ESTUDO DO DANO E RECUPERAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS CAUSADO
POR CAMPO ELÉTRICO
ESTUDO DO DANO E RECUPERAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS CAUSADO
POR CAMPO ELÉTRICO
CAMPINAS 2019
MARCELO ZOCCOLER
MARCELO ZOCCOLER
Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA ELÉTRICA E DE COMPUTAÇÃO
CAMPINAS 2019
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Engenharia Elétrica, na Área de Engenharia Biomédica
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNOMARCELO ZOCCOLER
E ORIENTADO PELO PROF. DR.PEDRO XAVIER DE OLIVEIRA
MARCELO ZOCCOLER MARCELO ZOCCOLER
ESTUDO DO DANO E RECUPERAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS CAUSADO
POR CAMPO ELÉTRICO
ESTUDO DO DANO E RECUPERAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS CAUSADO
POR CAMPO ELÉTRICO
Candidato: Marcelo Zoccoler RA:045041
Data da Defesa: 11 de janeiro de 2019
Título da Tese: “Estudo do Dano e Recuperação de Cardiomiócitos Isolados Causado por
Campo Elétrico”
Prof. Dr. Pedro Xavier de Oliveira Prof. Dr. Leonardo Abdala Elias Profa. Dra. Leticia Rittner
Prof. Dr. Fernando Rodrigues de Moraes Abdulkader Prof. Dr. Diogo Coutinho Soriano
A ata de defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Julgadora, encon-tra-se no SIGA (Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese) e na Secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Dedico este trabalho a Fernanda, José Antonio, Izilda e Matheus.
Agradeço inicialmente a Fernanda dos Santos Costa Leomil por todo e suporte, pelo carinho, pelos incentivos e pela paciência, aos meus pais, José Antonio B. Zoccoler e Izilda M. P. Zoccoler, e ao meu irmão, Matheus Zoccoler, por me incentivarem nos estudos, pelo carinho e por acreditarem no meu potencial.
Agradeço também a todas as pessoas que tiveram, de alguma forma, participação neste trabalho ou que colaboraram com sugestões, incentivos, compreensão e apoio:
ao professor Pedro Xavier de Oliveira pela sábia orientação, ensinamentos, paci-ência e compreensão;
a todos os professores do Centro de Engenharia Biomédica e do Departamento de Engenharia Biomédica, em especial aos professores José W. M. Bassani, Rosana A. Bassani e Leonardo A. Elias por estimados ensinamentos e sugestões, e à professora Vera da Silveira N. Button pelos ensinamentos e orientação anterior;
aos professores da Faculdade de Engenharia Elétrica, em especial a Renato da Rocha Lopes e Letícia Rittner pelos ensinamentos e sugestões;
a todos os amigos, funcionários e técnicos do Centro de Engenharia Biomédica e do Departamento de Engenharia Biomédica, em especial a Elizângela Souto de Oliveira, Re-nato da Silva Moura, Márcia A. Queiroz, Carlos Alberto L. da Silva, Flavio ReRe-nato Santos e Mauro Martinazo pela excelente dedicação e discussões de grande relevância para este proje-to;
aos amigos e colegas pelas sugestões, parceria e bons momentos, em especial a Ahmad, Alexandre, Amanda, Arnaldo, Érick, Fernanda, Jair, Jefferson, José Américo, Jorge, Lizandra, Natália, Patrícia, Priscila, Túlio e Willi.
ao apoio financeiro da CAPES pela bolsa de estudos; a todos que sempre me apoiaram.
“La saggezza è figlia dell'esperienza” (Leonardo da Vinci)
A eletroporação consiste na formação de poros na membrana celular resultantes da aplicação de campos elétricos de alta intensidade. Ela possui diversas aplicações clínicas, mas também pode ocorrer no coração após a desfibrilação. Sua ocorrência está associada à situação do po-tencial transmembrana ultrapassar um certo limiar e ao aumento drástico da concentração de cálcio intracelular. Como o rompimento da membrana é uma situação de ameaça à sobrevi-vência da célula, mecanismos de reselamento da membrana estão presentes em vários tipos de células e estão associados à exocitose de vesículas dependente de cálcio. Para observar a ele-troporação e estes mecanismos de reselamento, é comum o uso de indicadores de fluorescên-cia, porém alguns deles apresentam variação de sinal muito pequena, como os indicadores potenciométricos, representando um desafio na eliminação do ruído. Neste trabalho, realiza-mos diversos experimentos de fluorescência em cardiomiócitos isolados de rato para estudar o dano causado pela eletroporação nessas células e suas recuperações a ele. Estabelecemos um método de extração de sinais de fluorescência por meio de simulações computacionais com métodos de separação cega de fontes e o aplicamos em imagens de células carregadas com o indicador potenciométrico RH-237 submetidas a campos elétricos de alta intensidade. Em seguida, medimos as variações de fluorescência após aplicação de campos elétricos de alta intensidade por meio do indicador de fluorescência Fluo-3 e calibramos seu sinal para concen-tração de cálcio. Por fim, carregamos o indicador de fluorescência FITC-Dextran no lúmen de vesículas e acompanhamos a variação de sinal após eletroporação a fim de investigar a ocor-rência de exocitose. Mostramos que a utilização de métodos de separação cega de fontes é uma nova abordagem muito eficiente na eliminação do ruído de regiões de interesse. Também mostramos que várias regiões da célula tem seu potencial transmembrana mantido próximo do zero após o pulso elétrico, um indicativo da ocorrência de eletroporação. Verificamos a assi-metria nas concentrações de cálcio entre as regiões voltadas para os eletrodos, tanto na ampli-tude da variação quanto no tempo necessário para o restabelecimento de seu nível basal, mas essas variações não diferiram entre células orientadas na longitudinal e na transversal em rela-ção ao campo elétrico. Não observamos diferença na taxa de exocitose e concluímos que nos-so sistema widefield não teve a sensibilidade necessária para tal detecção.
Palavras-chave: Eletroporação. Cardiomiócitos. Separação cega de fontes. Exocitose.
Electroporation consists of pore formation in cell membrane resulting from the application of high intensity electrical fields. It has several clinical applications, but it can also occur in the heart after defibrillation. The occurrence of electroporation is associated with the situation where the transmembrane potential exceeds a certain threshold and with the drastic increase in intracellular calcium concentration. Since membrane disruption is a threatening condition to cell survival, membrane resealing mechanisms are present in various cell types and are associated with calcium dependent vesicle exocytosis. In order to observe these mechanisms and electroporation, the use of fluorescent dyes is common practice. However, some of these dyes have a very small signal variation, such as potentiometric indicators, representing a challenge in noise removal. In this work, we have performed several fluorescence experiments on rat isolated cardiomyocytes to study the damage caused by electroporation in these cells and their recovery from it. We have established a method for extracting fluorescence signals through computer simulations using blind source separation and applied it to images of cells loaded with the potentiometric dye RH-237 and submitted to high-intensity electrical fields. Next, we have measured the fluorescence variations after the application of high-intensity electrical fields using the Fluo-3 fluorescent dye and calibrated its signal to calcium concen-tration. Finally, we have loaded the FITC-Dextran fluorescent dye into vesicle lumens and we have monitored its signal variation after electroporation in order to investigate the occur-rence of exocytosis. We showed that blind source separation methods are very efficient in noise elimination from regions of interest. We have also shown that several regions of the cell have their transmembrane potential kept close to zero after the electrical pulse, which is an indicative of electroporation manifestation. We verified asymmetry in calcium concentrations between the regions facing the electrodes, both in their amplitude variation and in the time required for the reestablishment of their basal level, but these variations did not differ be-tween cells oriented longitudinally and transversely with respect to the electrical field direc-tion. We did not observe any difference in the rate of exocytosis, which led us to conclude that our widefield system might not have the necessary sensitivity for such detection.
