Sequenciamento do painel gênico

A tecnologia de sequenciamento dos genes alvos foi empregada para a investigação de variantes deletérias no Grupo II, composto por quatro indivíduos com DGC e dois com DGP. Essa técnica foi empregada pela aluna no laboratório do Departamento de Pediatria e Medicina do Adolescente, na Universidade de Lübeck, Lübeck, Alemanha.

O painel gênico AmpliSeq 46,XY Next Generation Sequencing, desenvolvido pelo grupo de pesquisa liderado pelo Dr. Olaf Hiort na Universidade de Lübeck, foi customizado com o auxílio da ferramenta Designer AmpliSeq para a captura de 83 regiões alvo, utilizando dois pools de primers e gerando cerca de 600 amplicons diferentes por biblioteca (1200 / indivíduo). O design desse painel foi baseado em genes com mutações já descritas na literatura em indivíduos com DDS 46,XY e genes candidatos decorrentes de investigações funcionais em humanos e modelos animais. Na Tabela 05 estão descritos os genes enriquecidos nesse painel.

O preparo das bibliotecas e o sequenciamento seguiram os protocolos recomendados pelos fabricantes, seguindo as etapas descritas resumidamente abaixo:

I. Amplificação das regiões alvo – Uma primeira reação foi preparada

utilizando 10 ηg de DNA e o reagente 5× Ion AmpliSeqTM _{HiFi Mix para}

cada pool de primers. A amplificação das regiões alvo resultou em 611

amplicons para o pool 1 e 594 amplicons para o pool 2.

II. Digestão parcial dos amplicons - A enzima FuPa Reagent foi usada para

digestão parcial dos amplicons em uma reação de três etapas a temperaturas de 50°C, 55°C e 60°C.

III. Ligação dos adaptadores – Como foram sequenciadas sete bibliotecas em

um único ensaio, uma combinação de barcodes foi realizada para as amostras. Para cada barcode selecionado foi preparado um mix de adaptador Ion P1 e Ion Xpress ™ Barcode.

IV. Purificação da biblioteca – A purificação dos fragmentos ligados foi

realizada utilizando beads AMPureTM_XP.

V. Uniformização da concentração das bibliotecas - O kit Ion Library

para ≈100 ρM. Para isso, a biblioteca foi amplificada utilizando o kit Ion

AmpliSeq™, os fragmentos foram capturados usando as beads Equalizer™

e, posteriormente, a biblioteca foi eluída para ≈100 ρM. Após esses processos, prosseguiu-se diretamente para a combinação de bibliotecas. Foram combinadas 4 bibliotecas para cada chip para garantir uma boa cobertura e profundidade das regiões alvo.

VI. Sequenciamento: as bibliotecas foram sequenciadas utilizando o

equipamento Ion Torrent PGM (Personal Genome Machine).

A Figura 04 ilustra as etapas da construção da biblioteca para o sequenciamento do painel gênico.

Figura 04: Etapas da construção da biblioteca para o sequenciamento do painel gênico.

As sequências obtidas foram alinhadas contra o genoma de referência humano versão GRCh37/hg19 utilizando o programa Ion Torrent Suite; o mesmo programa também foi utilizado para a chamada de variantes.

Tabela 05: Genes incluídos no painel gênico.

Genes Nome Genes Nome

AKR1C2 aldo-keto reductase family 1, member C2 GSTM1 glutathione S-transferase mu 1 AKR1C4 aldo-keto reductase family 1 member C4 GSTT1 glutathione S-transferase theta 1

AMH anti-Mullerian hormone HOXA4 homeobox A4 AMHR2 anti-Mullerian hormone receptor type 2 HOXA13 homeobox A13

AR androgen receptor HSD17B3 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 3 ARX aristaless related homeobox HSD17B4 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 4 ATF3 activating transcription factor 3 HSD3B2 hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and

steroid delta-isomerase 2 ATRX alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked INSL3 insulin-like 3

