UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ANA PAULA DOS SANTOS
APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO PARA
IDENTIFICAR MUTAÇÕES PATOGÊNICAS NA DISGENESIA GONADAL 46,XY
Campinas
2018
APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO PARA
IDENTIFICAR MUTAÇÕES PATOGÊNICAS NA DISGENESIA GONADAL 46,XY
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências
Médicas
da
Universidade
Estadual
de
Campinas como parte dos
requisitos
exigidos
para
a
obtenção do título de Doutora
em
Ciências,
área
de
concentração Genética Médica.
Orientadora: Prof(a) Dr(a) Andréa Trevas Maciel Guerra
Co-orientadora: Prof(a) Dr(a) Maricilda Palandi de Mello
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANA PAULA DOS SANTOS E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA.
Campinas
2018
ANA PAULA DOS SANTOS
ORIENTADOR: PROFA. DRA. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA COORIENTADOR: PROFA. DRA. MARICILDA PALANDI DE MELLO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA
2. PROFA. DRA. ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA
3. PROF. DR. FERNANDO AUGUSTO DE LIMA MARSON
4. PROFA. DRA. ELAINE MARIA FRADE COSTA
5. PROFA. DRA. ADRIANA APARECIDA SIVIERO-MIACHON
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“Quanto
mais
aumenta
nosso
conhecimento, mais evidente fica nossa
ignorância”
Em primeiro a lugar, a Deus, por todas as bênçãos concedidas e por nunca soltar minha mão.
Aos meus negros, Rose e Magela, vocês são minha fortaleza. Com certeza, meu maior tesouro. Obrigada por existirem!
Aos meus “neguinhos”, Úrsula e Juninho, meus parceiros, meus amigos, meus irmãos, obrigada por não me abandonarem na caminhada da vida. Que a nossa união seja eterna!
À minha madrinha, Tuti, por ser minha segunda mamãe. Que Deus te ilumine e te cubra de saúde!
À minha tia Lúcia, por não deixar de acreditar em mim. À toda minha família, pelo apoio e encorajamento.
Às coincidências do destino e suas surpresas. Obrigada, Roberto, por toda a ajuda e por todos os momentos inesquecíveis. Que a gente continue desbravando o mundo juntos! Às minhas orientadoras, Andréa e Maricilda, obrigada pela oportunidade e confiança. Aprendi muito nesses últimos anos e sou extremamente grata pelo carinho e compromisso que vocês me ofertaram.
Aos pacientes e familiares por contribuírem com a realização deste trabalho. À equipe do GIEDDS pela contribuição clínica.
Aos meus supervisores da Alemanha, Ralf e Olaf, obrigada pela oportunidade de aprendizado não apenas científico, mas também cultural. Obrigada em especial ao Ralf, pela perseverança, perfeccionismos, nossos almoços e todos os sorvetes nos dias “quentes”.
À amiga Asma, uma pessoa muito doce que me ensinou muito em pouco tempo e claro, um brinde ao nosso encontro que nos permitiu tempo para terminar as refeições. Aos colegas Susanne, Markus, Dagmar e Lou pelo companheirismo alemão.
sempre mais doce do que seria sem vocês.
Aos amigos do laboratório de Genética Molecular Humana do CBMEG, em especial a Helena e a Mara por me socorrerem sempre com as minhas “curiosidades”, a Taís e a Luana por me ajudarem nos meus momentos críticos e a Cris que está sempre na mesma situação que eu, “só correndo”.
Ao colega Fábio Rossi, por toda a contribuição científica.
Às amigas Dani e Loira, pelo nosso inseparável caramelo, chocolate, biscoito e embalagem. Obrigada por todos os sorrisos e lágrimas compartilhados!
Às amigas Fran e Bia, pelo apoio mútuo e incondicional.
À amiga Tânia, mesmo longe, você esteve sempre muito perto. À família Francese, por me receber de braços abertos.
À FAPESP (15/04763-4) pelo suporte financeiro, sem o qual este trabalho não seria possível.
À CAPES (PDSE -88881.135162/2016-01) pela oportunidade do doutorado sanduíche.
A todos que de qualquer maneira me ajudaram na realização deste trabalho, meu muito obrigada!!!!
Distúrbios da Diferenciação do Sexo (DDS) são condições congênitas onde não existe concordância entre o sexo genético, gonadal e genital do indivíduo. São classificados em três grupos: (1) DDS com anomalias de cromossomos sexuais; (2) DDS 46,XX e (3) DDS 46,XY. Esse último inclui distúrbios da diferenciação gonadal e defeitos na biossíntese e ação dos hormônios testiculares. Entre os DDS XY com distúrbio da diferenciação gonadal estão duas condições investigadas neste trabalho: a disgenesia gonadal parcial (DGP), caracterizada por ambiguidade genital devido a graus variáveis de diferenciação testicular; e a disgenesia gonadal completa (DGC), na qual há genitais internos e externos femininos e gônadas disgenéticas. São afecções raras, etiologicamente heterogêneas e de origem desconhecida na maioria dos casos. Atualmente, as tecnologias de alto rendimento, como painéis gênicos e sequenciamento do exoma, possibilitam a pesquisa de variantes deletérias em diversos genes utilizando um único experimento, sendo empregadas para estudo de afecções de etiologia heterogênea. Este estudo teve por objetivo investigar novas variantes deletérias em indivíduos com DGP e DGC que possam ser a causa dessas afecções e, eventualmente, identificar novos genes envolvidos na diferenciação testicular. A casuística foi composta por dez indivíduos com DGP e quatro indivíduos com DGC com idades variando de 1 mês a 18 anos. Sete pacientes com DGP foram criados no sexo masculino; os demais pacientes da casuística tinham sexo social feminino. Foi critério de exclusão a presença de variantes nos genes SRY, WT1 e NR5A1 que explicassem os achados fenotípicos. A investigação de trios (genitores e probandos) foi realizada sempre que possível. Para a pesquisa de SNV e Indels foi utilizado o sequenciamento do exoma em oito casos de DGP. Em seis casos (quatro com DGC e dois com DGP), a investigação foi realizada utilizando o painel gênico AmpliSeq com mais de 80 genes previamente descritos associados com DDS 46,XY. As sequências foram alinhadas ao genoma de referência humano GRCh37/hg19. Foram identificadas variantes em diferentes genes já reconhecidos ou potencialmente envolvidos na diferenciação testicular e dezesseis genes candidatos são propostos; entre eles quatro foram recorrentes na amostra: HHAT,
WWOX, SIX4 e CYR61. O provável desequilíbrio da via hedgehog e do NR5A1 também
Disorders of sex development (DSD) are congenital conditions in which development of chromosomal, gonadal, or anatomic sex is atypical. DSD are classified into three groups: (1) DSD with sex chromosome abnormalities; (2) 46,XX DSD and (3) 46,XY DSD. The latter includes disorders of gonadal differentiation and defects in the biosynthesis or action of testicular hormones. The group of XY DSD with disorders of gonadal development includes the two conditions investigated in this study: partial gonadal dysgenesis (PGD), characterized by genital ambiguity due to variable degrees of testicular differentiation; and complete gonadal dysgenesis (CGD), in which there are female internal and external genitalia and streak gonads. Both are rare disorders, with heterogeneous etiology and, in most cases, unknown origin. Nowadays, high-throughput technologies such as gene panels and whole exome sequencing (WES) enable the search of deleterious variants in several genes using a single experiment and have been used to investigate etiologically heterogeneous conditions. The aim of this study was to investigate deleterious variants in patients with PGD and CGD that could be the origin of these disorders and, in addition, identify new genes involved in testicular differentiation. Our sample comprised ten individuals with PGD and four with CGD whose ages ranged from 1 month to 18 years. Seven patients with PGD were reared as males; all other patients in the sample had a female sex assignment. Patients with SRY,
WT1 or NR5A1 variants which explained the phenotype were not included. The
investigation of trios (parents and probands) was performed whenever possible. The search for SNV and Indels was carried out by exome sequencing in eight individuals with PGD. A panel sequencing using a custom Next Generation Sequencing (NGS) AmpliSeq gene panel containing more than 80 genes that have been previously reported to be implicated with 46,XY DSD was performed in six cases (four with CGD and two with PGD). Paired-end reads were aligned to the reference genome (GRCh37/hg19). Variants were identified in different genes already related or potentially involved in testicular differentiation and sixteen candidate genes for XY DSD are proposed; among them, four were recurrent in the cohort: HHAT, WWOX, SIX4 and CYR61. The likely imbalance of the hedgehog and NR5A1 pathways was also observed with recurrence among the cases.