Keywords: Electroporation. Cardiomyocytes. Blind source separation. Exocytosis. Membrane
Figura 1: Potencial de ação (PA) de neurônio (curva azul). Curva em vermelho ilustra resposta a uma estimulação sublimiar (modificado de BEAN, 2007, licença número
4530350943574). ... 23
Figura 2: Transporte de Ca2+ durante acoplamento excitação-contração. Inserção na figura mostra formas de onda de PA ventricular (curva preta), transiente de [Ca2+]i (curva azul) e contração mecânica (curva vermelha tracejada; modificado de BERS, 2002, licença número 4530360068835). ... 25
Figura 3: Diagrama de transição de estados da membrana decorrentes da eletroporação (modificado de BÖCKMANN et al., 2008, licença número 4530360625922). ... 27
Figura 4: Ilustração de mecanismo de selamento ativo da membrana com exocitose de lisossomos em resposta a dano na membrana (modificado de IDONE; TAM; ANDREWS, 2008, licença número 4530360998832). ... 28
Figura 5: Exemplos de operadores morfológicos. A. Erosão (εSE(IB)) aplicada em imagem binária (IB) por elemento estrutural (structural element, SE). B. Dilatação (δSE(IB)) aplicada em IB por SE (modificado de SOILLE, 2004, licença número 4530370245574). ... 37
Figura 6: Diagrama de aplicação de Separação Cega de Fontes (Blind Source Separation, BSS) em problema da festa de coquetel. ... 38
Figura 7: Diagrama do sistema de microfluorimetria com modificações destacadas em vermelho... 42
Figura 8: Shutter automático. ... 42
Figura 9: Sinais do circuito sincronizador. ... 45
Figura 10: Painel e interior do circuito sincronizador ... 46
Figura 11: Etapas do método de segmentação em Regiões de Interesse (Regions of Interest, ROIs) padrão. ... 48
Figura 12: Imagens de células com contorno sobreposto em amarelo e resultados da padronização das ROIs... 49
Figura 13: Diagrama de criação das observações e recuperação dos sinais. ... 52
Figura 14: Gráficos ilustrando as variáveis de saída das simulações. ... 54 Figura 15: Diagrama dos métodos de BSS utilizados: Análise de Componentes Principais (PCA), Análise de Componentes Principais com filtragem wavelet (wPCA), Análise de
Componentes Independentes (ICA) e Análise de Componentes Independentes com filtragem
wavelet (wICA). ... 55
Figura 16: Saídas das simulações em relação ao número de componentes. ... 59
Figura 17: Saídas das simulações em relação ao número de observações. ... 60
Figura 18: Exemplos de sinais recuperados. ... 62
Figura 19: Saídas das simulações em relação à SNR. ... 63
Figura 20: Exemplos de correções de desbotamento... 65
Figura 21: Desempenho das correções de desbotamento. ... 66
Figura 22: Saídas dos métodos de BSS após correções de desbotamento... 68
Figura 23: Diagrama de blocos de protocolo experimental para análise de variação de potencial transmembrana. ... 76
Figura 24: Diagrama de blocos representando as etapas da análise de imagens e processamento de sinais das ROIs dos vídeos associados às variações de potencial transmembrana... 79
Figura 25: Exemplo de aplicação da calibração de potencial de membrana. ... 82
Figura 26: Exemplo de aplicação da calibração de potencial de membrana quando SNR é muito baixa. ... 84
Figura 27: Imagens em campo claro de cardiomiócitos (com ROIs sobrepostas em amarelo) à esquerda e imagens de fluorescência com potencial de membrana em escala de cores ~500ms após a aplicação de pulso de alta intensidade à direita. ... 85
Figura 28: Diagrama de blocos de protocolo experimental para análise da [Ca2+]i. ... 93
Figura 29: Diagrama dos grupos experimentais e gráficos representativos do processo de calibração. ... 96
Figura 30: Resultados do programa para obtenção do parâmetro Fmáx. ... 100
Figura 31: Relação entre F0 e Fmáx. ... 101
Figura 32: Imagens campo claro e de fluorescência e gráficos da [Ca2+]i para cada região, de uma célula de cada grupo. ... 102
Figura 33: Gráficos de [Ca2+] i. ... 103
Figura 34: Resultado da análise de sensibilidade da calibração do Fluo-3. ... 104
Figura 35: Gráfico ilustrativo da medida do tempo de recuperação. ... 109
Figura 36: Curvas de porcentagem de células com ROI recuperada. ... 111
Figura 37: Diagrama de blocos de protocolo experimental para investigação de exocitose como mecanismo de reparo do sarcolema. ... 116
Figura 38: Imagens de campo claro e de fluorescência e gráficos de média de fluorescência ao longo do tempo... 119 Figura 39: Gráficos da variação de média de fluorescência (∆Fx) e variação de desvio padrão de fluorescência (∆𝐹𝑥𝜎). ... 120
Tabela 1: Características das células do protocolo de medida da variação do potencial transmembrana... 83 Tabela 2: Características das células dos protocolos de medida de fluorescência associada a Ca2+. ... 99 Tabela 3: Características das células do protocolo de medida de exocitose. ... 118
[Ca2+] – concentração de Ca2+ [Ca2+]
estímulo – amplitude dos transientes de [Ca2+]i (pico – [Ca2+]repouso) em resposta a estímu-los de baixa intensidade (1,2xET)
[Ca2+]
i – concentração de Ca2+ no citosol
[Ca2+]pulso_15x – amplitude de [Ca2+]i (pico – [Ca2+]repouso) após aplicação de pulso de campo elétrico com 15xET
[Ca2+]repouso – concentração de Ca2+ citosólica no repouso
A – parâmetro modulador da exponencial da função de desbotamento
APD25 – duração em 25% de repolarização do PA APD75 – duração em 75% de repolarização do PA
B – parâmetro da constante de tempo da exponencial da função de desbotamento
BDM – 2,3-Butanedione monoxime
BSS – separação cega de fontes (blind source separation)
C – parâmetro do coeficiente angular da função de desbotamento
CEB – Centro de Engenharia Biomédica
CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica Cpl – solução cardioplégica
D – parâmetro de coeficiente linear da função de desbotamento
DBPC – Correção de Desbotamento com Emenda Dupla (Double Bind Photobleaching
Cor-rection)
DMSO - Dimetilsulfóxido
DWT – Transformada Wavelet Discreta (Discrete Wavelet Transform)
E – parâmetro modulador da função degrau dentro da função de desbotamento
EM – electron multiplying
Er_Amp – Erro relativo para amplitude máxima
Er_Amp1 – Erro relativo para amplitude máxima para sinal PA no pior caso
Er_Amp2 – Erro relativo para amplitude máxima para sinal de eletroporação no pior caso ET – campo elétrico limiar
F – sinal de fluorescência
F* – valor verdadeiro do sinal de fluorescência de eletroporação
FDPC – Correção de Desbotamento Completa (Full Data Photobleaching Correction)
Fest – fluorescência de pico em resposta a estímulos de baixa intensidade (1,2xET)
FITC-Dextran – dextrano marcado com isotiocianato de fluoresceína (fluorescein
isothiocya-nate–dextran)
Fmáx – fluorescência máxima
Ft<0 – média de fluorescência antes da sinalização de evento
𝐹𝑡<0𝜎 – desvio padrão de fluorescência antes da sinalização de evento
Ft=x – média de fluorescência dentro da janela de dados para t = x segundos
𝐹𝑡=𝑥𝜎 – desvio padrão de fluorescência dentro da janela de dados para t = x segundos IB – imagem binária
ICA – Análise de Componentes Independentes (Independent Component Analysis)
j – número da ROI
K – limiar de filtragem wavelet
Kd – constante de dissociação do Fluo-3 para Ca2+
Krebs-Henseleit-CI – solução de Krebs-Henseleit para isolamento de células M – matriz de misturas
m – número de componentes
N – número de células
n – número de observações
npontos – número de pontos por observação NT – solução de Tyrode normal
NT-blebistatina – solução blebistatina para incubação de miócitos NT-FITC-Dx70 – solução FITC-dextran 70 para incubação de miócitos NT-Fluo – solução Fluo-3 para incubação de miócitos
NT-RH237 – solução RH-237 para incubação de miócitos P – matriz de transformação ortonormal
PA – potencial de ação
PAAmp – amplitude do PA
PApico – módulo da máxima amplitude de PA
PApico* – valor verdadeiro da amplitude do PA
Pb – função de desbotamento (photobleaching)
PCA – Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis)
r – coeficiente de correlação de Pearson
RMSE – raiz do erro quadrático médio (root-mean-square error) ROI – região de interesse (region of interest)
RS – retículo sarcoplasmático S – vetor de fontes independentes
Ŝ – vetor de fontes independentes estimadas
SBPC – Correção de Desbotamento com Emenda Simples (Single Bind Photobleaching
