de O2 (Yellow Springs Instruments,
Co.) de tipo Clark, ligado a um registador Kipp & Zonen(5).
56
Preparation of biological material Isolation of rat heart mitochondria
After 75 minutes, the mitochondrial fraction was isolated from the hearts following the meth-od described by Rickwometh-od et al.(4).
Laboratory methods
Determination of mitochondrial transmembrane potential
The transmembrane electrical potential (³ ψ) was determined by constantly recording the dis-tribution of the lipophilic cation tetraphenyl-phosphonium (TPP+) through the mitochondrial
membrane(5), using an electrode specific to TPP+.
The reactions were performed at 25 ºC, in an open thermostable reaction chamber, in 1 mL reaction medium (sucrose 130 mM, KCl 50 mM, KH2PO4 2 mM, (N-[2-hydroxyethyl]
pipe-razine-N’-[2-ethanesulfonic]) acid (HEPES) 5 mM, EDTA 50 µ M, pH 7.2), plus 3 µ M TPP+
and the mitochondrial suspension. Mitochon-drial ³ ψ was calculated using the following equation (at 25 ºC): ³ ψ (mV) = 59 log (v/V) - 59 log (10 ³ E/59 -1), where v, V and ³ E represent
respectively mitochondrial volume, incubation medium volume, and deflection of electrode po-tential from the baseline. A value of 1.1 µ l/mg of protein was used for mitochondrial volume.
Assessment of mitochondrial respiratory activity
The tests took place at a temperature of 25 ºC, in a closed thermostatically-controlled reac-tion chamber of 1 mL capacity. O2consumption
was determined polarographically using a Clarke-type O2 electrode (Yellow Springs
In-struments, Co.), connected to a Kipp & Zonen recorder(5).
The reaction process began with the addi-tion of the mitochondrial suspension to the reaction medium. Addition of the respiratory substrate (glutamate 10 mM + malate 5 mM, succinate 5 mM or ascorbate 5 mM + N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine [TMPD] 0.25 mM) induced an increase in O2consumption by
the mitochondrial fraction. Respiratory state 3 (characterized by greater and faster O2
con-sumption) was subsequently triggered by the addition of 250 nmol of ADP (62.5 nmol when ascorbate + TMPD was used). After all the ad-ded ADP had been consumed, the reaction rate decreased once more, corresponding to respira-tory state 4.
determi-As reacções iniciaram-se com a adição da suspensão mitocondrial ao meio de reacção atrás referido. A adição do substrato respirató-rio [glutamato 10 mM + malato 5 mM, succinato 5 mM ou ascorbato 5 mM + N,N,N’,N’-Tetrame-til-P-Fenilenodiamina (TMPD) 0,25 mM] indu-ziu um aumento do consumo de O2por parte da
fracção mitocondrial. O estado respiratório 3 (caracterizado por um maior e mais rápido con-sumo de O2) foi posteriormente despoletado
pela adição de 250 nmol de ADP (62,5 nmol se o substrato usado foi o Ascorbato/TMPD). Após o consumo de todo o ADP adicionado, a reacção volta a apresentar uma velocidade mais redu-zida, o estado respiratório 4.
O índice de controlo respiratório (ICR) foi avaliado como o quociente entre a velocidade respiratória na presença de ADP (estado 3) e após o consumo do ADP adicionado (estado 4).
Avaliação da taxa e amplitude do intumescimento mitocondrial
A pseudo-absorvância da suspensão mito-condrial foi determinada através da dispersão da luz a 90º, usando o fluorímetro Perkin Elmer LS50B (comprimento de onda de excitação – 540 nm; comprimento de onda de emissão – 543 nm; fendas de excitação e emissão – 3,5 nm).
Os ensaios foram realizados a 25 ºC sob agi-tação suave e contínua, em 2 mL de meio (200 mM sacarose, 10 mM Tris-MOPS, 10 µ M EGTA, 1 mM KH2PO4, pH 7,4) suplementado
com 1µM rotenona e 0,5 µ g oligomicina/mg proteína, tendo-se utilizado 0,2 mg de proteína para cada ensaio. Para cada fracção mitocon-drial efectuaram-se dois ensaios: um na pre-sença de 0,25 µM ciclosporina A e o outro na sua ausência. Em cada ensaio adicionou-se ainda 10 mM Ca2+e 500 µM de succinato. Avaliação dos resultados e estatística
Os resultados deste trabalho são apresenta-dos como percentagem do controlo, para o nú-mero de experiências indicadas.