Figura 01: Esquema das etapas da diferenciação sexual normal... 24 Figura 02: Esquema das principais etapas da construção das bibliotecas para o
sequenciamento do exoma. ... 45
Figura 03: Fluxograma da segunda etapa de análise. ... 51 Figura 04: Etapas da construção da biblioteca para o sequenciamento do painel gênico.
... 53
Figura 05: Ilustração das interações entre os genes HHAT, IHH, SHH e DHH. ... 71 Figura 06: Gráfico das sondas de número de cópias do ensaio de aGH mostrando uma
duplicação em Xp21.2 [30,580,693-30,857,187]... 82
Figura 07: Visualização no IGV da região em que se suspeitava estarem localizados os
pontos de quebra da duplicação. ... 83
Figura 08: Mapeamento da duplicação em Xp21.2. ... 84 Figura 09: Representação esquemática comparando a duplicação identificada no
indivíduo 9 com as variações de número de cópias previamente descritas na literatura em Xp21.2. ... 86
Figura 10: Interação dos genes em que foram encontradas variantes neste trabalho (em
Tabela 01: Classificação dos distúrbios da diferenciação do sexo proposta no consenso
de Chicago (adaptada de Hughes et al., 2006). ... 28
Tabela 02: Indivíduos da casuística subdivididos em dois grupos de acordo com a tecnologia utilizada para a investigação das variantes. ... 41
Tabela 03: Soluções utilizadas na extração de DNA genômico... 43
Tabela 04: Genes pré-selecionados para a busca inicial de variantes (genes-alvo). ... 48
Tabela 05: Genes incluídos no painel gênico. ... 54
Tabela 06: Primers desenhados para validação das variantes de interesse. ... 60
Tabela 07: Condições para PCR. ... 61
Tabela 08: Características clínicas dos indivíduos com disgenesia gonadal parcial investigados por sequenciamento do exoma. ... 64
Tabela 09: Características clínicas dos indivíduos com disgenesia gonadal parcial e disgenesia gonadal completa investigados por sequenciamento do painel gênico. ... 65
Tabela 10: Variantes identificadas por sequenciamento do exoma na primeira e na segunda abordagem de análise em indivíduos com DGP. ... 68
ACM - Análise Cromossômica por Microarray
ACMG - Colégio Americano de Genética Médica e Genômica - American College of
Medical Genetics and Genomics
aDGV - Database of Genomic Variations – Affymetrix®
ANOS1 - anosmin 1
Associação MURCS - Aplasia dos dutos de Müller, agenesia renal unilateral e displasia de somitos cervicotorácicos - Mullerian duct aplasia, unilateral renal agenesis, and
cervivothoracic somite anomalies
ATRX - chromatin remodeler
BAM - Binary Alignment Map
Bio-Grid - Biological General Repository for Interaction Datasets BIPMed - Brazilian Initiative on Precision Medicine
BMPR1A - bone morphogenetic protein receptor type 1A
BNC2 - basonuclin 2
BWA - Burrows-Wheeler Alinhador c. - Posição do nucleotídeo no cDNA
CAAE - Certificado de Apresentação para Apreciação Ética CADD - Combined Annotation Dependent Depletion
cAMP - adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CBMEG - Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
ChAS - Chromosome Analysis Suite
CNV - variações do número de cópias - copy number variations
CXorf21 - chromosome X open reading frame 21
CYR61 - Cysteine-rich, angiogenic inducer 61
dbSNP - Short Genetic Variations
DDG - Distúrbios da Diferenciação Gonadal DDS - Distúrbios da Diferenciação do Sexo
Decipher - Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using
Ensembl Resources
DGC - Disgenesia Gonadal Completa
DGKQ - diacylglycerol kinase theta
DGP - Disgenesia Gonadal Parcial DGV - Database of Genomic Variations
DHH - desert hedgehog
DMRT1 - doublesex and mab-3 related transcription factor 1
DMRT3 - doublesex and mab-3 related transcription factor 3
DNA - ácido desoxirribonucléico
DNMT3B - DNA methyltransferase 3 beta
EDTA - etilenodiamino tetra-acético 2H20
EHMT2 - euchromatic histone lysine methyltransferase 2
EP300 - E1A binding protein p300
ExAC - Exome Aggregation Consortium
FAM170A - family with sequence similarity 170 member A
FANCA - FA complementation group A
FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FATHMM - Functional Analysis through Hidden Markov Models (v2.3)
FBLN2 - fibulin 2
FCM - Faculdade de Ciências Médicas
FGF9 - fibroblast growth factor 9
FISH - hibridação in situ por fluorescência
FLNB - filamin B
FOG2 - ZFPM2 - zinc finger protein, FOG family member 2
FOXL2 - forkhead Transcription Factor
FOXO3 - forkhead box O3
GATA4 - GATA binding protein 4
GIEDDS - Grupo Interdisciplinar de Estudos da Determinação e Diferenciação do Sexo
GK - glycerol kinase
GRCh37 - Genome Reference Consortium Human Build 37
GRPR - gastrin releasing peptide receptor
HAM - hormônio anti-mülleriano hCG - gonadotrofina coriônica humana HCl - ácido clorídrico
HOXA4 - homeobox A4
HPM - Human Proteome Map HSE - heat shock
IGF1R - insulin like growth factor 1 receptor
IGV - Integrative Genome Viewer
IHH - indian hedgehog
InDels - Deleções e inserções de nucleotídeos
Ion Torrent PGM - Ion Torrent Personal Genome Machine
JAK2 - Janus kinase 2
JAK-STAT - Janus kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription proteins
Kb - kilo base
LH - Hormônio luteinizante
MAP3K1 - mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1
MDR1 - ABCB1 ATP binding cassette subfamily B member 1
MgCl2 - Cloreto de magnésio
MLPA - Múltiplas Sondas Dependente de Ligação - Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification
Na2EDTA - etilenodiaminotetracético dissódico NaCl - Cloreto de sódio.
