5.2.1 Materiais e Métodos
5.2.1.1 Protocolo Experimental
Os animais e o isolamento de células seguiram os mesmos procedimentos dos pro- tocolos de análise de Ca2+. O protocolo experimental adotado foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal, Instituto de Biologia, UNICAMP (protocolo: 4093-1 (H), Anexo A). Este protocolo envolve o armazenamento do indicador de fluorescência FITC- dextran 70 (massa molecular média 70000) em vesículas por meio de endocitose. Este proto- colo contém, além das anteriormente citadas, a seguinte solução fisiológica:
Solução FITC-dextran 70 para incubação de miócitos (NT-FITC-Dx70): 20mg de FITC-dextran 70 (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha) foram diluídos em 1 mL de NT.
O protocolo experimental está ilustrado na Figura 37. As células em solução Cpl (200μL) foram incubadas em solução NT (700μL) e NT-FITC-Dx70 (100μL), para concen- tração final de 2mg/mL, a 37°C por cerca de 3 horas no escuro para endocitose do indicador em um tubo Eppendorf. Após este período, as células foram lavadas (5 vezes troca de 900μL de solução) com NT a 4°C para remoção do indicador do meio extracelular.
Figura 37: Diagrama de blocos de protocolo experimental para investigação de exocitose como mecanismo de reparo do sarcolema.
O colágeno foi adicionado à câmara de perfusão da mesma forma que no protoco- lo anterior. As células carregadas com FITC-Dextran foram depositadas na câmara e perfun- didas com NT a temperatura ambiente (23-25°C), à taxa de 1 mL/min. As células foram esti- muladas eletricamente com pulsos bipolares (0,5Hz; 5ms por fase; 10V pico-a-pico) e, após a seleção de uma célula atendendo aos mesmos critérios do protocolo anterior, porém utilizando apenas células do grupo longitudinal, ET foi obtido.
Este protocolo também consiste de dois vídeos por célula: o primeiro foi um con- trole onde apenas foi sinalizado o instante de um evento, isto é, um instante de tempo foi mar- cado durante a aquisição, mas nenhum pulso elétrico foi aplicado, e no segundo o evento foi sinalizado juntamente com a aplicação de um pulso de campo elétrico de alta intensidade. No primeiro vídeo, foram gravadas imagens por cerca de 10s para gravarmos o sinal de fluores- cência antes do evento, então o shutter da fonte de iluminação foi fechado e a sinalização do evento foi feita. A partir do instante do evento, o shutter foi aberto após 30s e imagens de fluorescência foram gravadas por 5s até que o shutter fosse novamente fechado. Este processo foi repetido 3 vezes, isto é, a cada 30s, deixamos o shutter aberto por 5s, até a duração total de 120 + 5s após o evento. Um intervalo de aproximadamente 3min foi aguardado e o segundo
vídeo foi produzido da mesma forma que o primeiro, porém, a sinalização de evento foi acompanhada da aplicação de um pulso monopolar (15xET, duração de 5ms). O fechamento intervalado do shutter por certos intervalos foi feito para evitar fototoxicidade.
A câmera foi configurada com binning 2x2, 10ms de tempo de exposição, ganho EM de 150-300x e as imagens das células foram janeladas. Esta configuração resultou numa taxa de aquisição de aproximadamente 35fps.
5.2.1.2 Análise de Imagens
Nesta análise, a região da célula foi delimitada manualmente, mas as ROIs volta- das para o ânodo e para o cátodo foram geradas da mesma forma que no protocolo anterior, isto é, correspondendo a cerca de 10% da área total da célula através de um código em plata- forma MATLAB, desenvolvido neste trabalho. O sinal de background também foi calculado pela média de uma região distante da célula e subtraído de cada imagem.