Cor-rection)
SE – elemento estrutural (structural element)
SERCA – ATPase de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase)
SNR – relação sinal-ruído (signal-to-noise ratio)
t – tempo
TIRF – fluorescência por reflexão interna total (total internal reflexion fluorescence) Ty-CI – solução de Tyrode para isolamento de células
u – função degrau
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
V – função do potencial de membrana
V* – valor verdadeiro do potencial de membrana
Vlimiar – potencial limiar para disparo do potencial de ação Vlimiar_eletrop – potencial limiar para ocorrência de eletroporação Vrepouso – potencial de repouso
W – matriz de separação
wICA – Análise de Componentes Independentes com filtragem wavelet (wavelet-ICA) wPCA – Análise de Componentes Principais com filtragem wavelet (wavelet-PCA) X – vetor de observações
Y – valores do sinal original Ŷ – valores do sinal recuperado
Z – vetor de fontes não-correlacionadas δ – dilatação
Δ[Ca2+]
i – ganho de [Ca2+]i
ΔF/F – variação de fluorescência
ΔF/Fest – variação de fluorescência em resposta a estímulos de baixa intensidade (1,2xET)
ΔFx – variação da média de fluorescência entre instante t = x segundos e instante antes da si-nalização de evento
∆𝐹𝑥𝜎 – variação do desvio padrão de fluorescência entre instante t = x segundos e instante an-tes da sinalização de evento
ΔVTmáx – máxima variação de potencial transmembrana limiar calculada ε – erosão
λ – número de eventos por intervalo da distribuição Poisson μg – média de função Gaussiana
σg – desvio padrão de função Gaussiana
σhf – desvio de mediana absoluto do coeficiente wavelet de mais alta frequência (highest
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 21
1.1 MEMBRANA PLASMÁTICA E O POTENCIAL DE AÇÃO ... 22
1.2 ÍON CÁLCIO: MENSAGEIRO INTRACELULAR ... 24
1.3 ELETROPORAÇÃO ... 26
1.4 MECANISMOS DE RESELAMENTO ... 27
1.5 MÉTODOS DE MEDIÇÃO DE SINAIS CELULARES ... 29
1.6 PROCESSAMENTO DE SINAIS DE FLUORESCÊNCIA ... 31
2 OBJETIVOS ... 33
3 PROCESSAMENTO DE SINAIS DE POTENCIAL TRANSMEMBRANA ... 34
3.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 34
3.1.1 Operadores Morfológicos ... 36
3.1.2 Separação Cega de Fontes... 38
3.1.2.1 Análise de Componentes Principais ... 39
3.1.2.2 Análise de Componentes Independentes ... 39
3.1.3 Transformada Wavelet ... 40
3.2 MODIFICAÇÕES NO SISTEMA DE MICROFLUORIMETRIA ... 41
3.2.1 Shutter Automático ... 42
3.2.2 Circuito Sincronizador ... 43
3.3 PADRONIZAÇÃO DE REGIÕES DE INTERESSE ... 46
3.3.1 Materiais e Métodos ... 46
3.3.2 Resultados ... 48
3.3.3 Discussão ... 49
3.4 SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS PARA REMOÇÃO DE RUÍDO DE SINAIS BIOLÓGICOS ... 51
3.4.1 Materiais e Métodos ... 51
3.4.2 Resultados ... 58
3.4.3 Discussão ... 69
3.5 ANÁLISE DE POTENCIAL TRANSMEMBRANA... 72
3.5.1 Materiais e Métodos ... 72
3.5.1.1 Animais ... 72
3.5.1.2 Soluções Fisiológicas ... 73
3.5.1.4 Protocolo Experimental ... 74
3.5.1.5 Análise de Imagens e Sinais ... 76
3.5.2 Resultados ... 80
3.5.3 Discussão ... 86
4 ANÁLISE DA VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CÁLCIO ... 91
4.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 91
4.2 CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DE CÁLCIO E ANÁLISE APÓS PULSO SUBLETAL ... 92 4.2.1 Materiais e Métodos ... 92 4.2.1.1 Soluções Fisiológicas ... 92 4.2.1.2 Protocolo Experimental ... 93 4.2.1.3 Análise de Imagens ... 94 4.2.1.4 Análise Estatística ... 98 4.2.1.5 Análise de Sensibilidade ... 98 4.2.2 Resultados ... 99 4.2.2.1 Características celulares ... 99
4.2.2.2 Calibração de Sinal de Fluorescência para Concentração de Cálcio ... 99
4.2.2.3 Variação da Concentração de Cálcio Intracelular em Resposta a Pulso Subletal ... 101
4.2.3 Discussão ... 104
4.3 TEMPO DE RECUPERAÇÃO APÓS PULSO SUBLETAL ... 108
4.3.1 Materiais e Métodos ... 108
4.3.2 Resultados ... 110
4.3.3 Discussão ... 111
5 INVESTIGAÇÃO DE EXOCITOSE COMO MECANISMO DE REPARO ... 113
5.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 113
5.2 ANÁLISE DO SINAL DE FLUORESCÊNCIA DO LÚMEN DE VESÍCULAS ... 115
5.2.1 Materiais e Métodos ... 115 5.2.1.1 Protocolo Experimental ... 115 5.2.1.2 Análise de Imagens ... 117 5.2.2 Resultados ... 118 5.2.3 Discussão ... 120 6 CONCLUSÕES ... 124 REFERÊNCIAS ... 126
ANEXO A – CERTIFICADOS DE COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS 139 ANEXO B – CIRCUITO SINCRONIZADOR ... 142 ANEXO C – CÓDIGO DE CIRCUITO SINCRONIZADOR ... 143
1 INTRODUÇÃO
O mecanismo de acoplamento excitação-contração é o responsável pela capacida-de capacida-de bombeamento capacida-de sangue proporcionada pelo coração. Uma onda capacida-de sinal elétrico capacida- despo-larizante promove um sinal transiente de concentração de Ca2+ no citosol ([Ca2+]i) das células cardíacas, o qual possibilita a contração e o relaxamento dos cardiomiócitos (BERS, 2002). Arritmias resultantes de patologias que afetam esse mecanismo podem levar a quadros graves de disfunções contráteis, dentre os quais o mais severo é a fibrilação ventricular. Trata-se de uma situação de ameaça imediata à vida, pois os miócitos ventriculares contraem de maneira desordenada, comprometendo o bombeamento de sangue para o corpo. A terapia utilizada para reversão desse quadro é a desfibrilação, que consiste na aplicação de um campo elétrico de alta intensidade sobre o tórax do paciente com o objetivo de excitar uma massa crítica de células, viabilizando a retomada do sincronismo e, consequentemente, do bombeamento efici-ente de sangue (DOSDALL; FAST; IDEKER, 2010). Ainda assim, estudos recefici-entes mostra-ram que há reincidência da fibrilação ventricular após desfibrilação de 40 a 56% dos pacientes (BHARDWAJ et al., 2017; SALCIDO et al., 2015).
Além da patologia causadora da arritmia inicial, outro fator que pode contribuir para essa reincidência é a própria terapia desfibrilatória, pois o campo elétrico pode chegar a 100V/cm nas regiões do coração próximas aos eletrodos (TUNG, 1996; YABE et al., 1990), campo este suficiente para matar uma célula cardíaca (KLAUKE; SMITH; COOPER, 2010; KNISLEY; GRANT, 1995). Mesmo em regiões do coração onde a intensidade de campo elé-trico é menor, as células podem sofrer lesões na membrana plasmática e se tornarem irrespon-sivas a novos estímulos elétricos por um certo tempo. Dependendo da gravidade da lesão, algumas células são capazes de restaurar a integridade da membrana e recuperar sua função excitatória e contrátil. Essa situação foi observada em células cardíacas de cultura e está asso-ciada ao restabelecimento do estado polarizado da membrana e à diminuição da [Ca2+]i para valores anteriores à lesão (KRAUTHAMER; JONES, 1997). Além disso, em outros tipos de células não-secretoras, mostrou-se a ocorrência de exocitose de lisossomos em resposta a rup-turas na membrana plasmática (JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002), sendo esse um pos-sível fenômeno associado ao reselamento da membrana. Mesmo assim, ainda não há relatos de uma análise local da dinâmica da lesão causada por campo elétrico em cardiomiócito iso-lados, nem de como estas células se recuperam do dano sofrido.
Atualmente, uma das maneiras mais utilizadas para quantificar os fenômenos que acontecem na membrana plasmática é a análise de imagens de fluorescência. Alguns fatores representados por essa fluorescência têm seu estado alterado quando ocorre uma ruptura da membrana, como o potencial transmembrana e a [Ca2+]i, enquanto outros têm provável parti-cipação no reselamento da membrana, como a exocitose e, novamente, a [Ca2+]i. A microsco-pia de epifluorescência fornece um ótimo contraste, pois é capaz de destacar apenas o sinal de um fator de interesse em um plano de fundo escuro. Ainda assim, a quantificação desses si-nais é uma tarefa complexa porque envolve a superação de diversos obstáculos, dentre eles a eliminação de um ruído potencialmente grande em relação à amplitude do sinal de interesse, a conversão de um sinal luminoso para a grandeza do fator associado (concentração iônica, po-tencial elétrico, força mecânica, entre outras) e efeitos indesejados da sonda introduzida na célula, como a fototoxicidade.