O tratamento estatístico dos resultados foi realizado utilizando o teste t de Student não emparelhado. O nível de significância utilizado foi o de p < 0,05.
RESULTADOS
Os resultados obtidos mostram que a
fosfori-lação oxidativa é muito sensível à isquemia, a 57
ned as the ratio between respiratory rate in the presence of ADP (state 3) and after consump-tion of the added ADP (state 4).
Assessment of rate and amplitude of mitochondrial swelling
Pseudo-absorbance of the mitochondrial suspension was determined through light scat-tering at 90º, using a Perkin Elmer LS50B fluo-rometer (excitation wavelength – 540 nm; emis-sion wavelength – 543 nm; excitation and emission bandwidths – 3.5 nm).
The tests were performed at 25 ºC with smooth and continuous agitation, in 2 mL of medium (200 mM sucrose, 10 mM Tris-MOPS, 10 µ M EGTA, 1 mM KH2PO4, pH 7.4) together with
1 µM rotenone and 0.5 µ g oligomycin/mg protein, 0.2 mg of protein being used for each test. Two analyses were performed for each mi-tochondrial fraction: one with 0.25 µM cyclos-porine A and the other without. In each test 10 µM Ca2+ and 500 µM succinate were also
ad-ded.
Results and statistical analysis
The results of the study are presented as percentages of the control, for the number of ex-periments indicated.
Statistical analysis of the results was perfor-med using the Student’s t test for non-paired samples. The level of significance was taken to be p < 0.05.
RESULTS
The results obtained show that oxidative phosphorylation is highly sensitive to ischemia, which dramatically affects mitochondrial cou-pling, as demonstrated by increased oxygen consumption during respiratory state 3 compa-red to the value observed for control group mi-tochondria (66 ± 5 vs. 90 ± 15 nmol O2/min/mg
protein; p < 0.05). Imidapril (4 µM) reduced O2
consumption, although not significantly compa-red to the ischemic group (85 ± 20 nmol O2/min/mg protein; p = NS) (Fig. 1).
Using succinate as the energy substrate for the mitochondrial respiratory chain, it was found that electrical potentials following com-pletion of the phosphorylation cycle (³ ψ) de-creased significantly in the presence of ische-mia compared to the control group (208.5 ± 2 mV vs. 179.6 ± 1.1; p < 0.05). In the presence of
qual afecta drasticamente o acoplamento mito-condrial, tal como fica demonstrado pelo au-mento da velocidade do consumo de oxigénio durante o estado respiratório 3, quando compa-rado com o valor obtido para as mitocôndrias do grupo controlo (66±5 vs 90±15 nmol O2/min/mg
proteína; p < 0,05). O imidapril (4 µM) permi-tiu a obtenção de uma redução, embora não sig-nificativa, dos valores desse consumo de O2,
re-lativamente ao grupo isquémico (85±20 nmol O2/min/mg proteína; p = n.s.) – Fig. 1.
Ao testar o succinato como substrato energé-tico da cadeia respiratória mitocondrial, verifi-cou-se que os valores do potencial eléctrico ob-tido após a conclusão do ciclo fosforilativo (³ ψ) diminuíram de uma forma significativa na pre-sença da isquemia, quando comparados com os do grupo controlo (208,5 ± 2 mV vs 179,6 ± 1,1; p < 0,05). Na presença de imidapril, ocorreu uma melhoria significativa nos valores do po-tencial eléctrico no final do ciclo fosforilativo, relativamente ao grupo isquémico, (190,7 ± 2,3 mV vs 179,6 ± 1,1 mV; p < 0,05) – Fig. 2.