NCBI - National Center for Biotechnology Information
NCOA1 - nuclear receptor coactivator 1
NCOA2 - nuclear receptor coactivator 2
NR2F2 - nuclear receptor subfamily 2 group F member 2
NR3C2 - nuclear receptor subfamily 3 group C member 2
NR5A1 - nuclear Receptor Subfamily 5, Group A, Member 1
NRIP1 - nuclear receptor interacting protein 1
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man pb - pares de base
PCR - reação em cadeia da polimerase - Polymerase Chain Reaction
PITX2 - paired like homeodomain 2
PLXNA1 - plexin A1
PLXNB1 - plexin B1
PLXNC1 - plexin C1
POI - Falência Ovariana Primária - Primary Ovarian Insufficiency Polyphen2 - Prediction of functional effects of human nsSNPs
POR - cytochrome p450 oxidoreductase
PTCH1 - patched 1
RSPO1 - R-spondin
SDS - dodecil sulfato de sódio
SHH - sonic hedgehog
SIFT - Sorting Intolerant from Tolerant
SIX1 - SIX homeobox1
SMOC2 - SPARC related modular calcium binding 2
SOX3 - SRY-box 3
SOX9 - SRY-box 9
SPIDR - scaffold protein involved in DNA repair
SRA1 - steroid receptor RNA activator 1
SRY - Sex-determining Region on the Y chromosome
STAR - steroidogenic acute regulatory protein
SV - variações estruturais - structural variations
TAB3 - TGF-beta activated kinase 1 (MAP3K7) binding protein 3
TCLE - termo de consentimento livre e esclarecido TE - Tris – EDTA
TTLL4 - tubulin tyrosine ligase like 4
UBE2I - ubiquitin conjugating enzyme E2 I
UCSC - University of California Santa Cruz UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas UTR - regiões não traduzidas - untranslated regions VCF - Variant Call Format
WDR5 - WD repeat domain 5
WES - Sequenciamento do Exoma - Whole Exome Sequencing WGS - Sequenciamento do Genoma - Whole Genome Sequencing
WNT4 - Wingless-type MMTV integration site family, member 4
WT1 - Wilms Tumor supressor locus – gene 1
1. Introdução ... 21
1.1. Desenvolvimento sexual normal ... 21
1.2. Distúrbios da Diferenciação do Sexo ... 25
1.2.1. Classificação dos Distúrbios da Diferenciação do Sexo ... 26
1.2.1.1. Distúrbios da Diferenciação Gonadal 46,XY ... 29
1.2.1.1.1. Disgenesia Gonadal Parcial ... 30
1.2.1.1.2. Disgenesia Gonadal Completa ... 30
1.2.2. Investigação da etiologia genética dos Distúrbios da Diferenciação do Sexo... 32
2. Justificativa ... 38 3. Objetivos... 39 3.1. Geral ... 39 3.2. Específicos ... 39 4. Métodos ... 40 4.1. Obtenção da Casuística ... 40 4.2. Estudos moleculares ... 42
4.2.1. Extração de DNA genômico ... 42
4.2.1.1. Análise da qualidade do DNA genômico ... 43
4.2.2. Sequenciamento do exoma ... 44
4.2.2.1. Processamento dos arquivos brutos para a chamada de variantes ... 46
4.2.2.2. Análise das variantes detectadas... 46
4.2.3. Sequenciamento do painel gênico ... 52
4.2.3.1. Análise das variantes... 55
4.2.4. Análise molecular complementar para confirmação da duplicação em Xp21.2 no indivíduo 9 ... 55
4.2.4.1. Análise cromossômica por microarray ... 56
4.2.4.1.1. Análise das CNVs ... 57
4.2.4.2. Sequenciamento do genoma ... 58
4.2.4.2.1. Análise dos dados de exoma extraídos do sequenciamento do genoma ... 59
4.2.4.2.2.Refinamento dos pontos de quebra utilizando os dados do sequenciamento do genoma ... 59
4.2.5. Sequenciamento de Sanger ... 60
5. Resultados e Discussão dos Casos ... 63
5.1. Descrição da casuística ... 63
5.2.1.2. Terceira abordagem de análise ... 77
5.2.1.3. Quarta abordagem de análise ... 78
5.2.2. Resultados do sequenciamento do painel gênico ... 78
5.2.3. Resultados da análise complementar para o Indivíduo 9 ... 81
5.2.3.1. Análise cromossômica por microarray ... 81
5.2.3.2. Sequenciamento do genoma ... 82
6. Discussão geral... 88
7. Conclusões ... 94
8. Referências ... 95
9. Anexos ... 111
9.1. Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética ... 111
9.2. Anexo 2: Adendo submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa... 114
1. Introdução
1.1. Desenvolvimento sexual normal
O desenvolvimento sexual é um processo complexo, constituído por etapas consecutivas e interdependentes. Didaticamente, em seres humanos esse processo é dividido em duas etapas: determinação e diferenciação sexual (1). A determinação gonadal depende do sexo genético: a união do ovócito materno (23,X) com o espermatozoide (23,X ou 23,Y) resulta no sexo homogamético (46,XX), feminino, ou no sexo heterogamético (46,XY), masculino (2,3). Esse processo depende ainda da interação entre genes presentes nos cromossomos sexuais e nos autossomos e de fatores transcricionais (4–6).
A etapa de diferenciação sexual é dependente da função gonadal e resulta no desenvolvimento do sexo fenotípico (7). A secreção e ação de hormônios específicos contribui para o desenvolvimento dos genitais internos e externos, e posteriormente, para o amadurecimento sexual durante a puberdade (8). A Figura 01 ilustra as principais etapas da diferenciação sexual.
Até cerca de 7 a 8 semanas após a fertilização não há diferenças morfológicas entre os primórdios do aparelho reprodutor de indivíduos 46,XX e 46,XY (9). Essa etapa da diferenciação sexual é denominada estado sexualmente neutro ou indiferenciado e se inicia por volta da quarta semana, quando a migração das células germinativas primordiais forma as saliências gonadais. A seguir, surgem os dutos de Wolff (dutos mesonéfricos), que são os primórdios da genitália interna masculin
a, e os dutos de Müller (dutos paramesonéfricos), que são os primórdios da genitália interna feminina, além dos rudimentos dos genitais externos (tubérculo genital, pregas genitais e saliências labioescrotais). Ao final da sexta semana, o seio urogenital é formado e o tubérculo genital alonga-se, passando a ser chamado falo. A diferenciação subsequente é dependente do sexo genético do embrião (6,10).
Em embriões de sexo genético masculino, o gene SRY (Sex-determining Region
on the Y chromosome), localizado em Yp11.2, codifica uma proteína que atinge o nível
máximo de expressão por volta da sexta semana gestacional, promovendo o início da diferenciação da gônada bissexual. A proteína expressa por esse gene induz o aumento
da expressão de SOX9 (SRY-box 9), iniciando assim a complexa cascata gênica que media a diferenciação testicular. Associada à ação do gene SRY está a de outros genes envolvidos na diferenciação testicular, como WT1 (Wilms Tumor supressor locus – gene
1), NR5A1 (Nuclear Receptor Subfamily 5, Group A, Member 1) e NR0B1 (nuclear receptor subfamily 0, group B, member 1). O produto protéico desses genes faz com que
as células epiteliais dos dutos mesonéfricos se diferenciem em células de Sertoli. Estas, por sua vez, se agrupam formando cordões que englobam as células sexuais primitivas, e se tornam, assim, espermatogônias. Esses cordões desenvolvem-se para formar os túbulos seminíferos, e as células de Leydig, derivadas do mesênquima, podem ser observadas entre os túbulos a partir da oitava semana, atingindo um número máximo entre 14 e 18 semanas (4–6,10).
A partir da sétima semana as células de Sertoli sintetizam o hormônio anti-mülleriano (HAM), que induz a regressão dos dutos de Müller. Em seguida, a testosterona produzida pelas células de Leydig induz a diferenciação dos dutos de Wolff em epididímos, canais deferentes, vesículas seminais e dutos ejaculatórios. A virilização dos genitais externos ocorre entre a nona e a décima segunda semana de gestação em resposta à diidrotestosterona, resultado da ação da enzima 5α-redutase tipo 2 sobre a testosterona. Tanto a testosterona quanto a diidrotestosterona atuam nas células-alvo por meio do receptor de andrógenos (4,6).
Em embriões de sexo genético feminino, a diferenciação sexual inicia-se por volta da décima semana gestacional com a diferenciação ovariana, caracterizada pela diferenciação das células mesenquimatosas em células foliculares, que envolvem as células germinativas primordiais, as quais se tornam as ovogônias, que dão origem aos ovócitos primários. O processo de divisão da meiose é interrompido na meiose I na décima primeira semana até o início do ciclo ovulatório na idade adulta (4,6).
Na ausência de HAM, os dutos de Müller se desenvolvem para formar o trato genital feminino. Por sua vez, a ausência de andrógenos impede a diferenciação dos dutos de Wolff, que persistem somente como vestígios embrionários. Finalmente, na ausência da diidrotestosterona, os rudimentos genitais externos dão origem à genitália externa feminina (4–6).
A gonadogênese feminina depende da inibição do SOX9 e da ativação do gene
expressão da RSPO1 (R-spondin). O gene FOXL2 (Forkhead Transcription Factor) possui papel crítico na manutenção ovariana e ação anti-testicular por inibição do SOX9. Apesar do papel essencial do gene NR5A1 no desenvolvimento da gônada bipotencial e na diferenciação dos testículos, o mesmo não participa do desenvolvimento ovariano, porém é necessário para a manutenção da função ovariana (2). Além disso, é fundamental a presença de dois cromossomos X íntegros, uma vez que o cromossomo X contém várias regiões necessárias para a manutenção da gônada feminina (4,5,11).
A diferenciação sexual secundária compreende a última fase do processo de desenvolvimento sexual. Esta é dependente da produção hormonal, que se inicia na adolescência, para a finalização do fenótipo característico dos dois sexos (11).
