Análise molecular complementar para confirmação da duplicação em Xp21.2 no

Os indivíduos selecionados para a casuística são seguidos nos ambulatórios do GIEDDS e de Endocrinologia Pediátrica do Hospital de Clínicas da UNICAMP, fazendo parte da casuística de vários projetos de pesquisa com o objetivo de chegar ao diagnóstico etiológico. Assim, a paciente 9, incluída no Grupo II deste trabalho, também

vinha sendo investigada. Por meio da técnica de MLPA foi detectada uma duplicação de duas sondas do gene CXorf21 (chromosome X open reading frame 21) em Xp21.2, porém com picos normais para as sondas do gene NR0B1 e os outros genes estudados. Com a colaboração da Profª. Dra. Vera Gil da Silva Lopes, foi realizado o ensaio de ACM para a paciente e sua mãe com a finalidade de confirmar a presença da duplicação e sua possível herança materna. Uma segunda colaboração, com os professores Dr. Olaf Hiort e Dr. Ralf Werner, permitiu refinar os pontos de quebra e caracterizar a duplicação por meio do sequenciamento do genoma da paciente.

4.2.4.1. Análise cromossômica por microarray

O ensaio foi realizado utilizando o CytoScan Chip 750K da Affymetrix e o kit de reagentes compatível. O chip CytoScan 750k™ (Affymetrix®) contém cerca de 750 mil marcadores polimórficos e não polimórficos, com um espaçamento médio de 4 kb na extensão total do genoma, 36 kb nos genes RefSeq e 3,4 kb nos genes OMIM. O ensaio foi realizado conforme os protocolos do fabricante, seguindo as etapas descritas resumidamente a seguir:

I. Preparação das amostras – As amostras de DNA foram diluídas para uma

concentração de 50 ηg/µL e a integridade da amostra foi verificada em gel de agarose 1%.

II. Digestão – O DNA genômico foi digerido pela enzima Nsp I em fragmentos

de diversos tamanhos, deixando uma extremidade livre de 4 pb de comprimento em cada um desses fragmentos.

III. Ligação – Uma reação foi preparada com a enzima T4 DNA ligase para a

ligação de adaptadores específicos nas extremidades livres resultantes da etapa anterior.

IV. Reação de PCR – Foi realizada uma reação de amplificação de todos os

fragmentos digeridos utilizando primer universal e a enzima Taq DNA polimerase TITANIUM.

V. Purificação – O produto da PCR foi purificado utilizando Purification

beads incluídas no kit de reagentes do CytoScan Chip 750K da Affymetrix

e o suporte magnético - MagnaRack™ Life Technologies.

VI. Fragmentação – O produto purificado foi fragmentado pela ação da

enzima Fragmentation Reagent, que produziu fragmentos de 25 a 125 pb.

VII. Marcação – Foi adicionada ao produto da reação anterior uma reação de

marcação contendo a enzima TdT.

VIII. Hibridação – 200 µL da reação final da marcação foi aplicada em um chip

CytoScan Chip 750k. Os chips vedados foram colocados em um forno de

hibridação (GeneChip® Hybridization Oven 640; Affymetrix Inc), onde permaneceram por um período de 18 horas a 50°C e 60 rpm.

IX. Lavagem – Após o período de hibridação, os chips foram colocados na

estação de lavagem (GeneChip® Fluidics Station 450; Affymetrix Inc.).

X. Escaneamento - Ao final da lavagem, os chips foram escaneados no

equipamento GeneChip® Scanner 3.000 7G (Affymetrix®).

XI. Análise dos dados – O arquivo CEL foi analisado no programa

Chromosome Analysis Suite (ChAS versão 3.1.0.15 (r9069) - Affymetrix ®)

(hg19) por comparação com dados de 380 indivíduos controle (HapMap;

BioServe Biotechnologies).

4.2.4.1.1. Análise das CNVs

Foram consideradas para análise somente duplicações e deleções com os números mínimos de 25 sondas como indicativo confiável para perda e de 50 sondas para ganho. Não foi utilizado nenhum filtro de tamanho para as CNVs. As variações do número de cópias mostradas pelo programa ChAS foram avaliadas em relação a conteúdo gênico, tamanho e associação com o fenótipo da paciente.