Em seguida, a partir do gráfico de fluorescência média ao longo do tempo, o usuá- rio selecionava 5 janelas de dados com duração de aproximadamente 4s cada: a primeira delas antes do evento e as 4 seguintes a cada 30s após o evento, dentro dos intervalos em que o shu-
tter permaneceu aberto. Aqui definimos t=0 como o instante de tempo em que foi sinalizado o
evento. Em seguida, foram calculados a média de fluorescência da primeira janela de dados (Ft<0) e o desvio padrão (𝐹𝑡<0𝜎 ). Da mesma maneira, foram calculados as médias (Ft=x) e des- vios padrão (𝐹𝑡=𝑥𝜎 ) para as outras 4 janelas de dados, onde x corresponde aos instantes 30s, 60s, 90s ou 120s. A partir disso, foram calculados a variação de média de fluorescência (∆Fx) e variação de desvio padrão de fluorescência (∆𝐹𝑥𝜎) para cada instante após o evento (x = 30s, 60s, 90s ou 120s) como descrito pelas equações (17) e (18), respectivamente:
∆𝐹𝑥= 𝐹𝐹𝑡<0
𝑡=𝑥
∆𝐹𝑥𝜎 = 𝐹𝑡<0
𝜎
𝐹𝑡=𝑥𝜎
Estas variações foram calculadas tanto para a ROI da célula quanto para as ROIs do ânodo e do cátodo. Análise de variância dois fatores (two-way) com medidas repetidas e pós-teste de Bonferroni foram aplicados para ∆Fx e ∆𝐹𝑥𝜎 onde os fatores são tratamento (grupo controle vs grupo pulso 15xET) e tempo após evento.
(17)
5.2.2 Resultados
Na Figura 38 mostramos imagens de um cardiomiócito e os gráficos de média de fluorescência. Na Figura 38A mostramos uma imagem de campo claro da célula com a ROI desenhada manualmente destacada em amarelo e na Figura 38B mostramos uma imagem de fluorescência da mesma célula carregada com FITC-Dextran 70. O gráfico da Figura 38C contém a média de fluorescência da região da célula (região amarela em Figura 38A) ao longo do tempo do primeiro vídeo, isto é, do grupo controle. A seta branca indica o instante do evento e o eixo do tempo foi deslocado para que sua origem coincidisse com a sinalização do evento. Desta forma, tempos negativos indicam medidas antes da sinalização do evento en- quanto que os dados ao redor dos instantes 30s, 60s, 90s e 120s correspondem às medidas realizadas com após o evento. Intervalos com média próxima de zero correspondem aos mo- mentos em que o shutter permaneceu fechado. O gráfico da Figura 38D contém a média de fluorescência da região da célula para o segundo vídeo. Neste caso, portanto, a seta preta indi- ca o instante da aplicação de pulso monopolar (15xET, duração 5ms).
Os resultados das características das células deste protocolo são mostrados na Ta- bela 3. Os valores correspondem a médias ± erros padrões da média.
Tabela 3: Características das células do protocolo de medida de exocitose. Comprimento, largura, ET e ΔVTmáx. N é o número de células em cada grupo. Os valores correspondem a média ± erro padrão da média.
Longitudinal (N=5) Comprimento (m) 129,73 ± 3,78 Largura (m) 32,06 ± 2,26 ET (V/cm) 3,30 ± 0,08 VTmáx (mV) 21,31 ± 0,88
Figura 38: Imagens de campo claro e de fluorescência e gráficos de média de fluorescência ao longo do tempo. A. Imagem de campo claro de cardiomiócito e ROI produzida manualmente (contorno amarelo). B. Imagem de fluorescência de cardiomiócito carregado com FITC-Dextran 70. C. Gráfico de média de fluorescência do pri- meiro vídeo (controle). Seta branca indica instante de evento. D. Gráfico de média de fluorescência do segundo vídeo (pulso 15x). Seta preta indica instante da aplicação de pulso monopolar (15xET, duração 5ms).