A concordância entre o sexo genético e o sexo fenotípico depende da expressão têmporo-espacial sinérgica de numerosos fatores de ativação e repressão, com correto funcionamento das etapas descritas anteriormente. Assim, qualquer fator que provoque alterações dessa sequência de desenvolvimento pode resultar na presença de gônadas estruturalmente anômalas e (ou) anomalias nos genitais internos e (ou) externos (12,13).
Figura 01: Esquema das etapas da diferenciação sexual normal.
1.2. Distúrbios da Diferenciação do Sexo
Os Distúrbios da Diferenciação do Sexo (DDS) compreendem um grupo heterogêneo de condições congênitas associadas a erros nos processos de determinação e (ou) diferenciação sexual, nas quais o sexo cromossômico, gonadal ou anatômico é atípico. A frequência estimada dessas condições é de 1 para 4500 nascidos vivos (14,15).
Indivíduos com DDS podem ser diagnosticados em diferentes períodos: em fetos ou recém nascidos com genitália ambígua ou fenótipo genital discordante do complemento cromossômico; mais tardiamente, na adolescência, por atraso na puberdade, sinais puberais heterossexuais ou tumores gonadais; ou ainda na vida adulta, devido a infertilidade (13,16). O diagnóstico dessas condições baseia-se nos achados clínicos, exames hormonais, histologia gonadal, exames de imagem, cariótipo e testes genéticos disponíveis (13,16).
As causas genéticas já descritas dos DDS compreendem as anomalias de cromossomos sexuais (como nas síndromes de Turner e Klinefelter), variações estruturais (structural variations – SV) em regiões gênicas ou regiões regulatórias de genes sensíveis a dosagem, como os genes SOX9 e NR0B1, assim como as variantes de nucleotídeo único (single nucleotide variants – SNVs) em genes envolvidos no desenvolvimento gonadal ou na biossíntese ou ação de hormônios sexuais (1,3).
Apesar do grande avanço tecnológico na biologia molecular e do crescimento gradativo do conhecimento acerca do processo da gonadogênese, estima-se que o diagnóstico molecular é feito apenas em aproximadamente 20% dos casos de DDS, sendo que a maioria dos pacientes não recebem um diagnóstico genético preciso (1). Um dos grandes desafios no diagnóstico dessas condições é a grande variabilidade fenotípica, mesmo dentro de famílias, o que sugere a existência de outros fatores moduladores que influenciam na expressão fenotípica (1).
Na grande maioria dos casos, os DDS estão associados a ambiguidade genital e infertilidade, o que representa um desafio para os médicos, os pais e os próprios indivíduos afetados, que enfrentam correções cirúrgicas e dificuldades físicas, emocionais e psicológicas significativas. Além disso, frequentemente apresentam maior
predisposição para o desenvolvimento de tumores gonadais (1,16). Em alguns casos a identidade de gênero pode ser discordante do gênero de criação, o que pode requerer uma mudança do sexo atribuído (16). Assim, o seguimento clínico desse pacientes requer uma equipe multidisciplinar composta por pediatras, endocrinologistas, geneticistas, cirurgiões, ginecologistas, psicólogos, psiquiatras e assistentes sociais, entre outros (1,13).
Os testes genéticos desempenham papel fundamental na avaliação de indivíduos com DDS. O conhecimento da etiologia genética melhora a capacidade de prever a evolução do paciente, esclarece o risco de recorrência e pode ser utilizado na tomada de decisões médicas.
1.2.1. Classificação dos Distúrbios da Diferenciação do Sexo
Os DDS são classificados em três grandes grupos: (1) DDS com anomalias de cromossomos sexuais; (2) DDS 46,XY e (3) DDS 46,XX (14,15). A classificação dessas condições, baseada no componente cromossômico e no tipo de gônada, foi proposta em 2005, no Chicago Consensus on Management of Intersex Disorders e encontra-se na Tabela 01.
Os DDS com anomalias de cromossomos sexuais podem estar associados a alterações numéricas e (ou) estruturais. Esse grupo inclui as síndromes de Turner (cujo cariótipo mais comumente encontrado é o 45,X) e Klinefelter (47,XXY). Geralmente os portadores dessas síndromes não apresentam alterações genitais, mas sim atraso puberal e infertilidade. Por outro lado, o mosaicismo 45,X/46,XY ou suas variantes e o quimerismo 46,XX/46,XY estão geralmente associados a ambiguidade genital (17).
Por sua vez, os DDS 46,XX resultam, na maioria dos casos, da exposição fetal a níveis elevados de andrógenos; esses indivíduos possuem ovários e derivados müllerianos e apresentam masculinização dos genitais externos em graus variados. Um subgrupo mais raro dos DDS 46,XX apresenta distúrbios da diferenciação gonadal (DDG), com gônadas disgenéticas bilateralmente (disgenesia gonadal completa), tecido testicular bilateral (DDS 46,XX testicular) ou concomitância de tecido ovariano e testicular (DDS 46,XX ovário-testicular, ou hermafroditismo) (17).
O terceiro grupo é o dos DDS 46,XY, que inclui indivíduos com DDG e defeitos na biossíntese ou na ação dos hormônios testiculares (Tabela 01). O foco deste trabalho está em dois subgrupos raros de DDG que fazem parte desse grupo e serão detalhados nos próximos tópicos.
Tabela 01: Classificação dos distúrbios da diferenciação do sexo proposta no consenso de Chicago (adaptada de Hughes et al., 2006).
DDS associados a anomalias de cromossomos
sexuais DDS 46,XY DDS 46,XX
Distúrbios da diferenciação gonadal:
1) 45,X (síndrome de Turner e variantes); 2) 47,XXY (síndrome de Klinefelter e variantes); 3) 45,X/46,XY (disgenesia gonadal mista, DDS
ovotesticular#);
4) 46,XX/46,XY (DDS ovotesticular# por quimerismo)
Distúrbios da diferenciação gonadal (testicular): 1) disgenesia gonadal pura (Swyer syndrome); 2) disgenesia gonadal parcial (isolada ou
sindrômica), 3) regressão testicular, 4) DDS ovotesticular#
Distúrbios da diferenciação gonadal (ovariana): disgenesia gonadal pura, DDS testicular*, DDS ovotesticular#
Excesso de andrógenos: fetais (ex.: deficiência de 21-hidroxilase e 11-21-hidroxilase)), fetoplacentários (ex.: deficiência de aromatase), maternos (ex.: luteoma, exógenos)
Outros: ex.: associação MURCS, extrofia da cloaca Distúrbios da síntese ou ação dos hormônios testiculares:
defeitos de síntese de andrógenos (ex.: deficiência de 17-hydroxiesteróide desidrogenase, deficiência de 5-redutase e mutações no gene StAR);
2) defeitos na ação de andrógenos (ex: síndromes de insensibilidade a andrógeno)
3) defeitos no receptor de LH/hCG (ex: hipoplasia de células de Leydig, aplasia)
4) deficiência de HAM e defeitos do receptor de HAM (ex: Persistência dos ductos de Müller)
Outros: ex.: extrofia da cloaca * nomenclatura proposta para homem XX; # nomenclatura proposta para hermafroditismo
1.2.1.1. Distúrbios da Diferenciação Gonadal 46,XY
Neste sub-grupo as alterações fenotípicas podem estar limitadas ao aparelho reprodutor ou incluir outras anomalias congênitas (13).
Os DDG 46,XY resultam de falhas no processo do desenvolvimento gonadal podendo originar gônadas extremamente hipoplásicas e disfuncionais, compostas basicamente de tecido fibroso e sem estruturas que permitam caracterizá-la como testículo ou ovário, denominadas gônadas disgenéticas (em fita ou streak), ou diferenciação testicular parcial, resultando em testículos disgenéticos. Estes caracterizam-se histologicamente por anomalias tubulares e intersticiais em graus variáveis associadas a fibrose e hialinização (18,19).
Deleções ou mutações de ponto no gene SRY são identificadas em aproximadamente 15% desses indivíduos. Além disso, a perda de função do gene SOX9 e variantes patogênicas nos genes NR5A1, MAP3K1 (mitogen-activated protein kinase
kinase kinase 1), DHH (desert hedgehog), GATA4 (GATA binding protein 4), STAR
(steroidogenic acute regulatory protein), POR (cytochrome p450 oxidoreductase), CBX2 (chromobox 2) e DMRT1 (doublesex and mab-3 related transcription factor 1), entre outros genes participantes da diferenciação testicular, já foram associadas a essas condições (1,13,20).
