Resultados do sequenciamento do painel gênico

O sequenciamento dos genes alvo gerou uma média de 732.322 reads por indivíduo, com uma média de tamanho de reads de 180 pb. Uma profundidade de leitura de 100x foi alcançada por 89.93% das bases nas regiões alvo, e uma média de 210 variantes foi identificada por paciente.

Foram identificadas dez variantes em quatro dos seis indivíduos em que o painel foi aplicado (Tabela 11). Todas as variantes foram validadas por sequenciamento de Sanger, estavam ausentes nos controles masculinos e não foram encontradas na base de dados BIPMed.

Tabela 11: Variantes identificadas por sequenciamento do painel gênico.

Indivíduos Gene Variantes Genótipo Tipo de variante dbSNP Origem

9 CYR61 POR STAR c.947C>G: p.S316C c.1891G>A: p.V631I c.361C>T: p.R121W Heterozigose Heterozigose Heterozigose Missense Missense Missense rs148330006 rs145782750 rs34908868 - - - 10 SRY WWOX c.89G>T: p.R30I c.253T>G: p.Y85D Hemizigose Heterozigose Missense Missense - rs781063964 Paterna - 11 SRY CBX2 c.89G>T: p.R30I c.849G>T: p.K283N Hemizigose Heterozigose Missense Missense - rs149210919 Paterna Materna 12 - - - - - - 13 - - - - - - 14 CYR61 WDR5 c.1000C>T: p.R334W c.277G>A: p.V93I Heterozigose Heterozigose Missense Missense rs9658587 rs775145349 - Paterna

Indivíduo 9

No indivíduo 9 foram identificadas três variantes, a c.1891G>A (rs145782750) no éxon 15 do gene POR, a c.361C>T (rs34908868) no éxon 4 do gene STAR e a variante c.947C>G (rs148330006) no éxon do gene CYR61. Mutações recessivas no gene STAR causam hiperplasia adrenal congênita e DDS 46,XY (113), enquanto que mutações recessivas no gene POR causam desequilíbrio da esteroidogênese e síndrome de Antley- Bixler. O estudo funcional da variante c.1891G>A no POR realizado em outro trabalho demonstrou atividade parcial da proteína (114). Contudo, variantes em heterozigose em ambos os genes não são suficientes para causar deficiência na biossíntese dos esteroides sexuais. Além disso, ambos produtos dos genes citados são enzimas envolvidas na síntese de esteroides e não no desenvolvimento gonadal, por esse motivo possuem pouco significado no quadro fenotípico da paciente em questão. Por sua vez, o gene

CYR61 está associado ao fenótipo de hipospadia, característica clínica não apresentada

por essa paciente (115). Assim, as variantes descritas não explicam o fenótipo de disgenesia gonadal neste caso.

Indivíduo 10

Os indivíduos 10 e 11 são membros de uma irmandade com herança paterna da variante c.89G>T no gene SRY. Essa variante foi confirmada no painel gênico e uma segunda variante foi identificada, a c.253T>G (rs781063964) no gene WWOX. Por se tratar de afecção com recorrência familial, a alteração foi investigada, também por Sanger, em dois outros indivíduos não afetados da irmandade e na mãe dos pacientes, todos com resultado negativo para a variante. A investigação paterna não foi possível, pois o mesmo não participou do estudo.

O gene SRY, como mencionado na introdução deste trabalho, é fundamental na determinação sexual. Esse gene induz o aumento da expressão de SOX9, que inicia a cascata gênica que media a diferenciação testicular (4,5,10,11). Deleções ou mutações no gene SRY são identificadas em aproximadamente 15% de indivíduos 46,XY com DDS (1,13,20). Estudos funcionais da mutação c.89G>T foram realizados por Assumpção et al. e mostraram que esta afeta a fosforilação SRY PKA, reduzindo a atividade de ligação ao DNA, provavelmente resultando em uma proteína levemente alterada (116). Essas

características comprovam o efeito patogênico da mutação, porém sua presença em irmãos não afetados e no próprio pai gera o questionamento sobre se existiria um segundo evento responsável pelo fenótipo dos indivíduos afetados. A variante identificada no gene WWOX representa uma explicação plausível para o fenótipo do paciente, podendo ser esta variante o segundo evento causador da DGP. O envolvimento de WWOX nos distúrbios da diferenciação sexual foi mencionado anteriormente.

Assim como no indivíduo 1, portador de variante no gene WWOX, também no indivíduo 10 havia presença de útero.

Indivíduo 11

Assim como no indivíduo 10, a variante c.89G>T no gene SRY foi confirmada. O sequenciamento dos genes alvo também permitiu identificar uma segunda variante no éxon 5 do gene CBX2 (c.849G<T - rs149210919). A variante foi investigada em outros dois membros não afetados da família e na mãe dos pacientes; apenas a mãe é portadora da alteração.

O gene CBX2 parece atuar na diferenciação testicular regulando a expressão do gene SRY. O knockout de camundongos XY acarreta em reversão sexual com desenvolvimento de ovários e gônadas hipoplásicas nos dois sexos (117). A sequência do gene CBX2 foi analisada para detecção de mutações ou variações do número de cópias em 47 indivíduos com DDS 46,XY e 46,XX, porém nenhuma alteração patogênica foi encontrada nesses indivíduos (118). Por meio do sequenciamento do exoma de dois indivíduos com DDS 46,XY, Sproll et al. identificaram mutações diferentes para cada indivíduo na isoforma CBX2.2, p.Cys132Arg (c.394T>C) e p.Cys154fs (c.460delT) (119). Esses achados sugerem que a variante encontrada no indivíduo 11 possa estar modulando o fenótipo da afecção juntamente com a mutação no gene SRY.

Indivíduos 12 e 13

Em ambos os indivíduos não foram identificadas variantes deletérias nas sequências gênicas enriquecidas no painel.

Indivíduo 14

A variante c.277G>A no gene WDR5, de herança paterna, foi identificada no indivíduo 14. O gene WDR5 é altamente expresso nos testículos. WDR5 é um alvo direto do gene SRY, e a interação entre esses dois genes promove a ativação da expressão de

SOX9; foi sugerido que WDR5 interage com o SRY impulsionando o desenvolvimento

testicular (120). Os genes SOX9 e SRY são essenciais para a formação testicular; assim, um desequilíbrio dessa via poderia acarretar em DGC, porém a presença da variante no genitor da paciente torna essa hipótese menos provável.

Uma segunda variante foi identificada nesta paciente, a c.1000C>T (rs9658587) no gene CYR61. Como mencionado anteriormente esse gene está associado a hipospadia, porém esta paciente não apresenta essa característica clínica.