Outro dos parâmetros avaliados foi a ampli-tude e taxa de intumescimento mitocondrial, na presença e ausência de um inibidor do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (ci-closporina A). Tal como esperado, as mito-côndrias de corações submetidos a isquémia na ausência de imidapril apresentaram uma amplitude de intumescimento significativa-mente superior à das mitocômdrias do grupo controlo (205 ± 25 versus 148 ± 22 unidades ar-bitrárias – UA -; p < 0,05); o mesmo aconteceu,
58
imidapril, there was a significant improvement in electrical potential at the end of the phos-phorylation cycle compared to the ischemic group (190.7 ± 2.3 mV vs. 179.6 ± 1.1 mV; p < 0.05) (Fig. 2).
Another parameter assessed was the ampli-tude and rate of mitochondrial swelling, in the presence or absence of a mitochondrial permea-bility transition inhibitor (cyclosporine A). As expected, cardiac mitochondria subjected to is-chemia in the absence of imidapril presented significantly greater swelling amplitude than
200 100 0 Controlo Control 60 min Isq. 60 min isch 60 min Isq+Imio 60 min Isch+imidapril V elocidade r espiratória estado 3 Rate of r espirator y state 3 Controlo / Control 60 min Isq / 60 min ischemia
60 min Isq+Imid / 60 min ischemia+imidapril
Fig. 2. Comparação dos potenciais eléctricos (³ ψ) dos grupos
ex-perimentais controlo, isquémico e imidapril 4 µ M, obtidos após a adição do substrato energético ao meio de reacção contendo mito-côndrias cardíacas de rato. Os valores são apresentados em mV. # - p < 0,05 controlo versus isquémico; * - p < 0,05 isquémico ver-sus imidapril.
Fig. 2. Comparison of electrical potential (³ ψ) in the control,
ischemic and 4 mM imidapril groups, following addition of the energy substrate to the reaction medium containing rat heart mi-tochondria. Values are presented in mV. # - p < 0.05 control vs. ischemic; * - p < 0.05 ischemic vs. imidapril.
Fig. 1. Comparação dos valores
da velocidade respiratória do es-tado 3 em mitocôndrias cardíacas de rato (controlo e submetidas a isquemia na ausência ou presença de imidapril 4 µM), obtidos utili-zando como substrato energético o succinato. Os valores são apresen-tados em nmol O2/min/mg pro-teína.
Fig. 1. Comparison of respiratory
state 3 rate in rat heart mitochon-dria (controls and those subjected to ischemia in the absence or presence of 4 µM imidapril), using succinate as the energy substrate. Values are presented in nmol O2/min/mg protein.
embora de forma mais acentuada, na presença de ciclosporina A (145 ± 7 versus 70 ± 10 UA; p < 0,05). As mitocôndrias de corações tratados com imidapril apresentaram uma redução signi-ficativa da amplitude de intumescimento, quando comparadas com as de corações subme-tidos a isquémia na ausência de qualquer fár-maco; esta facto verificou-se quer na ausência de ciclosporina A (122 ± 13 versus 205 ± 25 UA; p < 0,05), quer na sua presença (80 ± 12 versus 145 ± 7 UA; p < 0,05). No que respeita à ampli-tude de intumescimento, os resultados foram qualitativamente semelhantes, quer na ausência de ciclosporina A (controlo: 0,52 ± 0,08; isqué-mico: 1,21 ± 0,10; imidapril: 0,45 ± 0,07; p < 0,05) quer na sua presença (controlo: 0,23 ± 0,04; is-quémico: 0,50 ± 0,02; imidapril: 0,25 ± 0,01; p < 0,05) – Fig. 3.