Na Figura 39 apresentamos as médias das células analisadas (N=5). Os gráficos da esquerda mostram as médias (símbolos) e erros padrão (linhas verticais) de ∆Fx para os grupos controle (círculos pretos) e após aplicação do pulso elétrico 15xET (quadrados verme- lhos) ao longo dos instantes após evento (x = 30s, 60s, 90s, e 120s). Os gráficos da direita, de maneira similar, mostram as médias de ∆𝐹𝑥𝜎. Os gráficos nas Figura 39A e Figura 39B corres- pondem à ROI da célula destacada na Figura 38A, os gráficos nas Figura 39C e Figura 39D correspondem à ROI do ânodo e os gráficos nas Figura 39E e Figura 39F correspondem à ROI do cátodo.
A análise de variância dois fatores indicou diferença estatística significativa em
∆Fx apenas para o fator tempo após evento na ROI da célula (P<0,001; F ratio=31,10; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=4,31; poder estatístico≈1), na ROI do ânodo (P<0,001; F ra-
tio=13,12; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=2,68; poder estatístico≈1) e na ROI do cátodo (P<0,001; F ratio=15,17; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=3,51; poder estatístico≈1). Não houve diferença estatística em nenhum dos gráficos de ∆𝐹𝑥𝜎.
Figura 39: Gráficos da variação de média de fluorescência (∆Fx) e variação de desvio padrão de fluorescência
(∆𝐹𝑥𝜎) para os grupos controle (círculos pretos) e pulso 15x (quadrados vermelhos) em vários instantes após evento (N=5). Símbolos representam médias e linhas verticais representam erros padrão das médias. A. ∆Fx da
célula. Houve diferença estatística significativa apenas para fator tempo após evento (análise de variância dois fatores com medidas repetidas: P<0,001; F ratio=31,10; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=4,31; poder estatís- tico≈1). B. ∆𝐹𝑥𝜎 da célula. C. ∆Fx da ROI do ânodo. Houve diferença estatística significativa apenas para fator
tempo após evento (análise de variância dois fatores com medidas repetidas: P<0,001; F ratio=13,12; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=2,68; poder estatístico≈1). D. ∆𝐹𝑥𝜎 da ROI do ânodo. E. ∆Fx da ROI do cátodo.
Houve diferença estatística significativa apenas para fator tempo após evento (análise de variância dois fatores com medidas repetidas: P<0,001; F ratio=15,17; DFn=3; DFd=12; tamanho de efeito=3,51; poder estatístico≈1). F. ∆𝐹𝑥𝜎 da ROI do cátodo.
5.2.3 Discussão
Diversos tipos celulares se mostraram capazes de endocitar dextranos (JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002), inclusive cardiomiócitos de camundongo (BATISTA et al., 2006; SOEIRO et al., 2002). Como mostrado na Figura 38B, cardiomiócitos de rato também
são capazes de absorver dextranos quando carregados a 37°C. A endocitose e a exocitose são mecanismos dependentes da temperatura, porém a endocitose parece ser completamente ini- bida a baixas temperaturas enquanto que a exocitose pode ser detectada a baixas temperaturas, ainda que a uma taxa menor (BASRAI; NAIDER; BECKER, 1990; TOMODA; KISHIMOTO; LEE, 1989; ZHANG; JACKSON, 2008). Nossos testes em temperatura ambi- ente se mostraram ineficazes para a detecção do carregamento de FITC-Dextran 70 em nosso sistema de microscopia widefield, mesmo com carregamento por longos períodos (3 horas). Por outro lado, testes com tempos de carregamento menores (cerca de 30min) a 37°C foram capazes de marcar a célula com o indicador. Ainda assim, mantivemos o tempo de carrega- mento longo (3 horas) com o objetivo de aumentar as chances dos dextranos serem armazena- dos em lisossomos, pois estudos mostraram que essas organelas são as principais vesículas que realizam exocitose dependente de Ca2+ em células não-secretoras (JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002; LI et al., 2015; REDDY; CALER; ANDREWS, 2001; RODRÍGUEZ et al., 1997) e que, após 3 horas, a maior parte dos dextranos fluorescentes co- localizavam com marcadores de lisossomos (JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002). Embo- ra não tenhamos realizado experimentos que verificassem a colocalização dos dextranos fluo- rescentes com o lúmen de vesículas, dada sua massa molecular relativamente alta, o único mecanismo plausível para explicar sua captação para o citoplasma é a endocitose. Além disso, dextranos são biologicamente inertes devido a suas ligações poli-(-(α-D-1,6-glucose) inco- muns, o que os torna resistentes à maioria dos processos endógenos de clivagem (ThermoFis- her Scientific, Waltham, MA, EUA), por isso são utilizados em estudos da via endocítica (JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002).