Abaixo, descrevemos os principais fatores associados ao acoplamento excitação-contração e como eles se comportam em resposta a lesões na membrana plasmática, em parti-cular causadas por campo elétrico. Também descrevemos as principais técnicas de medida desses fatores e algumas estratégias para quantificação dos sinais biológicos a partir de ima-gens de fluorescência.
1.1 MEMBRANA PLASMÁTICA E O POTENCIAL DE AÇÃO
A membrana plasmática é uma estrutura fluida composta de uma bicamada lipídi-ca com proteínas embebidas, as quais são responsáveis pelas funções da membrana, atuando como receptores, sinalizadores, enzimas e mediadores da passagem de íons e moléculas pela membrana. Os mediadores de pequenas moléculas e íons são proteínas de transporte de brana especializadas, como canais iônicos, trocadores e bombas, as quais conferem à mem-brana a característica de permeabilidade seletiva. Essa configuração permite que as membra-nas armazenem energia potencial na forma de um gradiente eletroquímico, o qual é mantido como consequência das diferenças de concentração de íons nos meios intra e extracelular e à própria permeabilidade seletiva da membrana, sendo utilizado para acionar vários processos de transporte e para enviar sinais elétricos em células excitáveis (ALBERTS et al., 2002).
As células excitáveis se valem do estado polarizado da membrana resultante desse gradiente eletroquímico para enviar sinais elétricos por meio de uma rápida despolarização seguida de repolarização do potencial de membrana, fenômeno conhecido como potencial de
ação (PA). Os PAs desempenham diferentes papéis sinalizadores: em neurônios, os PAs são os responsáveis pela comunicação entre as células; em células beta do pâncreas, eles provo-cam a liberação de insulina (ALBERTS et al., 2002); em miócitos, eles desencadeiam a con-tração celular por meio do mecanismo de excitação-concon-tração (BERS, 2002). O disparo do PA é induzido por uma despolarização inicial da membrana até um valor limiar de potencial (Vlimiar), e esta despolarização pode ser causada pela conexão de ligantes a receptores de membrana, pelo estresse mecânico, pela introdução de correntes elétricas diretamente na membrana ou pela estimulação por campo elétrico externo. A Figura 1 ilustra um PA de neu-rônio.
Figura 1: Potencial de ação (PA) de neurônio (curva azul). Curva em vermelho ilustra resposta a uma estimula-ção sublimiar (modificado de BEAN, 2007, licença número 4530350943574).
Como mencionado anteriormente, o potencial de membrana é determinado pela permeabilidade da membrana a certos íons, mas também pelo potencial de equilíbrio desses íons, o qual pode ser calculado a partir das concentrações intra e extracelulares por meio da equação de Nernst (ALBERTS et al., 2002). Desta forma, o potencial de membrana tende a se aproximar do potencial de equilíbrio dos íons aos quais ela está permeável. No estado de re-pouso, a membrana se encontra polarizada negativamente (-120 a -20mV dependendo da célu-la) e, na maioria das células, seu potencial de repouso (Vrepouso) é regido predominantemente pelo potencial de equilíbrio de K+ (cerca de -90mV), pois neste estado a membrana é mais permeável a este íon por apresentar canais de K+ abertos. A despolarização inicial aumenta a probabilidade de abertura de canais de Na+ dependentes de tensão e a entrada de Na+ a favor
de seu gradiente eletroquímico rapidamente despolariza a membrana, pois funciona como uma retroalimentação positiva: conforme mais canais de Na+ se abrem, mais a membrana despolariza e isto induz mais abertura de canais de Na+. Como o potencial de equilíbrio do Na+ é positivo (cerca de 50mV), a membrana tende a se despolarizar em direção a ele.
Este processo consegue ser revertido principalmente graças a dois fatores: a inati-vação tempo-dependente dos canais de Na+ e o aumento da probabilidade de abertura de ca-nais de K+ dependentes de tensão em potenciais menos negativos. Desta forma, a membrana tende a se repolarizar para valores mais negativos próximos do potencial de repouso do K+. Além disso, as concentrações iônicas são rebalanceadas graças à bomba de Na+/K+, que ati-vamente bombeia Na+ para fora da célula enquanto bombeia K+ para dentro da célula, ambos contrários a seus gradientes eletroquímicos.
1.2 ÍON CÁLCIO: MENSAGEIRO INTRACELULAR
Os íons cálcio também tem participação na despolarização da membrana durante o PA devido à abertura de canais de Ca2+ dependentes de tensão presentes na membrana de cé-lulas excitáveis, resultando num influxo de Ca2+ a favor de seu gradiente eletroquímico. Po-rém mais do que isso, os íons cálcio são os mais comuns sinalizadores intracelulares, partici-pando dos mais diversos processos, desde a fertilização até a morte celular (BERRIDGE; BOOTMAN; LIPP, 1998; CLAPHAM, 1995). Em neurônios, variações da [Ca2+]
i possibili-tam a exocitose de neurotransmissores na fenda sináptica (SUGIMORI et al., 1994), fenôme-no que consiste na fusão de vesículas intracelulares com a membrana plasmática para libera-ção de seu conteúdo para o meio extracelular (ALBERTS et al., 2002). Em cardiomiócitos, as variações da [Ca2+]
i desencadeadas durante o PA são responsáveis por estimular o ciclo de pontes cruzadas entre os filamentos de actina e miosina, que fazem com que a célula realize contração e relaxamento (BERS, 2002). A Figura 2 mostra como o acoplamento excitação-contração ocorre num cardiomiócito.
Figura 2: Transporte de Ca2+ durante acoplamento excitação-contração. Inserção na figura mostra formas de onda de PA ventricular (curva preta), transiente de [Ca2+]
i (curva azul) e contração mecânica (curva vermelha tracejada; modificado de BERS, 2002, licença número 4530360068835).
Durante o disparo de um PA, canais de Ca2+ dependentes de tensão são abertos no sarcolema e permitem a passagem de Ca2+ para o meio intracelular. Nestas células, o aumento local da [Ca2+]
i favorece a abertura de canais receptores de rianodina do retículo sarcoplasmá-tico (RS), liberando parte do estoque de Ca2+ do RS para o citosol, o que contribui significati-vamente para o aumento da [Ca2+]
i. A elevação dessa concentração proporciona a produção de força nos miofilamentos, resultando na contração mecânica. Para que o relaxamento ocorra, é necessário que a [Ca2+]i diminua. Isto é feito por meio da recaptação de Ca2+ para dentro do RS através da ATPase de Ca2+ do RS (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA),
pelo bombeamento de Ca2+ para o meio extracelular através da ATPase de Ca2+ do sarcolema, pelo trocador Na+/Ca2+ e pelo uniporter mitocondrial de cálcio (BERS, 2002).
Embora as variações da [Ca2+]i sejam fundamentais para esses diversos processos fisiológicos, o aumento excessivo da [Ca2+]i é nocivo para a célula, podendo servir de sinali-zador para apoptose (ALBERTS et al., 2002), induzir hipercontratura irreversível em miócitos isolados (KNISLEY; GRANT, 1995), destruir o citoesqueleto (SCHLAEPFER; BUNGE, 1973), causar dano mitocondrial (MINEZAKI; SULEIMAN; CHAPMAN, 1994;
WROGEMANN; PENA, 1976) e causar necrose por meio da ativação de enzimas proteolíti-cas (BERRIDGE; BOOTMAN; LIPP, 1998; WROGEMANN; PENA, 1976). Uma das situa-ções onde esse aumento excessivo pode ocorrer é durante a ruptura da membrana plasmática. Esta ruptura pode ter origem mecânica (por exemplo, lesões mecânicas), bioquímica (por exemplo, peptídeos antimicrobianos), térmica ou elétrica (por exemplo, eletroporação).
