Resultados da análise complementar para o Indivíduo 9

5.2.3.1. Análise cromossômica por microarray

Após o encontro de duplicação de duas sondas do gene CXorf21 em Xp21.2 e picos normais para as sondas do gene NR0B1 e dos outros genes, surgiu a suspeita de que o quadro clínico do indivíduo 9 poderia ser decorrente de uma variação do número de cópias e não de uma mutação deletéria.

O uso do aGH CytoScan Chip 750K da Affymetrix possibilitou a detecção de um ganho de aproximadamente 277 kb em Xp21.2 [30,580,693-30,857,187] [arr[GRCh37] Xp21.2(30580693_30857187)x2] (Figura 06). A duplicação possui uma cobertura de 165 marcadores. Nenhuma duplicação de tamanho semelhante foi encontrada na base de dados de indivíduos não afetados e no grupo controle da FCM - UNICAMP. As análises do ensaio da mãe revelaram uma duplicação de tamanho semelhante de aproximadamente 295 kb em Xp21.2 [30,561,337-30,857,187], mostrando que a duplicação encontrada na paciente é de herança materna.

Figura 06: Gráfico das sondas de número de cópias do ensaio de aGH mostrando uma duplicação em

Xp21.2 [30,580,693-30,857,187].

Os pontos de quebra detectados pelo aGH mostraram duplicação parcial dos genes CXor21 e TAB3 e duplicação completa do gene GK. No entanto, devido à resolução do microarranjo utilizado, a definição dos pontos de quebra não foi precisa; a distância entre as sondas normais e as sondas duplicadas nos pontos de quebra foram de 15.217kb na região do gene CXor21 e de 7.977 kb na região do gene TAB3. Além disso, essa técnica não possibilitou identificar a orientação da duplicação no genoma da paciente. Assim, o sequenciamento do genoma foi realizado para refinamento dos pontos de quebra e caracterização da duplicação.

5.2.3.2. Sequenciamento do genoma

A análise de SNV e indels a partir da extração das sequências exônicas mostrou o mesmo resultado detectado pelo sequenciamento do painel gênico. Apenas as variantes no gene STAR e POR foram consideradas relevantes.

A pesquisa de SV no genoma utilizando os dados do WGS detectaram uma duplicação de 297,5 kb, mostrando as sequências dos genes CXorf21 e GK completamente duplicadas e um ponto de quebra dentro da sequência do gene TAB3, causando uma duplicação parcial desse gene.

Para definição dos pontos de quebra foi realizada uma varredura no programa

IGV guiada pelos pontos de quebra detectados pelo ACM. Foi visualizada uma pequena

alteração da profundidade na posição genômica chrX:30561644. A suspeita dessa localização ser o início da duplicação foi reforçada pelo fato de várias reads que terminaram neste ponto terem seus pares aproximadamente a 300kb de distância, sendo este o tamanho aproximado da duplicação identificada pela ACM. Na localização chrX: 30859140 foi também encontrada uma alteração da profundidade das reads, além de algumas reads se encerrarem nesse local, alterações essas similares às encontradas no primeiro ponto (Figura 07).

Figura 07: Visualização no IGV da região em que se suspeitava estarem localizados os pontos de quebra

da duplicação.

A ilustração mostra reads vermelhas se encerrando em dois pontos diferentes em Xp21.2. A: ilustra o ponto de quebra em chrX:30561644. B: mostra o ponto de quebra em chrX:30859140.

As sequências das reads extraídas do IGV nos pontos de quebra (30561644 e 30859140) foram usadas para construir um modelo dos pontos de quebra da duplicação que foi sequenciado por Sanger. Os resultados do sequenciamento indicaram uma duplicação em tandem dos genes CXorf21 e GK em orientação direta, inserida no intron 6 (Ensembl genome browser 94 - GRCh37) do gene TAB3 após uma inserção de 27pb. A duplicação possui 297.5 kb em extensão e pontos de quebra em Xp21.2:30561644_30859140 (Figura 08).

Figura 08: Mapeamento da duplicação em Xp21.2.

A: Visão geral da variação estrutural upstream ao gene NR0B1 e sua orientação dentro da região Xp21.2.

As setas descrevem os genes e suas respectivas direções de transcrição. O segmento cromossômico é desenhado com o braço distal do cromossomo à esquerda e o centrômero à direita. As distâncias entre os genes não estão em escala. A região chrX:30561644-30859140 está duplicada em tandem, conforme indicado pelo segmento sombreado em azul. * mostra uma inserção de 27 pb no ponto de quebra. B: Posição das reads pareadas extraídas e alinhadas do sequenciamento do genoma cruzando o ponto de quebra (chrX: 30859140). Setas coloridas de direção oposta pertencem ao mesmo par de reads. Os pares de reads foram mapeados a ≈ 297,5 kb de distância um do outro. C: Verificação da sequência do ponto de quebra por PCR e sequenciamento de Sanger. O eletroferograma mostra uma sequência contígua do gene

TAB3 ao ponto de quebra (laranja), uma sequência de inserção de 27 pb (vermelho) e a sequência downstream ao CXorf21 no início da duplicação (azul).