A presença de gônadas disgenéticas bilateralmente em indivíduos 46,XY com genitais internos e externos femininos caracteriza a disgenesia gonadal completa (DGC) (18), enquanto que a presença de testículos disgenéticos associados ou não a gônadas disgenéticas em indivíduos 46,XY com ambiguidade genital são achados da disgenesia gonadal parcial (DGP) (11,12). Ambas as afecções são raras, e na maioria dos casos o diagnóstico etiológico é desconhecido.
1.2.1.1.1. Disgenesia Gonadal Parcial
A DGP é definida pela presença de ambiguidade genital consequente a diferenciação testicular parcial em indivíduos 46,XY com ausência de quadro sindrômico e de mosaicismo cromossômico (12,19). Sua etiologia é bastante heterogênea; já foram descritas mutações nos genes SRY, WT1, NR5A1 e DMRT1, assim como em outros vários genes sabidamente participantes da diferenciação gonadal; porém, na grande maioria dos casos, a etiologia ainda é desconhecida (13,20,21).
A histologia gonadal é variável, podendo ser encontrados diferentes graus de diferenciação testicular (22,23). Os testículos disgenéticos variam desde gônadas com poucas estruturas tubulares e predominância de tecido fibroso até aquelas com anomalias leves, como redução do diâmetro tubular médio, do número de células germinativas e de células de Sertoli (23). Podem ser encontrados bilateralmente ou associados a gônadas disgenéticas (19). O grau de masculinização da genitália interna e externa depende do grau de disfunção das células embrionárias de Sertoli e Leydig; assim, o fenótipo genital pode variar de predominantemente feminino a masculino, incluindo casos de ambiguidade genital evidente (23).
Indivíduos com DGP apresentam, em geral, concentrações elevadas de gonadotrofinas hipofisárias e concentrações baixas de testosterona sem acúmulo dos seus precursores. A concentração do hormônio anti-mulleriano pode ser baixa ou indetectável, dependendo do grau da disgenesia testicular (24).
A prevalência de tumores de células germinativas é variável, de 16% a 30% (25). Um estudo retrospectivo recentemente publicado com uma amostra de 33 casos mostrou a presença de tumores em dois deles (7%). Esses indivíduos possuíam fatores adicionais para o desenvolvimento dos tumores: em um a gônada estava localizada na cavidade abdominal e o segundo era portador de uma mutação no gene WT1 (25).
1.2.1.1.2. Disgenesia Gonadal Completa
A DGC é um distúrbio raro, com frequência estimada em 1 para 20.000 (26,27),
descrito pela primeira vez por Swyer em 1955 em dois casos com reversão sexual completa (26). Essa condição é ocasionada por mutações em genes envolvidos na
gonadogênese testicular, sendo que 10% a 15% dos casos resultam de mutações no gene SRY; alguns casos são decorrentes de mutações em NR5A1 e DHH, porém a etiologia permanece desconhecida nos demais (26,28–33). Rocha e colaboradores verificaram que mutações no gene SRY estavam presentes em 70% dos casos de DGC atendidos no ambulatório do Grupo Interdisciplinar de Estudos da Determinação e Diferenciação do Sexo (GIEDDS) do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (34). Mutação no gene NR5A1 também foi identificada por esse grupo de estudo; Soardi e co-autores identificaram a mutação p.D293N em homozigose no NR5A1 em um caso de DGC sem insuficiência adrenal e sem alterações na sequência do gene SRY (35).
Indivíduos com DGC apresentam fenótipo feminino, sem ambiguidade genital, presença de derivados Mullerianos normais, gônadas disgenéticas, ausência de caracteres sexuais secundários e cariótipo normal 46,XY (11,28–31). Além dessas características, as pacientes podem apresentar risco de osteoporose pela deficiência estrogênica. A maioria apresenta estatura alta quando comparada com a altura média feminina devido à presença do cromossomo Y e ao fechamento epifisário tardio resultante dos níveis baixos dos hormônios esteroides sexuais (26,36).
O diagnóstico geralmente é feito na adolescência por ausência da puberdade e
amenorreia (28). Os achados laboratoriais mostram hipogonadismo
hipergonadotrófico: altos níveis de gonadotrofinas e baixos níveis de estradiol e testosterona. O tratamento de reposição hormonal com estrógenos e progesterona é recomendado para indução da puberdade e manutenção dos caracteres sexuais secundários (27).
As gônadas disgenéticas dessas pacientes têm risco aumentado de desenvolver tumores; estes ocorrem em 30% dos casos. Assim, é indicada gonadectomia profilática. Na ausência de tratamento hormonal, a presença de tecido mamário e (ou) sangramento genital pode ser indicativa da presença de tumor secretor de estrogênio (26,28).
Há possibilidade de gestação por meio de doação de ovócitos, fertilização in vitro e transferência de embriões para a cavidade uterina (27).
1.2.2. Investigação da etiologia genética dos Distúrbios da Diferenciação do Sexo
O cariótipo está entre os primeiros exames a serem realizados nos indivíduos com DDS com o objetivo de definir o sexo genético e detectar anomalias de cromossomos sexuais (37,38). Além da análise cromossômica, no campo da citogenética ainda pode ser utilizada a técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) em casos de mosaicismo, de rearranjos cromossômicos, como deleções e translocações, e na caracterização de cromossomos marcadores. Porém, essa abordagem possui limitações como a necessidade de uma hipótese diagnóstica e a investigação de poucos loci em um mesmo experimento (39).
Sabe-se hoje que vários genes que regulam o desenvolvimento sexual exercem efeito dose-dependente, tais como NR0B1, FGF9 (fibroblast growth factor 9), SOX3 (SRY-box 3), SOX9, WNT4, ATRX (ATRX, chromatin remodeler) e DMRT1, entre outros. Alterações na dosagem gênica podem ser detectadas pela identificação de variações do número de cópias (CNV) utilizando as técnicas de Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) e Análise Cromossômica por Microarray (ACM) (38).
MLPA é uma técnica semi-quantitativa usada para determinar o número relativo de cópias de sequências alvo (39). Em indivíduos com DDS, o uso desta técnica possibilitou nos últimos anos a identificação de deleção de dois éxons no gene NR5A1 e de duplicações envolvendo NR0B1 e SOX9 (39–41). Porém essa técnica, apesar de eficiente, possibilita apenas a identificação de alterações em sequências alvo, não realizando, portanto, uma varredura genômica.
Por sua vez, a ACM é uma tecnologia capaz de detectar deleções e duplicações submicroscópicas em todo o genoma, com resolução dependente do número de sondas presentes no microarranjo. Em indivíduos com DDS, CNV compreendendo regiões codificantes dos genes NR5A1, NR0B1, SOX9 e DMRT1 são as relatadas com maior frequência (39). Em um estudo com 116 indivíduos com DDS idiopática foram encontradas CNV com relevância clínica em 21,5% (42). Em outro estudo com 87 pacientes com disgenesia gonadal 46,XY sindrômica e não sindrômica foram identificados perdas e ganhos em 26 indivíduos (43). Na maioria dos trabalhos publicados até o momento a análise estava voltada para o estudo de regiões
codificantes. Embora mais plausível, esta vem demonstrando não ser a análise ideal, visto que no âmbito dos DDS, CNV em regiões regulatórias de genes dose-dependentes, como SOX3, SOX9, GATA4 e NR0B1, já foram descritas como causa desses distúrbios (39,44,45).
Aproximadamente 15% dos casos de DDS são causados por CNV, e essa taxa diagnóstica é maior em indivíduos que apresentam quadro sindrômico associado a disgenesia gonadal (3). Porém, apesar das vantagens apresentadas pela ACM, essa técnica não é capaz de identificar rearranjos cromossômicos balanceados, nem mosaicismo em baixa proporção celular (17)
As técnicas descritas anteriormente não identificam variantes de nucleotídeo único, cuja detecção depende de sequenciamento do DNA. A primeira técnica desenvolvida com esse propósito foi o sequenciamento de Sanger (46), que permite sequenciar fragmentos de até 900 pares de bases por vez; por esse motivo, o estudo de condições geneticamente heterogêneas por essa técnica precisa ser feito gene a gene (47,48).