DISCUSSÃO
Ficou pela primeira vez demonstrado que o imidapril, na concentração utilizada neste es-tudo (4 µM), tem um efeito globalmente bené-fico sobre o metabolismo mitocondrial cardíaco durante a isquemia, quer no que respeita ao consumo eficaz de oxigénio, quer quanto à ca-pacidade de servir como «tampão» de cálcio, dois aspectos fundamentais, para o correcto funcionamento das mitocôndrias cardíacas du-rante a isquémia. No que respeita ao consumo
de oxigénio, o impacto positivo fez-se sentir so- 59
those of the control group (205 ± 25 vs. 148 ± 22 arbitrary units [AU]; p < 0,05); the same was found, although in a more marked fashion, with cyclosporine A (145 ± 7 vs. 70 ± 10 AU; p < 0.05). Cardiac mitochondria treated with imidapril presented a significant reduction in swelling amplitude compared to those subjected to is-chemia in the absence of any drug; this was also the case in the absence (122 ± 13 vs. 205 ± 25 AU; p < 0.05) or presence (80 ± 12 vs. 145 ± 7 AU; p < 0.05) of cyclosporine A. The re-sults for swelling amplitude were qualitatively similar in both the absence (control: 0.52 ± 0.08; ischemic: 1.2 ± 10.10; imidapril: 0.45 ± 0.07; p < 0.05) and presence (control: 0.23 ± 0.04; ischemic: 0.50 ± 0.02; imidapril: 0.25 ± 0.01; p < 0.05) of cyclosporine A (Fig. 3).
DISCUSSION
It has thus been demonstrated for the first time that imidapril, in the concentration used in this study (4 µM), has an overall beneficial ef-fect on cardiac mitochondrial metabolism dur-ing ischemia, through both efficient oxygen consumption and its ability to regulate calcium levels, both essential to maintain mitochondrial function during ischemia. The positive effect on oxygen consumption is mainly by optimization during oxidative phosphorylation (mitochon-drial respiratory state 3), enabling lower oxygen consumption for the same amount of
phosphory-250 200 150 100 50 0 1.5 1.0 0.5 0.0 Controlo Control 60 min Isq 60 min isch. 60 min Isq+Imid 60 min isch.+imidapril Controlo Control 60 min Isq 60 min isch. 60 min Isq+Imid 60 min isch.+imidapril Amplitude Intumescimento Swelling amplitude T axa Intumescimento Swelling rate -CsA +CsA
Fig. 3 Comparação dos valores da amplitude e taxa de intumescimento dos grupos experimentais controlo, isquémico e imidapril 4 µM,
na presença e ausência de ciclosporina A. Os valores são apresentados em unidades arbitrárias. # - p < 0,05 controlo versus isquémico; * - p < 0,05 isquémico versus imidapril.
Fig. 3. Comparison of amplitude and rate of swelling in the control, ischemic and 4 µM imidapril groups, in the presence or
absence of cyclosporine A (CsA). Values are presented in arbitrary units. # - p < 0.05 control vs. ischemic; * - p < 0.05 ischemic vs. imidapril.
bretudo ao nível da sua optimização durante o processo de fosforilação oxidativa (o chamado estado 3 da respiração mitocondrial), permi-tindo um menor consumo de oxigénio para uma mesma quantidade de ADP fosforilado; este facto traduz uma redução efectiva do chamado «consumo fútil» de oxigénio, o qual está rela-cionado com a produção das chamadas espécies reactivas de oxigénio (ROS), que está na base da maioria dos fenómenos deletérios associados ao stress oxidativo(6). Esta hipótese é confirmada
pelo facto de as mitocôndrias de corações trata-dos com imidapril serem capazes de desenvol-ver um potencial eléctrico ao nível da sua mem-brana interna muito próximo do obtido pelo grupo controlo e significativamente superior ao desenvolvido pelas mitocôndrias do grupo is-quémico. Este resultado só é possível se existir uma maior preservação da integridade da estru-tura e função da membrana mitocondrial in-terna, o que foi possível com o tratamento com imidapril. De facto, já em estudos anteriores outros iECA tinham demonstrado serem capa-zes de melhorar o consumo de O2,(2, 3)bem como
a produção mitocondrial de ATP(2), o que está
de acordo com estes resultados obtidos com o imidapril.
É também de ressaltar o facto de ficar de-monstrado que, nas mitocôndrias de corações submetidos a isquemia na presença de imida-pril, quer a amplitude, quer a taxa de intumes-cimento terem sido significativamente reduzi-dos, o que traduz uma maior capacidade de «tamponamento» do excesso de cálcio habitual-mente presente no citosol dos cardiomiócitos durante um episódio de isquemia(7); tal significa
uma maior capacidade de captar cálcio sem que ocorra o fenómeno de transição de permeabili-dade mitocondrial(8), o que levaria à
exterioriza-ção de componentes essenciais da matriz e es-paço intermembranar das mitocôndrias e, em última análise, à mitoptose e apoptose(9). Uma
vez mais, este resultado demonstra que o trata-mento com imidapril é eficaz na preservação da integridade e função das mitocôndrias cardía-cas durante a isquemia.