Pelo fato de a exocitose ser um fenômeno que se manifesta obrigatoriamente junto à membrana celular, a maioria dos trabalhos que a estudam utilizam microscopia de campo evanescente, também conhecida como microscopia de fluorescência por reflexão interna total (total internal reflexion fluorescence, TIRF), muitas vezes em conjunto com microscopia wi-
defield ou confocal. Uma vez que dispomos de um sistema de microscopia de fluorescência widefield, não esperávamos observar exocitose como uma contagem discreta de eventos, mas
sim como um sutil decréscimo na fluorescência causado pela liberação e dispersão do indica- dor fluorescente para o meio extracelular. Além do mais, como a quantidade de vesículas que realizam exocitose é muito pequena em relação ao total de vesículas no citoplasma, e as vesí- culas exocitadas costumam ser as que já estão próximas da membrana, principalmente as pró- ximas ao ponto de lesão (DAVENPORT et al., 2016; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002). Assim, uma análise com ROIs envolvendo as regiões de lesão parece ser imperativa
para tentar realçar esses eventos locais. Por isso, neste estudo, mantivemos a análise das ROIs voltadas aos eletrodos, locais onde se espera que ocorra maior dano na membrana. Também, visto que a variação da média de fluorescência esperada seria pequena, fizemos uma análise complementar através da medida do desvio padrão de fluorescência buscando refletir um pos- sível aumento na variabilidade da fluorescência associado a uma maior atividade no local após uma lesão.
Por fim, a exocitose, além de representar uma pequena parcela das vesículas, tam- bém parece levar várias dezenas de segundos para começar a ser detectada (BI; ALDERTON; STEINHARDT, 1995; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002). Por isso, acompanhamos as imagens por cerca de 2min após o evento, mas com o cuidado de evitar exposição excessiva à luz de excitação. O instante de aplicação do pulso de campo elétrico de alta intensidade não foi incluído na análise de imagens neste protocolo porque alguns testes que realizamos indica- ram ausência de variações da média de fluorescência nesse período em relação ao período pré-pulso e o artefato de movimento logo após o pulso seria a principal fonte da variabilidade do sinal.
Pela análise da Figura 39 e os resultados da análise estatística podemos notar que a única variável que teve diferença estatística foi ∆Fx para o fator tempo em todas as regiões. Esta variação era esperada em ambos os grupos, pois se deve ao desbotamento do indicador ao longo do tempo. Por sua vez, os resultados não apontaram diferença para os grupos expe- rimentais nem para interação entre os fatores. Se a taxa de exocitose aumentasse rapidamente após a aplicação do pulso subletal, seria esperado observar menores valores de ∆Fx, especial- mente na ROI do ânodo, o que seria destacado por uma diferença para o fator tratamento. De maneira análoga, se a taxa de exocitose aumentasse de maneira mais gradual, seria esperado uma taxa de diminuição maior em ∆Fx, o que seria apontado por uma diferença na interação entre os fatores. Como nenhuma dessas diferenças foi observada, presumimos que as varia- ções na taxa de exocitose não puderam ser detectadas em nosso sistema de fluorescência já que espera-se que apenas uma mínima parcela das vesículas próximas à membrana realize exocitose. Aliás, também é de se esperar que nem todas as vesículas que exocitam estejam carregadas com o indicador, de modo que uma parte das vesículas pode realizar exocitose sem que nosso sistema consiga detectá-las. Por fim, o número de amostras pode ser insuficiente para observação de um efeito sutil.