Assim, com base nos achados clínicos e hormonais, a análise genética direcionada utilizando a metodologia de Sanger pode ser aplicada para a avaliação de sequência de genes específicos (37). Quando evidências bioquímicas sugerem o desequilíbrio de uma via específica, a chance de identificar uma variante em um gene relevante é alta, e por essa razão o sequenciamento de Sanger ainda é a principal ferramenta metodológica utilizada na investigação de SNV (17).
A priorização de genes na investigação diagnóstica de indivíduos com as formas não sindrômicas da disgenesia gonadal 46,XY (DGC e DGP) deve ser baseada naqueles em que mais frequentemente são encontradas variantes patogênicas, como SRY e
NR5A1. A presença de um quadro sindrômico também pode direcionar o estudo
específico de um gene, como por exemplo: o SOX9 nos casos de displasia campomélica; o WT1 na presença de nefropatias e(ou) tumor de Wilms; e GATA4 quando há anomalias cardíacas associadas (3,17,20,38). No entanto, o grande número de genes envolvidos no processo de determinação gonadal torna essa abordagem limitada na prática clínica. Além disso, quando a causa potencial do DDS não é clara ou o perfil hormonal não é específico, a abordagem gene a gene fornece um diagnóstico molecular em apenas 20% dos casos (17).
Devido ao amplo espectro fenotípico dos indivíduos com DDS, ao grande número de genes já identificados e candidatos potenciais na sua etiologia e à dificuldade na priorização de genes no sequenciamento de Sanger, as pesquisas na área têm evoluído gradualmente para o uso das novas estratégias de sequenciamento conhecidas como tecnologias de alto rendimento. Estas permitem o sequenciamento massivo e paralelo de milhares ou até milhões de fragmentos de DNA sequenciados simultaneamente, permitindo, assim, até mesmo a análise de todo o genoma (3).
Dentro das tecnologias de alto rendimento está o Sequenciamento de Segunda Geração (também conhecido como Next-Generation Sequencing - NGS) que tem como objetivo principal a identificação de variantes na sequência de DNA (48,49). Esta tecnologia permite ainda, a detecção de SV, definidas como variações no genoma com tamanho superior a 50 nucleotídeos que incluem deleções, duplicações, inversões, inserções e translocações (balanceadas ou desbalanceadas) a partir da análise dos dados com algoritmos específicos, além da identificação de deleções e inserções menores (Indels) (49,50).
Existem três abordagens de NGS: o painel gênico, o sequenciamento do exoma (whole exome sequencing - WES) e o sequenciamento do genoma (whole genome
sequencing – WGS).
O painel gênico consiste no sequenciamento de genes alvos selecionados devido ao conhecimento prévio de seu envolvimento em determinada condição. Assim, o sequenciamento de vários genes pode ser feito em um único experimento (17), e a eficiência desse tipo de abordagem vem sendo demonstrada por diversos trabalhos. Um estudo publicado recentemente com uma casuística de 278 indivíduos com DDS 46,XY e 48 com DDS 46,XX em que foi aplicada uma investigação direcionada para 64 genes associados a DDS e 967 genes candidatos chegou a um provável diagnóstico genético em 43% dos indivíduos XY e 17% dos XX (51). Özen e colaboradores obtiveram uma taxa diagnóstica de 45% em 20 indivíduos com DDS 46,XY utilizando um painel gênico com 56 genes sabidamente associados a esse grupo de condições. Além disso, esses autores demonstraram que essa abordagem é tempo-efetiva, diminuindo o período de diagnóstico para três dias, e também custo-efetiva, com custo quase três vezes menor que o método convencional de Sanger (52).
Por sua vez, Kim e co-autores aplicaram um painel com 67 genes associados a DDS em humanos a uma casuística de 37 pacientes com DDS 46,XY e sete com DDS 46,XX, sendo obtido o diagnóstico genético em 29,5% dos casos (53). Por último, Fan e colaboradores demonstraram a superioridade do painel gênico quando comparado à abordagem de gene único no centro diagnóstico onde esses autores atuam (28% versus 10%). Salientaram ainda que a taxa de detecção quando se utiliza o sequenciamento gene a gene é influenciada pela seleção do gene alvo, que é limitada pelo conhecimento e experiência dos clínicos com cada condição genética (54).
Apesar da eficiência da abordagem demonstrada por diversos trabalhos, mais de metade dos casos de DDS ainda continuam sem um diagnóstico molecular em todos os trabalhos descritos anteriormente. Isso pode ser consequência da investigação focada em genes previamente associados à determinação gonadal, não possibilitando, assim, a descoberta de novos genes (52) nem a análise de regiões não codificantes; pode ainda ser decorrente da ausência de análise de SV. O número determinado de genes investigados nos painéis representa uma limitação para condições com compreensão genética incompleta, como DDS, que necessitam de abordagens que possibilitem novas correlações genótipo/fenótipo (3).
Essas limitações podem ser superadas, em parte, pelo uso do sequenciamento do exoma, que possibilita obter informações de todas as regiões codificantes do genoma, com o potencial de levar à descoberta de novos genes associados aos DDS. Visto que todos os éxons estão sequenciados, os dados podem ser reanalisados facilmente quando novos genes são reportados na literatura, uma prática que acarreta em aumento da taxa diagnóstica (3).
Baxter et al. (2015) aplicaram o sequenciamento do exoma a 40 indivíduos com DDS 46,XY. Para a análise, os autores partiram de uma lista de genes cujas mutações haviam sido relatadas em pelo menos um caso de DDS. Foram identificadas em 22,5% dos casos variantes patogênicas, em 12,5% variantes provavelmente patogênicas e em 15% dos casos variantes de significado clínico incerto (55).
Além disso, o uso do exoma em casos de DDS possibilitou a identificação de uma potencial herança oligogênica em casos de mutações em heterozigose no gene NR5A1 (56,57); de duas variantes no gene ZNRF3 (zinc and ring finger 3) em indivíduos com DDS 46,XY (58); de mutações de mudança de matriz de leitura no gene NR2F2 (nuclear
receptor subfamily 2 group F member 2) em três pacientes 46,XX com DDS sindrômico
(59); de mutações no gene ESR2 (estrogen receptor 2), sendo uma variante em homozigose em um indivíduo com DDS 46,XY sindrômico e duas variantes missense em heterozigose em dois indivíduos com a forma não sindrômica de DDS 46,XY (60); de mutações no gene FOG2 (ZFPM2 - zinc finger protein, FOG family member 2) em dois pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (61); de mutações em heterozigose composta no gene FLNB (filamin B) em um indivíduo 46,XY com displasia esquelética e disgenesia gonadal (62); de uma mutação em homozigose no gene FANCA (FA complementation
group A) em um indivíduo 46,XY com microcefalia e disgenesia gonadal (63); de uma
mutação no gene ANOS1 (anosmin 1) em dois irmãos gêmeos com fenótipo de síndrome de Kallmann (64); de uma mutação em homozigose no gene DHH em duas pacientes 46,XY com fenótipo feminino, filhas de casal consanguíneo e diagnosticadas com DGP (65); e de uma mutação em homozigose no gene SPIDR (scaffold protein involved in DNA
repair) em duas filhas de um casal consanguíneo diagnosticadas com falência ovariana
primária (primary ovarian insufficiency, POI) (66).
Além disso, o sequenciamento do exoma permite a detecção de SV, o que já foi demonstrado em um estudo com 2603 indivíduos com diferentes condições genéticas, incluindo 38 com DDS. Foram identificadas 123 SV clinicamente relevantes, mas nenhuma delas na amostra de indivíduos com DDS, o que pode ter sido ocasionado pela análise focada em regiões codificantes (39,67). A aplicação dos dados de WES na detecção da monossomia do cromossomo X foi também demonstrada em 27 casos de síndrome de Turner (68).