BMP4 bone morphogenetic protein 4 KDM3A KDM3A lysine (K)-specific demethylase 3A BMP7 bone morphogenetic protein 7 KISS1 KiSS-1 metastasis-suppressor BNC2 basonuclin 2 KISS1R KISS1 receptor CBX2 chromobox homolog 2 LHB luteinizing hormone beta polypeptide CHD7 chromodomain helicase DNA binding protein 7 LHCGR luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor CTGF connective tissue growth factor LHX1 LIM homeobox 1

CYB5A cytochrome b5 type A (microsomal) LHX9 LIM homeobox 9 CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa LMO4 LIM domain only 4

CYB5A cytochrome b5 type A MAMLD1 mastermind-like domain containing 1 CYP11A1 cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1 MAP3K1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, E3 _{ubiquitin protein ligase} CYP17A1 cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1 MID1 midline 1

CYP1A1 cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1 NR0B1

(DAX1) nuclear receptor subfamily 0, group B, member 1 CYP11B1 cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 1 NR5A1 (SF1) nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1 CYP19A1 cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1 PBX1 PBX homeobox 1

CYP21A2 cytochrome P450, family 21, subfamily A, polypeptide 2 POR cytochrome p450 oxidoreductase CYR61 cysteine rich angiogenic inducer 61 PROK2 prokineticin 2 DGKK diacylglycerol kinase kappa PROKR2 prokineticin receptor 2 DHCR7 7-dehydrocholesterol reductase PROP1 PROP paired-like homeobox 1

DHH Deserthedgehog PSMC3IP PSMC3 interacting protein DMRT1 doublesex and mab-3 related transcription factor 1 RSPO1 R-spondin 1 DMRT2 doublesex and mab-3 related transcription factor 2 SIX1 SIX homeobox1

EGF epidermal growth factor SIX4 SIX homeobox4 EMX2 empty spiracles homeobox 2 SOX3 SRY (sex determining region Y)-box 3 EPHB2 EPH receptor B2 SOX8 SRY (sex determining region Y)-box 8 ESR1 estrogen receptor 1 SOX9 sex determining region Y - box 9 ESR2 estrogen receptor 2 SRD5A2 steroid 5 alpha-reductase 2 FGF8 fibroblast growth factor 8 SRY sex determining region on the Y chromosome

Genes Nome Genes Nome

FGF9 fibroblast growth factor 9 STAR steroidogenic acute regulatory protein FGFR1 fibroblast growth factor receptor 1 [Homo sapiens TAC3 tachykinin 3

FGFR2 fibroblast growth factor receptor 2 TACR3 tachykinin receptor 3 FKBP4 FK506 binding protein 4 TSPYL1 TSPY-like 1 FOXF2 forkhead box F2 TUBB3 tubulin, beta 3 class III FOXL2 forkhead box L2 WDR11 WD repeat domain 11 FSHB follicle stimulating hormone beta subunit WDR5 WD repeat domain 5 FSHR folliclestimulatinghormone receptor WT1 Wilms tumor 1 GADD45G growth arrest and DNA damage inducible gamma WTAP WT1 associated protein

GATA4 GATA bindingprotein4 WTIP WT1 interacting protein

GNRH1 gonadotropin releasing hormone 1 WNT4 wingless-type MMTV integration site family, member 4 GNRHR gonadotropin-releasing hormone receptor

4.2.3.1. Análise das variantes

Para a análise das variantes detectadas pelo painel gênico foi estipulada uma frequência populacional máxima de 0,01; portanto, variantes com frequência superior foram excluídas. Apenas variantes exônicas foram avaliadas. Esses dois filtros reduziram consideravelmente o número de variantes por indivíduo e por isso não foi adicionado nenhum outro filtro à análise. Variantes consideradas deletérias por pelo menos duas ferramentas de predição foram selecionadas para posterior validação. A cobertura e a profundidade das variantes encontradas foram revisadas com os arquivos BAM no programa IGV. Esse programa também foi utilizado para a investigação nos controles masculinos das variantes selecionadas para validação. Após a seleção das variantes relevantes, a presença das mesmas foi verificada na base de dados BIPMed.

4.2.4. Análise molecular complementar para confirmação da duplicação em Xp21.2 no