Dentro da região cromossômica Xp21.2 foi definida uma região de 160 kb sensível a dosagem. Quando duplicada, esta região causa disgenesia gonadal em indivíduos 46,XY, sendo o gene NR0B1 considerado o gene candidato responsável por esse fenótipo quando superexpresso. A duplicação identificada no indivíduo 9 não inclui o gene NR0B1. No entanto, nenhuma duplicação isolada do gene foi relatada até o

momento. Todas as duplicações descritas incluem os genes comprometidos pela duplicação do indivíduo 9 (Figura 09-A). Assim, sugerimos três hipóteses para a causa do fenótipo da paciente: a) a duplicação compromete os elementos regulatórios cis que controlam o padrão de expressão espaço temporal do gene NR0B1, ocasionando um aumento da expressão da proteína DAX1; b) GK e CXorf21 podem exercer um efeito de dose quando duplicados; ou c) o efeito patogênico pode ser resultado da combinação de todos esses fatores (40).

Análises in silico da duplicação utilizando o recurso online UCSC Genome Browser demonstrou a presença de potenciais elementos regulatórios na região duplicada (Figura 09). Essas regiões regulatórias podem controlar a expressão de NR0B1 ou outros genes associados com a diferenciação gonadal. Assim, a duplicação identificada pode ter resultado em alteração da sequência regulatória desses elementos, que por sua vez comprometeram a expressão do gene NR0B1. A quebra do gene TAB3 pela duplicação pode ter movido um elemento inibidor para uma distância maior, impossibilitando esse elemento de exercer sua atividade no promotor do gene NR0B1. Outra hipótese mais provável é a presença de um elemento ativador (enhancer) localizado em chrX:30,561,644-30,859,140, cuja duplicação possa ter resultado no aumento da ativação do promotor do NR0B1. Essa hipótese foi demonstrada para o gene SOX9 resultando em DDS 46,XX ovotesticular (46,XX OT-DSD) (121,122). Outros rearranjos envolvendo regiões regulatórias já foram descritas em casos de DDS envolvendo os genes SOX10 e SOX3 (123–125).

Até o momento, somente uma variação estrutural na região upstream do gene

NR0B1 foi associada com DDS 46,XY, sendo esta uma deleção de ≈250 kb upstream ao

gene em um indivíduo 46,XY com reversão sexual. Os autores propuseram que a perda de elementos regulatórios pode ter resultado em aumento da expressão da proteína DAX1. Uma região minima comum entre a duplicação encontrada por esse grupo e a duplicação descrita neste trabalho foi detectada. Essa região comum possui elementos regulatórios que podem ter sido responsáveis pela alteração do desenvolvimento sexual nos dois casos (44). Além disso, foi relatada uma deleção de 80 kb em Xp21.2 removendo elementos regulatórios e também o gene NR0B1 em um indivíduo com DDS 46,XX ovotesticular isolado (Figura 09-B) (126).

Figura 09: Representação esquemática comparando a duplicação identificada no indivíduo 9 com as variações de número de cópias previamente descritas na literatura em Xp21.2.

A representação gráfica do UCSC da região duplicada mostra a presença de potenciais elementos reguladores e sequências conservadas. A: Comparação entre as duplicações descritas em Xp21.2, mostrando uma região de sobreposição que envolve os genes CXorf21, GK e TAB3. B: A barra azul representa o caso descrito neste estudo e as barras vermelhas representam deleções previamente relatadas por outros trabalhos. Uma região comum foi identificada entre a duplicação presente no indivíduo 9 e a região deletada publicada por Smyk et al. (2007), que também contém seqüências regulatórias. Representação extraída do recurso online UCSC Genome Browser on Human Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly.

Em relação aos dois genes duplicados: GK é uma enzima do metabolismo do glicerol; deleções e mutações nesse gene causam deficiência de glicerol quinase (8). Nenhuma duplicação desse gene foi descrita até o momento, portanto o efeito isolado do aumento da expressão desse gene é desconhecido. Por sua vez, a proteína expressa pelo gene CXorf21 tem função desconhecida (40). Essa proteína não é expressa nos testículos, mas está presente nos epidídimos, próstata e vesícula seminal (The Human

Protein Atlas) (43,127). Nenhuma outra informação sobre esse gene foi encontrada na

literatura.

Que seja de nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de uma duplicação em Xp21.2 com ausência de NR0B1 resultando em disgenesia gonadal. O relato deste caso já foi encaminhado para publicação.