Apesar dos inúmeros benefícios dessa técnica, o sequenciamento do exoma ainda possui limitações que incluem cobertura incompleta dos genes, variabilidade das plataformas, dificuldade na interpretação das variantes e questões éticas relacionadas a achados incidentais (3). Em relação à detecção de SV, essa abordagem não permite precisão na identificação de pontos de quebra e não avalia a presença de variações do número de cópias em regiões não codificantes (39).
Assim, apesar do avanço representado pelo sequenciamento do exoma, sua implementação só permitiu chegar a um diagnóstico molecular conclusivo em diferentes condições genéticas em cerca de 30% dos casos. Sugere-se que isso seja
decorrente da análise direcionada às regiões codificantes do DNA, que representam uma parcela muito pequena no genoma completo (3).
O sequenciamento do genoma permite a identificação de SNV e Indels não apenas nas regiões codificantes, mas em todo o genoma. Para essa abordagem não se utiliza a captura de regiões alvo; em consequência disso, resultados de WGS mostram maior uniformidade na profundidade das sequências de leitura em todo o genoma e melhores parâmetros de qualidade em relação ao sequenciamento do exoma. Sua maior limitação encontra-se na difícil tarefa de identificar variantes deletérias relevantes entre os milhões de variantes encontradas em cada genoma, sendo drasticamente limitada pela nossa incapacidade atual para interpretar a patogenicidade da maioria das variantes (3).
No âmbito dos DDS, o sequenciamento do genoma foi realizado em um caso de DGC inicialmente diagnosticado como síndrome da insensibilidade androgênica; esse diagnóstico foi posteriormente questionado devido à presença de derivados Mullerianos. O sequenciamento do genoma mostrou a presença de uma variante provavelmente patogênica no gene SRY (NM_003140.2, p.Arg130Pro, c.389G > C) (32). A detecção de SV a partir de dados de WGS pode ser alcançada utilizando diferentes estratégias de bioinformática (depth of coverage, discordant sequence read
pair, split-read, assembly-based methods) ou uma combinação dessas estratégias. Estas
são complementares e específicas para os diferentes tipos e tamanhos de SV; variam também em relação à acurácia na definição do ponto de quebra (3,69,70).
Frente ao resultado de todos os estudos mencionados anteriormente, uma pergunta ainda precisa ser respondida: por que mais de 50% dos indivíduos com DDS ainda permanecem sem um diagnóstico molecular? A resposta pode estar em outros genes envolvidos nessas condições, porém ainda não descobertos; na presença de SV que não são facilmente detectadas por tecnologias de NGS ou pelos métodos de bioinformática; na ocorrência de alterações somáticas em processos essenciais durante o início da vida embrionária, afetando o desenvolvimento de um órgão, e que só podem ser identificados quando o tecido específico é analisado; ou ainda em fatores epigenéticos ou ambientais que podem influenciar o desenvolvimento gonadal, isoladamente ou em combinação com eventos genéticos raros.
2. Justificativa
O grande desafio perante indivíduos com DDS, particularmente os com DDG, é chegar a um diagnóstico etiológico preciso. Porém, na maioria dos casos o diagnóstico molecular permanece indefinido. A DGP e a DGC são condições raras incluídas no grupo dos DDS 46,XY que geralmente se apresentam como casos isolados nas famílias, dificultando a busca de mutações envolvidas na sua etiologia. Somado a esse fato, o grande número de genes envolvidos no processo do desenvolvimento gonadal torna o sequenciamento gene a gene uma tarefa trabalhosa e complicada, devido ao custo e tempo dispendidos. Assim, painéis gênicos e sequenciamento do exoma têm se mostrado mais apropriados para a busca de variantes deletérias nesses casos. Além disso, possibilitam a identificação de herança oligogênica e, no caso do sequenciamento do exoma, a descoberta de novos genes envolvidos na diferenciação testicular, a reanálise dos dados após a descoberta de novos genes e o uso de um único experimento para a análise de toda a região codificante. Justifica-se, assim, a escolha dessas técnicas na tentativa de aprimorar o diagnóstico etiológico de duas condições em que grande número de indivíduos não recebem um diagnóstico molecular preciso, o que inviabiliza um aconselhamento genético adequado e dificulta o estabelecimento do prognóstico individual.
3. Objetivos
3.1. Geral
Aprimorar o diagnóstico etiológico e o aconselhamento genético dos distúrbios da diferenciação gonadal 46,XY.
3.2. Específicos
Identificar variantes genômicas deletérias em indivíduos com disgenesia gonadal parcial e disgenesia gonadal completa de etiologia desconhecida.
4. Métodos
4.1. Obtenção da Casuística
A casuística foi composta por 14 indivíduos com DGP e DGC de etiologia indefinida que ainda estavam em acompanhamento no ambulatório do GIEDDS e de Endocrinologia Pediátrica do Hospital de Clínicas da UNICAMP no período do desenvolvimento do trabalho.
A casuística de DGP teve como critérios de inclusão: genitália externa ambígua (hipospadia associada ou não a criptorquidia; criptorquidia bilateral sem hipospadia); cariótipo 46,XY; e mosaicismo afastado com alto grau de probabilidade (cariótipo com 50 células analisadas e(ou) FISH). Em relação ao estudo histológico das gônadas, os critérios de inclusão foram:
- gônada disgenética associada a testículo disgenético; - dois testículos disgenéticos; ou
- ao menos uma gônada disgenética ou testículo disgenético associado a gônada contralateral com laudo histológico de "testículo pré-puberal" (sem disgenesia evidente ao exame histológico convencional, sem exames morfométricos) ou não biopsiada durante o ato cirúrgico por apresentar características macroscópicas de testículo normal.
Para os indivíduos com DGC, os critérios de inclusão foram: genitais internos e
externos femininos, duas gônadas disgenéticas e(ou) hipogonadismo
hipergonadotrófico e cariótipo 46,XY sem mosaicismo com linhagem 45,X.
Tanto nesses casos quanto nos de DGP foram critérios de exclusão a presença de quadro sindrômico associado a DDS e o encontro de mutações que explicassem o quadro clínico dos pacientes nos genes SRY, NR5A1 e WT1, analisados em estudos anteriores do grupo de pesquisa onde este trabalho foi desenvolvido.
Sempre que possível ambos ou ao menos um dos genitores foram convidados a participar desse estudo. Foi obtido material para extração de DNA dos genitores que concordaram em participar da pesquisa para avaliação da presença ou ausência das possíveis variantes deletérias encontradas nos probandos.
Os indivíduos selecionados para a casuística foram subdivididos em dois grupos de acordo com a técnica utilizada para a busca de variantes. No Grupo I foram incluídos oito indivíduos com DGP para os quais foi realizado o sequenciamento do exoma, e no Grupo II seis indivíduos investigados por meio do painel gênico, sendo dois com DGP e quatro com DGC (Tabela 02).
A tecnologia empregada para o Grupo I foi definida pela disponibilidade de suporte financeiro fornecido pela aprovação do projeto pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Para o Grupo II, a tecnologia empregada estabeleceu-se diante da oportunidade de colaboração com o grupo de pesquisa do Profº. Dr. Olaf Hiort (Universidade de Lübeck, Alemanha) durante o doutorado sanduíche da aluna.
Tabela 02: Indivíduos da casuística subdivididos em dois grupos de acordo com a
tecnologia utilizada para a investigação das variantes.
Indivíduos Diagnóstico Tecnologia empregada Grupo
1 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
2 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
3 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
4 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
5 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
6 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
7 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
8 DGP Sequenciamento do exoma Grupo I
9 DGP Painel gênico Grupo II
10 DGP Painel gênico Grupo II
11 DGC Painel gênico Grupo II
12 DGC Painel gênico Grupo II
13 DGC Painel gênico Grupo II
14 DGC Painel gênico Grupo II
DGP: Disgenesia Gonadal Parcial; DGC: Disgenesia Gonadal Completa.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM-UNICAMP) conforme o parecer CAAE 24972513.5.0000.5404. O
termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) foi assinado por todos os indivíduos e (ou) genitores que aceitaram participar do estudo antes que os procedimentos de investigação fossem iniciados.