1.3 ELETROPORAÇÃO
A eletroporação é um fenômeno induzido artificialmente que consiste na forma-ção de poros não-seletivos na membrana de células em resposta à aplicaforma-ção de campos elétri-cos com magnitude suficiente para mudar a conformação da bicamada fosfolipídica (WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996). Ela foi inicialmente observada como um aumento drástico da permeabilidade da membrana e, em alguns casos, rompimento mecânico, o que compromete o equilíbrio iônico das células e pode causar lise celular (KINOSITA JR; TSONG, 1977). Vários trabalhos apontaram que sua manifestação está associada à condição do potencial transmembrana induzido atingir um valor limiar crítico (Vlimiar_eletrop, CHEEK; FAST, 2004; KINOSITA JR; TSONG, 1977; KOTNIK; PUCIHAR; MIKLAVČIČ, 2010; TOVAR; TUNG, 1992), ainda que teoricamente a variação temporal do potencial transmem-brana possa ter uma influência (WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996).
A nível molecular, a aplicação do campo elétrico induz uma a variação do poten-cial transmembrana que pode alterar o estado de agitação das moléculas de fosfolípides da membrana e formar poros hidrofóbicos, que ainda não permitem a passagem de íons, mas que podem se transformar em poros hidrofílicos, os quais permitem a passagem de íons, caso a variação do potencial transmembrana seja suficientemente elevada. Apresentamos na Figura 3 uma ilustração desse fenômeno. Acredita-se que a distância entre os fosfolípides seja um pa-râmetro determinante para a evolução de um poro hidrofóbico para um poro hidrofílico (NEU; KRASSOWSKA, 1999; WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996) e a energia livre das moléculas tem uma influência direta na área efetiva que elas ocupam (LEWIS, 2003). Esse aumento da energia livre e da área efetiva concedido pela aplicação do campo elétrico externo pode então favorecer a formação de poros.
Figura 3: Diagrama de transição de estados da membrana decorrentes da eletroporação (modificado de BÖCKMANN et al., 2008, licença número 4530360625922).
A eletroporação possui várias aplicações clínicas, pois permite a passagem de mo-léculas outrora impermeáveis à membrana. Ela é empregada na transferência de genes para células, fusão de células, introdução de drogas, eletroquimioterapia para tratamento de câncer e entrega de genes e drogas para tecidos (RUBINSKY, 2007). Nestes casos ela é chamada de eletroporação reversível, pois busca apenas alterar momentaneamente a permeabilidade da membrana sem matar as células. Ainda assim, a eletroporação irreversível, aquela focada na destruição de tecidos, possui aplicações na indústria de alimentos, na esterilização e pré-processamento de comida, mas também clínicas, na ablação de tecidos cancerígenos, com o benefício de ser uma terapia não-termal, o que reduz os efeitos colaterais e o tempo de trata-mento (JIANG; DAVALOS; BISCHOF, 2015; RUBINSKY, 2007). No entanto, como men-cionado anteriormente, a eletroporação pode acontecer como um efeito colateral da terapia desfibrilatória.
1.4 MECANISMOS DE RESELAMENTO
A ruptura da membrana celular é uma situação crítica para a célula porque com-promete seu equilíbrio eletroquímico, aumenta drasticamente a [Ca2+]i (FAST et al., 2004; KRAUTHAMER; JONES, 1997; TOGO et al., 1999), pode ocasionar perda de conteúdo in-tracelular e morte celular (SCHLAEPFER; BUNGE, 1973). Há relatos de hemácias fantasmas que resselam a membrana passivamente em certas concentrações iônicas (HOFFMAN, 1992), mas um mecanismo de selamento ativo da membrana parece estar onipresente em variados tipos de células e acredita-se que funcione pela diminuição da tensão superficial da membrana por meio da exocitose de vesículas, em especial lisossomos, disparada por um influxo de Ca2+
(ANDREWS; ALMEIDA; CORROTTE, 2014; BI; ALDERTON; STEINHARDT, 1995; DAVENPORT et al., 2016; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002; MCNEIL; KIRCHHAUSEN, 2005; MCNEIL; STEINHARDT, 1997). Esta situação está representada na Figura 4.
Figura 4: Ilustração de mecanismo de selamento ativo da membrana com exocitose de lisossomos em resposta a dano na membrana (modificado de IDONE; TAM; ANDREWS, 2008, licença número 4530360998832).
A exocitose é comumente observada em células secretoras na liberação de hormô-nios ou enzimas, e em neurôhormô-nios na liberação de neurotransmissores para a fenda sináptica (ALBERTS et al., 2002). Apesar disso, ela parece ser um mecanismo bem preservado em diversos tipos celulares para o reparo de membrana, mesmo em células não-secretoras (JAISWAL et al., 2004; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002; MARTINEZ et al., 2000; REDDY; CALER; ANDREWS, 2001; RODRÍGUEZ et al., 1997) e musculares (MCDADE; ARCHAMBEAU; MICHELE, 2014).
Uma vez que cardiomiócitos são capazes de recuperar sua atividade elétrica e con-trátil dentro de alguns minutos após receber um pulso elétrico de alta intensidade (KRAUTHAMER; JONES, 1997) e há evidência de que realizam exocitose em resposta a aumento da [Ca2+]i (BATISTA et al., 2006), podemos imaginar que a exocitose também faça parte do seu mecanismo de selamento da membrana em resposta à eletroporação. Mesmo por-que essas células possuem um citoespor-queleto especializado e regularmente lidam com rupturas no sarcolema e elevadas [Ca2+]
i (MCNEIL; STEINHARDT, 1997), de modo que esse meca-nismo de reparo possa ocorrer mesmo em situações fisiológicas. No entanto, não há relatos
que comprovem essa teoria e as dinâmicas desse mecanismo nessas células poderiam auxiliar no desenvolvimento de terapias de redução de dano indesejado ao miocárdio causado por ele-troporação.
1.5 MÉTODOS DE MEDIÇÃO DE SINAIS CELULARES
Muitas técnicas foram desenvolvidas com o intuito de medir e quantificar sinais celulares, dentre os quais, as variações nos potenciais de membrana. Talvez a mais famosa delas seja a técnica de voltage-clamp, desenvolvida pelos estudos pioneiros de Curtis e Cole (CURTIS; COLE, 1938) e consolidada pelos experimentos clássicos de Hodgkin e Huxley (HODGKIN; HUXLEY, 1939), onde a medida era feita por um microeletrodo inserido dentro de um axônio de lula. Posteriormente, a medida da dinâmica de canais iônicos individuais se tornou possível com a técnica de patch-clamp (NEHER; SAKMANN, 1976), que consiste em utilizar uma fina pipeta de vidro para produzir um selo com a membrana e com isso isolar um pequeno pedaço da membrana e os canais iônicos que ela contém. Ambas as técnicas forne-cem medidas do potencial de membrana com ótima resolução temporal, mas não ofereforne-cem resolução espacial. Na mesma época, começava a se popularizar a medida de potenciais de membrana com o uso de indicadores fluorescentes (COHEN et al., 1974). Ela consiste na in-trodução de sondas exógenas, que são moléculas que se ancoram na membrana e funcionam como transdutores de variações locais de campo elétrico para sinais de fluorescência (LOEW, 2010). Esta técnica permite obter sinais com resolução espacial, porém as variações da ampli-tude de fluorescência dos indicadores de potencial de membrana são pequenas e a resolução temporal é menor em relação às técnicas de patch-clamp. Ela também pode apresentar des-vantagens associadas ao desbotamento, efeitos farmacológicos colaterais e dano fotodinâmico (GRINVALD et al., 1988; SCHAFFER et al., 1994; WARREN et al., 2010). Ainda assim, experimentos com indicadores de fluorescência potenciométricos realizados em conjunto com
patch-clamp ou voltage-clamp mostraram que muitos indicadores fluorescentes são capazes
de reproduzir as variações dos PAs de maneira fidedigna e linear (COHEN et al., 1974; WINDISCH et al., 1995)
Vários trabalhos utilizaram indicadores potenciométricos para medir PAs e outras variações de potencial da membrana, por exemplo variações em resposta a campos elétricos externos (HIBINO et al., 1991; KNISLEY et al., 1993; KOTNIK; PUCIHAR; MIKLAVČIČ, 2010; KRAUTHAMER; JONES, 1997; WARREN et al., 2010). Nesses casos, se o campo
elétrico fosse aproximadamente uniforme, uma célula oval apresentava um perfil de fluores-cência aproximadamente cossenoidal (KINOSITA et al., 1988), isto é, a variação do sinal de fluorescência induzido pelo campo ao se contornar a célula variava de um máximo positivo na extremidade voltada para o cátodo até um mínimo negativo na extremidade voltada para o ânodo, sendo aproximadamente nula ao centro. Quando esses campos elétricos eram grandes o suficiente para causar eletroporação, esta podia ser inferida como um aplainamento neste perfil de fluorescência, ou seja, o perfil cossenoidal era ceifado nas regiões de pico durante os instantes de aplicação do campo (DEBRUIN; KRASSOWSKA, 1999a; KINOSITA et al., 1988; KOTNIK; PUCIHAR; MIKLAVČIČ, 2010). Isto é atribuído ao fato da eletroporação funcionar como um “curto-circuito” local na membrana, cujas correntes iônicas impediriam um aumento maior do potencial. Conjuntamente, a observação da introdução de compostos fluorescentes impermeáveis à membrana pode ser usada como indicativo de eletroporação (CHEEK; FAST, 2004; KOTNIK; PUCIHAR; MIKLAVČIČ, 2010).