Estes achados parecem sustentar a hipótese de que a cardioprotecção induzida pelo imida-pril no contexto de isquemia miocárdica se deve, pelo menos em parte, ao seu impacto po-sitivo no metabolismo mitocondrial. Os resulta-dos obtiresulta-dos neste protocolo experimental permi-tem estabelecer as bases bioquímicas e
60
lated ADP; this leads to a reduction in “futile oxygen consumption”, which is related to pro-duction of the reactive oxygen species that are involved in most of the harmful phenomena associated with oxidative stress(6). This
hypothe-sis is confirmed by the finding that the cardiac mitochondria treated with imidapril were able to develop an internal membrane electrical po-tential that was close to that obtained in the control group and significantly greater than that developed by the mitochondria in the ischemic group. Such a result is only possible if there was greater preservation of internal membrane integrity and function following treatment with imidapril. Indeed, in previous studies other ACEIs have been shown to improve O2
con-sumption(2, 3)as well as mitochondrial ATP
pro-duction(2), which is in agreement with the
re-sults obtained with imidapril.
It should also be noted that in the cardiac mitochondria subjected to ischemia in the pres-ence of imidapril, both the amplitude and rate of swelling were significantly reduced, reflec-ting a greater ability to prevent the excess of calcium usually found in the cytosol of cardio-myocytes during an ischemic episode(7). This
means there was increased calcium uptake without triggering the mitochondrial permeabi-lity transition(8), which would lead to essential
components leaking from the mitochondrial ma-trix and intermembrane space and ultimately to mitoptosis or apoptosis(9). Once again, this
re-sult shows that treatment with imidapril is ef-fective in preserving cardiac mitochondrial in-tegrity and function during ischemia.
These findings would appear to support the hypothesis that the cardioprotection afforded by imidapril in myocardial ischemia is due, at least in part, to its positive impact on mitochon-drial metabolism. The results obtained in this experimental protocol establish the biochemical and intracellular basis of the beneficial effects that ACEIs have been shown to have in succes-sive clinical trials(10)and open up new
perspec-tives for the understanding and treatment of ischemic cardiopathy, which is a major cause of mortality and morbidity in Western societies.
CONCLUSIONS
These results demonstrate that the angioten-sin I converting enzyme inhibitor imidapril, by optimizing oxygen consumption and reducing mitochondrial swelling (thus preserving cardiac
intracelulares para os resultados positivos que os iECA têm demonstrado em sucessivos en-saios clínicos(10), e permitem abrir novas
pers-pectivas para o conhecimento e tratamento da cardiopatia isquémica, uma importante causa de mortalidade e de morbilidade nas socieda-des ocidentais.
CONCLUSÕES
Estes resultados demonstram que o imida-pril, um inibidor da enzima de conversão da an-giotensina I, ao optimizar o consumo de oxigé-nio e reduzir o intumescimento mitocondrial (preservando por esses mecanismos a integri-dade morfológica e funcional das mitocôndrias cardíacas), tem um impacto positivo no dano mitocondrial induzido pela isquemia miocár-dica aguda e pela sobracarga de cálcio que lhe está habitualmente associada. Estes factos po-derão contribuir para explicar melhor os funda-mentos bioquímicos dos bons resultados clíni-cos obtidos por esta classe de fármaclíni-cos no tratamento da insuficiência cardíaca e cardio-patia isquémica.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi parcialmente financiado pela Procardio. O imidapril foi gentilmente ce-dido pelos Laboratórios Bial.
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mitochondrial structure and function), has a positive impact on the mitochondrial damage induced by acute myocardial ischemia and associated calcium overload. These findings may contribute to a better understanding of the biochemical basis of the good clinical results obtained with this class of drugs in the treat-ment of heart failure and ischemic cardiopathy.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was partly funded by Procardio. The imidapril was kindly provided by Laborató-rios Bial.
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Hospitais da Universidade de Coimbra Praceta Prof. Mota Pinto
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