4.2. Estudos moleculares
Em parte da casuística (casos de DGP com disponibilidade de estudo de um ou ambos os genitores) foi realizado sequenciamento do exoma; nos demais, a busca de variantes foi feita por meio de painel gênico. Em um dos casos os achados iniciais exigiram complementação do estudo por meio de ACM e sequenciamento do genoma.
4.2.1. Extração de DNA genômico
As amostras de DNA genômico foram obtidas a partir de 10 a 15 mL de sangue periférico depositado em tubos cônicos contendo 1 mL do anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético 2H20 (EDTA) 0,5 M pH 8,0, após coleta venosa. Para
obtenção do DNA genômico foi empregado o método de lise com Proteinase K (Boehringer Mannhein, Alemanha) seguida de extração com fenol-clorofórmio proposto por Araújo, em 1996 (71) e padronizado no laboratório de Genética Molecular Humana – Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), seguindo as etapas abaixo:
I. As hemácias foram lisadas adicionando solução A (Tabela 03),
permanecendo o homogeneizado no gelo por 30 minutos. Após esse período, o homogeneizado foi centrifugado, o sobrenadante foi descartado e o precipitado (pellet) ressuspendido em 20 mL de solução A; repetiu-se esta etapa até o pellet ficar livre de hemácias lisadas. O pellet, então, foi ressuspendido em solução B (Tabela 03) e acrescentou-se 250 μL de solução C (Tabela 03) recém-preparada, contendo proteinase K. Essa solução final permaneceu incubada a 37°C overnight.
II. Para extração de DNA dos leucócitos foram adicionados 1,25 mL de TE 1x
(Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0) e igual volume de fenol saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0, homogeneizando a mistura por inversão lenta
do tubo. Em seguida, o tubo foi centrifugado. Acrescentou-se à fase aquosa igual volume de fenol saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0. O tubo foi levemente agitado por 5 minutos e novamente centrifugado. O procedimento foi repetido com solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, v:v:v) e por último clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v:v).
III. Para precipitação do DNA acrescentou-se 0,1 volume de acetato de sódio 3
M pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. O DNA precipitado foi recuperado com auxílio de uma haste de plástico esterilizada e lavado com etanol 70%, antes de ser ressuspendido em TE 1x (200 a 500 μl).
Tabela 03: Soluções utilizadas na extração de DNA genômico.
Solução A Conc. Final Solução B (estoque 2x) Conc. Final Solução C Conc. Final MgCl2 5 mM Na2EDTA 20 mM Solução B 0,5x Sacarose 0,32 M NaCl 20 mM SDS 5%
Tris-HCl pH 8,0 10 mM Tris-HCl pH 8,0 20 mM Proteinase K 1 mg/Ml
Triton X-100 1%
Conc.= concentração; MgCl2: Cloreto de magnésio; NaCl: Cloreto de sódio; SDS: dodecil sulfato de sódio; Na2EDTA: etilenodiaminotetracético dissódico; Tris-HCl: Tris hidrocloreto.
4.2.1.1. Análise da qualidade do DNA genômico
A quantificação e os parâmetros de qualidade do DNA extraído foram obtidos por leitura de absorbância óptica a 260 ηm em espectrofotômetro Nanodrop 8000
Spectrophotometer (Thermo Scientific). Como amostra referência (branco) foi utilizado
TE 1x para calibrar o aparelho. A integridade do DNA genômico foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8% (Invitrogen, EUA) em Tris-borato EDTA 1x (TBE). O gel foi visualizado em transluminador de luz ultravioleta e fotografado, utilizando uma câmera digital acoplada a um computador (Kodak Electrophoresis Documentation and
4.2.2. Sequenciamento do exoma
O sequenciamento do exoma foi empregado para investigação de variantes deletérias em oito indivíduos com DGP incluídos no Grupo I. Os experimentos foram realizados pela empresa Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd., Hong Kong, China. A construção das bibliotecas e o seu posterior sequenciamento seguiram os protocolos recomendados pelos fabricantes. O processo compreendeu as etapas descritas resumidamente a seguir:
I. Checagem da amostra de DNA - A integridade da amostra de DNA genômico
foi avaliada novamente em gel de agarose 1%. A pureza do DNA foi verificada utilizando o espectrofotômetro NanoPhotometer® (IMPLEN, CA, USA) e a concentração foi mensurada utilizando o kit Qubit® DNA Assay no equipamento Qubit® 2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA).
II. Construção das bibliotecas – As bibliotecas foram construídas utilizando 1 µg
de DNA genômico e o kit Agilent SureSelect Human All Exon (Agilent
Technologies, CA, USA), versão V5 e V6, seguindo as seguintes etapas:
a. Fragmentação genômica - A fragmentação mecânica do DNA genômico foi realizada no equipamento Covaris (Massachusetts, EUA), resultando em fragmentos com tamanho variando de 180-280 pb.
b. Reparo das extremidades - As extremidades dos fragmentos foram reparadas pela atividade das enzimas éxonuclease / polimerase. As extremidades 3´ sofreram adenilação, o que facilitou a ligação dos adaptadores na próxima etapa.
c. Ligação dos adaptadores e amplificação - Oligonucleotídeos adaptadores foram ligados a cada extremidade dos fragmentos. Estes foram seletivamente enriquecidos em uma reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR).
d. Hibridação - Após a reação de PCR, sondas biotiniladas foram hibridadas aos fragmentos em fase líquida.
e. Captura - Esferas magnéticas (beads) associadas a estreptavidina foram usadas para a captura dos fragmentos hibridados na fase anterior. A
estreptavidina se ligou à biotina das sondas hibridadas para capturar os 334.378 éxons em 20.965 genes.
f. Indexação - As bibliotecas capturadas foram enriquecidas em uma reação de PCR para a adição de etiquetas denominadas Index.
g. Os produtos foram purificados usando o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA) e quantificados utilizando o kit Agilent high
sensitivity DNA no equipamento Agilent Bioanalyzer 2100.
h. Clusters das bibliotecas: O agrupamento das bibliotecas codificadas com diferentes indexes foi realizado em um Sistema de Geração de Clusters usando o kit TruSeq PE Cluster v4-cBot-HS (Illumina, San Diego, USA). Após a geração do cluster, as preparações foram sequenciadas em uma plataforma Illumina e foram geradas sequências de leitura (reads)
paired-end de 125 pb.
Na Figura 02 estão ilustradas as etapas realizadas para a construção das bibliotecas.
4.2.2.1. Processamento dos arquivos brutos para a chamada de variantes
A empresa Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd. também foi responsável pelo processamento dos dados brutos obtidos após o sequenciamento. Esse processamento foi necessário para a chamada de variantes e foi realizado com o auxílio de ferramentas de bioinformática.
As imagens de fluorescência originais obtidas a partir da plataforma de sequenciamento Illumina foram transformadas em sequências de leitura curtas (reads). O arquivo resultante dessa transformação, denominado “dados brutos”, foi registrado no formato FASTQ, que contém informações das reads e da qualidade de sequenciamento das mesmas.
O alinhamento dos dados brutos (FASTQ) ao genoma de referência humano (GRCh37/hg19) utilizando o software Burrows-Wheeler Alinhador (BWA) (72) resultou em um arquivo BAM (Binary Alignment Map) inicial. O arquivo BAM final foi obtido pelo processamento utilizando as ferramentas SAMtools e PICARD. Os cálculos da cobertura e da profundidade foram realizados com base no arquivo BAM final.
A ferramenta ANNOVAR foi utilizada para anotação das SNV e Indels, incluindo informações de bases de dados. Ao final, foram disponibilizados os arquivos FASTQ, BAM, BAI, VCF e tabelas de excel com as variantes de cada indivíduo.
4.2.2.2. Análise das variantes detectadas
As análises realizadas compreenderam quatro diferentes abordagens com o objetivo de identificar o maior número de possíveis variantes deletérias que pudessem ser associadas com o fenótipo dos pacientes. Nas análises foi utilizado o DNA de quatro homens férteis como controles masculinos normais.
Primeira abordagem: Compreendeu a busca de variantes possivelmente
deletérias na sequência de 94 genes, incluindo aqueles sabidamente relacionados com a diferenciação gonadal, tanto ovariana como testicular, e também genes candidatos decorrentes de investigações funcionais em humanos e modelos animais. Os 94 genes