Também existem vários indicadores de fluorescência para medir [Ca2+]
i dada a sua vasta participação em diversos fenômenos biológicos. Eles podem ser classificados em duas categorias: comprimento de onda único e raciométricos (PAREDES et al., 2008; THOMAS et al., 2000). Os de comprimento de onda único, como Fluo-3 e Fluo-4, são excita-dos por uma única faixa de comprimentos de onda e emitem em outra faixa. A principal van-tagem de sua utilização é o alto ganho de emissão de fluorescência quando ligados a Ca2+ e suas desvantagens estão no relativamente alto desbotamento do indicador (destruição de uma parcela do fluoróforo por exposição à luz de excitação) e na necessidade de obter parâmetros extras a cada experimento para realizar a calibração. Os raciométricos funcionam em mais de uma faixa de comprimento de onda, podendo ser excitados por duas faixas de comprimento de onda, como o Fura-2, ou emitir em duas faixas, como o Indo-1, dependendo se estão ou não ligados ao Ca2+. Sua principal vantagem está na calibração mais fácil e suas desvantagens envolvem problemas associados com excitação em comprimentos de onda ultravioletas e um sistema de microscopia mais sofisticado para lidar com a dupla excitação/emissão.
Por fim, diversas técnicas podem ser usadas para observar o resselamento da membrana e a ocorrência de exocitose. Como ela resulta num aumento na área de membrana, medidas de capacitância da membrana são capazes de quantificar a exocitose de grânulos in-dividuais (LOLLIKE; LINDAU, 1999). Além disso, técnicas de fluorescência podem ser uti-lizadas, seja para marcar proteínas que participam da exocitose, para marcar o lúmen de vesí-culas ou para marcar a própria membrana (BI; ALDERTON; STEINHARDT, 1995; JAISWAL et al., 2004; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002; MARTINEZ et al., 2000;
REDDY; CALER; ANDREWS, 2001; RODRÍGUEZ et al., 1997; TOGO et al., 1999). Com isso, um rastreamento pode ser feito e, no caso da marcação do lúmen, a exocitose pode ser observada por meio da liberação do componente fluorescente para o meio extracelular (JAISWAL et al., 2004; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002). Também é possível utilizar indicadores fluorescentes de membranas que realizem sua marcação conforme adentram na célula após uma lesão na membrana, o que pode revelar a fusão de vesículas (DAVENPORT et al., 2016).
1.6 PROCESSAMENTO DE SINAIS DE FLUORESCÊNCIA
As imagens produzidas com células marcadas com indicadores de fluorescência são inerentemente contaminadas por alguns tipos de ruído (WATERS, 2009): autofluorescên-cia, fluorescência de interferência cruzada (cross-talk), fluorescência fora de foco, iluminação não-uniforme, corrente de escuro (dark current), ruído de leitura (readout noise), ruído de disparo (shot noise) e desbotamento de indicador (dye photobleaching). Alguns destes podem ser evitados dependendo do sistema de microscopia, das amostras e dos indicadores utiliza-dos, mas outros podem ser apenas minimizados. Dois tipos de fontes de ruído inevitáveis são o ruído de disparo e o desbotamento de indicador. O ruído de disparo é associado com a natu-reza quântica da luz e pode ser modelado por meio de uma distribuição Poisson. O desbota-mento é causado pela eventual destruição de fluoróforos após exposição à luz de excitação e sua taxa de decaimento é específica do fluoróforo, do ambiente e da intensidade luminosa (DIASPRO et al., 2006). A correção de desbotamento geralmente envolve a subtração de uma ou mais funções exponenciais (DIASPRO et al., 2006; KOLIN; COSTANTINO; WISEMAN, 2006; SONG et al., 1995; WÜSTNER et al., 2014) ou aproximação linear para curtas dura-ções (FATHIAZAR; KRETZBERG, 2015). O ruído de disparo pode ser amenizado por média espacial ou temporal ao custo de perda de resolução. Estas estratégias podem ser suficientes para eliminar ruído de imagens com boa relação sinal-ruído (signal-to-noise ratio, SNR), mas são insuficientes para extrair informações de imagens muito ruidosas.
Além disso, pesquisadores trabalhando com imagens de fluorescência frequentemente estão interessados em analisar variações locais de sinal ao invés de variações globais de fluorescência. Para isso, é prática comum a utilização de regiões de interesse (regions of interest, ROIs) envolvendo um evento local para destacar algum fenômeno biológico, pois isto tende a aumentar a potência do sinal que, de outra forma, poderia ficar
diluído numa média global da imagem. Por outro lado, limitar a região de análise também pode aumentar a potência do ruído devido a uma menor promediação do ruído de disparo. Portanto, a definição da ROI é frequentemente feita manualmente e somente após a observação de uma variação notável de sinal local, numa tentativa de maximizar a potência do sinal. Essa liberdade na definição da ROI pode marcarar outros sinais e também fazer com que a análise deixe de ser imparcial.
2 OBJETIVOS
Desta forma, os objetivos gerais deste trabalho foram:
1. Caracterizar espacialmente os efeitos da eletroporação em cardiomiócitos isolados e verificar a ocorrência de exocitose como parte do mecanismo de selamento;
2. Desenvolver técnicas de análise de imagens de fluorescência capazes de extrair sinais de ROIs e convertê-los para a grandeza física correspondente.
Para tanto, definimos os objetivos específicos a seguir:
Realizar experimentos em cardiomiócitos isolados submetidos a campos elétri-cos de alta intensidade para produção de imagens de fluorescência associadas ao potencial transmembrana, à [Ca2+]i e à exocitose;
A partir das imagens, automaticamente definir ROIs para extração de sinais que permitam caracterizar o impacto da eletroporação na célula;
Estabelecer as técnicas de filtragem mais eficientes para separar os sinais de fluorescência dos ruídos, buscando minimizar os erros;
Testar as melhores técnicas nas imagens obtidas dos experimentos;
Realizar a calibração dos sinais de fluorescência para as unidades de medida correspondentes, como potencial elétrico e concentração iônica.
Este trabalho está dividido pelo tipo de sinal celular analisado. Primeiramente, apresentamos os experimentos para medida do potencial transmembrana, seguido dos experi-mentos para medida da [Ca2+]i e, por fim, os experimentos de medida de exocitose.
3 PROCESSAMENTO DE SINAIS DE POTENCIAL TRANSMEMBRANA
3.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A aplicação de um campo elétrico externo uniforme sobre uma célula induz uma redistribuição de cargas na membrana plasmática que resulta em potenciais transmembrana distintos ao redor da mesma (KOTNIK; MIKLAVČIČ, 2000), produzindo o perfil aproxima-damente cossenoidal (KINOSITA et al., 1988). A análise desse perfil de potencial elétrico permite identificar as regiões onde ocorre eletroporação, pois este perfil se altera nas regiões eletroporadas (KINOSITA et al., 1988). Desta forma, uma análise do potencial transmembra-na para observação indireta da eletroporação necessita da utilização de um indicador de fluo-rescência para potencial elétrico para fornecer uma resolução espacial.
O indicador de potencial de membrana RH-237 (N-(4-sulfobutyl)-4-(6-(4-(dibutylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium) é uma molécula do tipo styryl, um subgrupo de corantes de cianina, desenvolvido por GRINVALD e colaboradores (1982). Trata-se de um indicador considerado de resposta rápida que interage diretamente com o campo elétrico atra-vés da membrana por meio de um mecanismo eletrocrômico que altera os espectros de excita-ção e emissão em resposta às variações de campo elétrico. Com a despolarizaexcita-ção da membra-na, seus picos de excitação e emissão (λex=506nm/λem=687nm, medido em membrana de neurônio, FROMHERZ; MÜLLER, 1993) são deslocados em direção ao azul, além de se ob-servar um alargamento de ambos os espectros e uma diminuição na amplitude do espectro de emissão (FROMHERZ; MÜLLER, 1993). Desta forma, a variação do sinal de fluorescência ocorre principalmente devido ao deslocamento do espectro de emissão para fora da frequência de corte do filtro de emissão (RONZHINA et al., 2013) ao invés de um aumento de amplitu-de. Isto pode ser uma das razões das variações de fluorescência durante um PA serem geral-mente pequenas, cerca de 11%/100mV (FROMHERZ; MÜLLER, 1993) e 12%/100mV (GRINVALD et al., 1982). Para variações de fluorescência dessa magnitude, o artefato de movimento proveniente da contração celular pode interferir consideravelmente nas medidas, especialmente nas extremidades das células onde os deslocamentos são maiores. Para evitar isso, uma estratégia é a utilização de fármacos bloqueadores de movimento, como BDM
(2,3-Butanedione monoxime) e blebistatina.