A interpretação dos resultados foi realizada após correlação genótipo-fenótipo e revisão da literatura; para isso, os seguintes recursos online foram utilizados: Online

Mendelian Inheritance in Man (OMIM), University of California Santa Cruz UCSC Genome Browser on Human Feb. 2009 (UCSC Genome Browser on Human Feb.2009), Database

of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources

(Decipher GRCh37), e Pubmed. Além disso, todas as variações foram pesquisadas nas bases de dados de indivíduos não afetados da população geral por meio do Database of

Genomic Variations (DGV), Database of Genomic Variations – Affymetrix (aDGV) e em

um grupo de 111 indivíduos controle da população geral brasileira provenientes de um consórcio de pesquisadores da FCM/UNICAMP.

4.2.4.2. Sequenciamento do genoma

O sequenciamento do genoma foi realizado também pela empresa Novogene

Bioinformatics Technology Co., Ltd. A construção da biblioteca e o sequenciamento

foram realizados conforme os protocolos dos fabricantes. Para este ensaio foram realizadas as seguintes etapas:

I. Amostra de DNA: A avaliação da integridade do DNA genômico foi verificada

em gel de agarose 1% e a concentração foi mensurada utilizando o equipamento Qubit® DNA Assay Kit in Qubit® 2.0 Fluorometer (Life

Technologies, CA, USA). Foi utilizada uma quantidade de 1,0 μg de DNA para

a construção das bibliotecas.

II. Construção das bibliotecas: As bibliotecas foram geradas utilizando o kit

NEBNext® DNA Library Prep. O DNA genômico foi fragmentado

aleatoriamente em fragmentos de 350 pb de tamanho. As extremidades dos fragmentos de DNA foram reparadas, a extremidade 3’ sofreu adenilação e foram ligados adaptadores NEBNext. Os fragmentos foram marcados com indexes P5 e P7 e posteriormente enriquecidos. Os produtos da amplificação foram purificados com o sistema AMPure XP. O tamanho dos fragmentos da amostra final foi verificado no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer e a quantificação foi realizada usando PCR em tempo real.

III. A biblioteca foi sequenciada em uma plataforma Illumina.

O processamento dos arquivos brutos para a chamada de variantes foi realizado utilizando as mesmas ferramentas de bioinformática e seguindo os mesmos passos descritos anteriormente para o processamento dos dados brutos obtidos do sequenciamento do exoma.

As análises da investigação de variantes deletérias e do refinamento do ponto de quebra da duplicação foram realizadas por dois pesquisadores envolvidos no projeto (Jacok Meinel e Dr. Ralf Werner, da Universidade de Lübeck) e estão descritas a seguir.

4.2.4.2.1. Análise dos dados de exoma extraídos do sequenciamento do genoma

Foram investigadas variantes exônicas em genes sabidamente associados com o desenvolvimento sexual com frequência populacional inferior a 0,001 que pudessem ser associadas ao fenótipo da paciente.

4.2.4.2.2.Refinamento dos pontos de quebra utilizando os dados do sequenciamento do genoma

A duplicação sob investigação não foi identificada pelo algoritmo utilizado pela empresa Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd. para a detecção de SV. Assim, com o conhecimento prévio da localização da região duplicada e utilizando o programa IGV, foi realizada uma varredura nas regiões ao redor da duplicação na expectativa de visualizar uma maior profundidade das reads na região duplicada. Nas localizações genômica chrX:30561644 e chrX:30859140 foram observadas uma pequena alteração da profundidade e reads se encerrando nesse local. Para construir um modelo dos pontos de quebra da duplicação foram utilizadas sequências das reads extraídas do programa IGV nos pontos citados anteriormente. Os primers para amplificação do modelo construído foram desenhados utilizando a ferramenta online Primer3 Input

(version 0.4.0); estes estão descritos na Tabela 06. Essas sequências foram amplificadas