O BDM não é recomendável como inibidor de miosina para experimentos em cé-lulas porque necessita de altas concentrações (na ordem de mM) para funcionar, além de
afe-tar o funcionamento de várias outras proteínas (BOND et al., 2013; OSTAP, 2002). Por outro lado, a blebistatina é capaz de bloquear o movimento em concentrações na ordem de μM, apresenta especificidade com as isoformas da miosina do tipo II e atua dificultando a libera-ção de fósforo inorgânico, impedindo o ciclo de pontes cruzadas de realizar as contrações (BOND et al., 2013; DOU; ARLOCK; ARNER, 2007; FARMAN et al., 2008; KOVÁCS et al., 2004). Ela não parece interferir na atividade elétrica das células (FEDOROV et al., 2007), nem nos fluxos de Ca2+ (DOU; ARLOCK; ARNER, 2007). Porém, seu efeito farmacológico parece ser anulado quando iluminada por luz em comprimentos de onda ultravioleta e azul (KOLEGA, 2004; SAKAMOTO et al., 2005), o que parece ser acompanhando de fototoxici-dade, mas ela não perde seu efeito para iluminação na faixa do verde ou comprimentos de onda maiores (KOLEGA, 2004).
Outro fator extra que deve ser levado em conta com indicadores potenciométricos é que eles apresentam dano fotodinâmico significativo (SCHAFFER et al., 1994; WARREN et al., 2010), atribuído à formação de espécies reativas de oxigênio. Embora essas espécies possam ser produzidas diretamente em resposta à exposição intensa da luz de excitação, este efeito parece ser acentuado nesses indicadores. Assim, é necessária cautela no tempo de expo-sição de células carregadas com esses indicadores à luz de excitação.
Se essas considerações forem propriamente tratadas, é possível capturar a forma de onda de PAs de células cardíacas isoladas por meio de indicadores fluorescentes para po-tencial de membrana (WARREN et al., 2010). Dependendo da taxa de aquisição das imagens, o PA é visto como um evento simultâneo na célula toda, pois se trata de um fenômeno auto-estimulante, onde regiões da membrana que ultrapassam Vlimiar estimulam a abertura de canais iônicos dependentes de tensão em regiões adjacentes, fazendo com que essas regiões próxi-mas também despolarizem e atinjam Vlimiar. A eletroporação também pode ser inferida por indicadores potenciométricos, no entanto, ela é um fenômeno autolimitante em relação ao potencial transmembrana, pois a abertura de poros não-seletivos na membrana tende a impedir o aumento da amplitude do potencial transmembrana em regiões próximas. Assim, diferente-mente do PA, o perfil de potencial transmembrana pode variar de acordo com a região obser-vada. Essa situação justifica o emprego de imagens de potencial elétrico e o uso de ROIs.
Entretanto, a utilização de ROIs nesse caso levanta novos obstáculos:
1. Mesmo se tratando de um mesmo tipo celular (cardiomiócitos ventriculares), as células isoladas podem variar de formato e alinhamento com o campo elétrico. Por mais que se espere que a eletroporação aconteça nas extremidades voltadas para os eletrodos, a
locali-zação e o formato das ROIs precisa seguir um padrão para não enviesar a interpretação dos sinais extraídos.
2. Analisar pequenas ROIs pode implicar numa diminuição da SNR porque a promediação espacial do ruído é diminuída sem garantia de um aumento compensatório da potência do sinal;
Um meio de assegurar uma análise imparcial das ROIs é automatizar a geração das mesmas, mas levando-se em conta o formato de cada célula. Para isso, uma técnica de simples implementação é a utilização de operadores morfológicos. Eles permitem segmentar imagens com certa preservação da forma original que representa o elemento de interesse, nes-se caso, a célula. Quanto à eliminação de um ruído mais elevado nas ROIs, filtragem linear clássica não é indicada, pois, como os sinais celulares analisados neste trabalho são transitó-rios e, portanto, não-estacionátransitó-rios, algumas componentes do sinal seriam filtradas junto com o ruído. Alternativas para filtragem desse tipo de sinal envolvem Transforma de Fourier Janela-da, filtros adaptativos, Transformada Wavelet e outros métodos de decomposição de sinais (RANGAYYAN, 2015). Contudo, aproveitando o fato de que, neste caso, múltiplas ROIs contém a mesma forma de onda do sinal, também é possível utilizar análise de sinais multi-componentes (RANGAYYAN, 2015), como por exemplo técnicas de Separação Cega de Fon-tes (Blind Source Separation, BSS).
3.1.1 Operadores Morfológicos
A morfologia matemática é uma teoria e técnica não-linear utilizada para lidar com a forma de estruturas. Ela se baseia nos chamados operadores morfológicos: procedimen-tos que utilizam conceiprocedimen-tos como união e interseção de conjunprocedimen-tos para extrair estruturas de interesse (SOILLE, 2004). Em processamento digital de imagens, essa extração geralmente é feita pela interação entre dois conjuntos, sendo um deles a imagem e o outro, o elemento es-trutural (structural element, SE). SE é uma matriz com uma coordenada definida como ori-gem e cujas dimensões são geralmente pequenas em relação às da imaori-gem. Durante uma ope-ração morfológica, o SE atua como uma sonda na imagem, sendo transladado por toda a ima-gem e podendo servir para indicar, por exemplo, se ele se encaixa dentro de certas estruturas da imagem ou se ele faz interseção com uma borda dessas estruturas. Por isso, o formato do SE geralmente é definido a partir de algum conhecimento prévio da geometria da estrutura de interesse.
Operadores morfológicos podem ser empregados na filtragem, segmentação e medida de imagens, tanto binárias quanto em tons de cinza. Os dois operadores morfológicos fundamentais são erosão e dilatação. Numa imagem binária (IB), a erosão por SE, definida como
εSE
(IB), consiste em fazer uma varredura da imagem com SE (se SE for não-simétrico, a varredura é feita com SE refletido em relação à própria origem), buscar regiões onde o SE esteja inteiramente contido em um elemento da imagem e atribuir um valor não-nulo apenas ao pixel da imagem coincidindo com a coordenada de origem do SE. Essa operação resulta num efeito geral de diminuição da área dos elementos da imagem, podendo inclusive apagar alguns, como ilustrado na Figura 5A. Analogamente, uma dilatação por SE, definida como δSE(IB), consiste em varrer a imagem buscando regiões onde a origem do SE coincida com algum pixel não-nulo da imagem e atribuir valores não-nulos a todos os pixels coincidindo com as coordenadas do SE. Isso resulta num efeito de expansão dos elementos da imagem, podendo inclusive conectar elementos distintos, como ilustrado pela Figura 5B. De um modo geral, ambos operadores tendem a preservar a forma dos elementos originais condicionados pela forma do SE, mas afetam a área dos elementos. Outros operadores morfológicos afetam menos a área dos elementos originais e funcionam como uma combinação dos operadores fundamentais, como abertura (erosão seguida por dilatação) e fechamento (dilatação seguida por erosão).Figura 5: Exemplos de operadores morfológicos. A. Erosão (
ε
SE(IB)) aplicada em imagem binária (IB) por ele-mento estrutural (structural element, SE). B. Dilatação (δSE(IB)) aplicada em IB por SE (modificado de SOILLE, 2004, licença número 4530370245574).3.1.2 Separação Cega de Fontes
A Separação Cega de Fontes compreende uma série de métodos de processamento de sinais baseada em processamento estatístico dos sinais e teoria da informação. Ela consiste na extração e recuperação das fontes de sinais subjacentes a partir de canais contendo uma mistura dessas fontes. O termo “cega” indica que essas fontes de sinal são desconhecidas e que pouca ou nenhuma informação sobre o sistema é conhecida previamente (YU; HU; XU, 2014). Um exemplo clássico de sua aplicação é o problema da festa de coquetel, ilustrado pela Figura 6, onde canais, modulados com diferentes pesos, contendo a conversa simultânea das pessoas são utilizados para separar os sinais de voz de cada pessoa. Neste exemplo, estes ca-nais poderiam ser microfones espalhados em diferentes locais do salão, de modo que as mes-mas vozes seriam gravadas com diferentes modulações.
Figura 6: Diagrama de aplicação de Separação Cega de Fontes (Blind Source Separation, BSS) em problema da festa de coquetel.
BSS é aplicada em muitas áreas como processamento de imagens (FERGUS et al., 2006), de sinais médicos (AZZERBONI et al., 2005; CASTELLANOS; MAKAROV, 2006; INUSO et al., 2007; MAMMONE; LA FORESTA; MORABITO, 2012; MIJOVIĆ et al., 2010; NG; RAVEENDRAN, 2009; RANGAYYAN, 2015; ZHOU; GOTMAN, 2004), de sinais de áudio (WILSON et al., 2008) e comunicação de dados (YU; HU; XU, 2014). Uma vez que alguns desses métodos apenas necessitam de algumas premissas sobre o tipo das fon-tes de sinal, como por exemplo independência estatística, descorrelação ou dispersão, eles podem ser úteis para separar sinais não-estacionários, como os sinais celulares, de ruídos, porém eles tendem a ter melhor desempenho conforme o número de observações dos sinais aumenta. No campo de neurociência por exemplo, estas observações podem ser fornecidas por diferentes canais de um EEG (CASTELLANOS; MAKAROV, 2006; INUSO et al., 2007; MAMMONE; LA FORESTA; MORABITO, 2012; ZHOU; GOTMAN, 2004). Para sinais de
fluorescência de células, estas observações podem ser produzidas por meio de múltiplas ROIs (KEEMINK et al., 2018; MUKAMEL; NIMMERJAHN; SCHNITZER, 2009). Abaixo des-crevemos os dois métodos de BSS utilizados nesse trabalho: Análise de Componentes Princi-pais (Principal Component Analysis, PCA) e Análise de Componentes Independentes
(Inde-pendent Component Analysis, ICA).
3.1.2.1 Análise de Componentes Principais
A PCA é um método usado para transformar uma série de observações numa base ortonormal (JOLLIFFE, 2005). Para funcionar corretamente, ela assume que as observações são uma combinação linear de fontes de sinal não-correlacionadas. Com isso, o método con-siste em buscar uma matriz P que transforme o vetor de observações X em um vetor de fontes não-correlacionadas Z:
𝒁 = 𝑷𝑿
A matriz P é encontrada pela diagonalização da matriz de covariância simétrica de X pelos seus autovetores, o que pode ser conseguido por Decomposição em Valores Singula-res. Por meio da reorganização da nova base de vetores em função da variância, da maior para a menor, mas mantendo a ortonormalidade, a PCA espera que as componentes do vetor com as maiores variâncias correspondam às fontes de sinal de interesse (componentes com variân-cias pequenas seriam atribuídas aos ruídos). Então, para eliminar ruído, geralmente uma dimi-nuição de dimensão é feita por meio da eliminação das últimas fontes de sinal do novo vetor Z.
A PCA pode ser útil na extração de sinais celulares, pois em princípio não se es-pera que o sinal celular tenha correlação com os ruídos das imagens de fluorescência.
3.1.2.2 Análise de Componentes Independentes
A ICA é similar ao PCA no sentido de que ela também busca identificar as fontes de sinal originais de uma série de observações. Entretanto, ICA tem premissas mais rigorosas que PCA com relação às fontes, considerando-as estatisticamente independentes (COMON, 1994; HYVÄRINEN; OJA, 1997). Desta maneira, ele presume que as observações X são uma mistura linear, definida pela matriz de misturas M, das fontes independentes S:
𝑿 = 𝑴𝑺
A tarefa de ICA é obter as fontes estimadas Ŝ por meio da busca da matriz de se-paração W = M-1, como mostrado abaixo:
𝑺̂ = 𝑾𝑿
Para resolver este problema, ICA primeiramente aplica PCA para remover depen-dências lineares entre as observações e normalizar as variâncias. Então, ela busca maximizar a independência estatística de Ŝ pela minimização da soma da entropia marginal das observa-ções, o que pode ser obtido pela maximização da soma da neguentropia (“não-Gaussianidade”) marginal. O resultado é uma série de fontes lineares independentes que não são necessariamente ortogonais, como em PCA.
A ICA pode ser eficiente na separação das fontes porque, em princípio, os sinais celulares e o ruído de disparo seriam sinais com distribuição não-gaussiana, critério que faz parte da etapa de estimação das fontes. Além disso, assumir que o sinal celular e o ruído se-jam estatisticamente independentes nesse caso parece uma suposição plausível.
3.1.3 Transformada Wavelet
A remoção de ruídos clássica é baseada na filtragem de algumas componentes frequenciais indesejadas. No entanto, para sinais não-estacionários, como muitos sinais bioló-gicos, cujas componentes em frequência variam consideravelmente com o tempo, um filtro passa-baixas ou passa-banda acaba sendo mal sucedido na remoção do ruído ou pode distorcer o sinal.
A Transformada Wavelet é uma ferramenta com resolução em tempo e frequência que permite filtrar frequências adaptativamente ao longo do tempo (MERRY, 2005). Wavelets são funções com curtas oscilações de energia finita que fornecem informação temporal por meio de seus deslocamentos ao longo de um sinal e fornecem conteúdo de frequência por meio de suas dilatações e contrações entre cada deslocamento. A Transformada Wavelet Dis-creta (Discrete Wavelet Transform, DWT) usa bancos de filtros para obter os coeficientes das
wavelets, os quais representam o sinal em diferentes faixas de frequência. A filtragem pode
ser realizada pela limiarização dos coeficientes das wavelets antes da aplicação da transfor-mada inversa.
Muitos estudos combinaram o uso de ICA com wavelets para otimizar a extração de sinais ou artefatos de EEG, o que foi definido como wavelet-ICA (wICA). Alguns estudos (2)
aplicaram DWT e depois ICA (AZZERBONI et al., 2005; LIN; ZHANG, 2005; ZHOU; GOTMAN, 2004) , outros aplicaram ICA sobre os coeficientes de DWT (INUSO et al., 2007; MAMMONE; LA FORESTA; MORABITO, 2012), enquanto um terceiro conjunto de traba-lhos aplicou DWT sobre as componentes extraídas com ICA (CASTELLANOS; MAKAROV, 2006; NG; RAVEENDRAN, 2009).
Com isso, a complementação da filtragem por BSS com filtragem wavelet poderia melhorar a remoção do ruído da fonte contendo o sinal celular, com menor possibilidade de deformação deste sinal.
3.2 MODIFICAÇÕES NO SISTEMA DE MICROFLUORIMETRIA
Os experimentos foram realizados num sistema de microfluorimetria desenvolvi-do no CEB/UNICAMP (ZOCCOLER; OLIVEIRA, 2015), o qual possibilita obter imagens de fluorescência de células depositadas em uma câmara de perfusão e estimuladas por pulsos de campo elétrico uniforme. O fato do indicador de potencial de membrana RH-237 apresentar pequena variação do sinal e fototoxicidade acentuada fez com que precisássemos adaptar nos-so sistema de microfluorimetria para conseguir realizar os experimentos com este indicador e desenvolver um método de processamento de imagens e sinais mais robusto para extrair os sinais de potencial de membrana.
O sistema de microfluorimetria contava anteriormente com um shutter manual, o que inviabilizava a execução dos experimentos com curta exposição das células à luz de exci-tação. Realizamos alguns testes onde observamos que a longa e contínua exposição à luz de excitação (1-2min) causava oscilações mecânicas e, eventualmente hipercontratura celular, especialmente quando essa exposição prolongada era acompanhada de estimulação elétrica. Este efeito também se acentuava quando utilizamos concentrações de RH-237 de 5 a 10μM. Entretanto, este efeito não foi observado na exposição à luz de excitação de células não carre-gadas com RH-237, assim como não foi detectado em células carrecarre-gadas com RH-237 não expostas à luz de excitação, semelhante a relatos com cardiomiócitos de cobaia carregados com o indicador potenciométrico di-4-ANEPPS (WINDISCH et al., 1995).
Por isso, substituímos o shutter manual por um automático e construímos um cir-cuito sincronizador capaz de interligar os sinais do estimulador elétrico, do shutter automático e da câmera (mod Ixon-3, Andor Technology, Belfast, Reino Unido). As modificações do sistema estão ilustradas em contorno vermelho na Figura 7. Os filtros óticos foram