A análise complementar através de ∆𝐹𝑥𝜎 também não mostrou diferença em ne- nhuma ROI para nenhum fator de modo que variações na exocitose também não puderam ser detectadas por esta abordagem. Também não podemos excluir nesta análise a influência de
artefato de movimento, mesmo que diminuída com as capturas de dados dezenas de segundos após o pulso. A célula permanece certo tempo com oscilações mecânicas decorrentes do de- sequilíbrio da [Ca2+]i causada pela eletroporação. Enquanto poros não-seletivos permanecem na membrana e a mantém despolarizada, a [Ca2+]i se eleva devido ao influxo de Ca2+ por meio dos poros e à abertura de canais de Ca2+ dependentes de tensão no sarcolema, além da libera- ção de Ca2+ dependente de Ca2+ do RS por meio de canais receptores de rianodina. Ao mesmo tempo, Ca2+ é recaptado pela SERCA e é extrudido pelo trocador Na+/Ca2+ e pela ATPase de Ca2+ do sarcolema. Esse desequilíbrio da [Ca2+]i se reflete nas contrações mecânicas. A prin- cípio, o uso de uma solução extracelular sem Ca2+ poderia eliminar este artefato de movimen- to. Entretanto, a ausência de influxo de Ca2+ também inibiria a exocitose, que também é de- pendente de Ca2+ (REDDY; CALER; ANDREWS, 2001). Outra possiblidade seria utilizar um bloqueador de movimento, como BDM ou blebistatina (BOND et al., 2013). Porém deve-se ter cuidado para que a droga não interfira na atuação de proteínas motoras responsáveis na ancoragem e locomoção de vesículas.
Embora as evidências dos nossos resultados apontem para ausência na variação da taxa de exocitose, dada a vasta quantidade de evidências na literatura em diversos tipos celulares que apontam que a exocitose acompanha o selamento da membrana (DAVENPORT et al., 2016; JAISWAL et al., 2004; JAISWAL; ANDREWS; SIMON, 2002; MARTINEZ et al., 2000; REDDY; CALER; ANDREWS, 2001; RODRÍGUEZ et al., 1997) e a fraca sensibi- lidade de nosso método, consideramos pouco provável que cardiomiócitos não realizem tal mecanismo como resposta a dano na membrana. Mesmo assim, para elucidar a questão, acre- ditamos que seriam necessários experimentos que possibilitassem maior precisão na detecção de exocitose como uso de microscopia de campo evanescente com possível utilização de mar- cadores de membrana como FM 1-43 (DAVENPORT et al., 2016), ou outras estratégias de medida de exocitose, como por exemplo acompanhamento de variações de capacitância de membrana (LOLLIKE; LINDAU, 1999).
6 CONCLUSÕES
Este trabalhou realizou um estudo de quantificação dos efeitos da eletroporação em cardiomiócitos isolados por meio de várias abordagens com indicadores de fluorescência. Mostramos que a eletroporação pode ser inferida por meio de maiores variações da [Ca2+]i e por meio da manutenção do potencial de membrana em níveis próximos do zero. Desta forma, conseguimos visualizar variações espaciais desses sinais, em especial nas extremidades das células voltadas para os eletrodos, onde as [Ca2+]i locais se elevam de maneira mais pronunci- ada e assimétrica, com maior ganho na ROI do ânodo. O método de calibração utilizado foi capaz de demonstrar essas diferenças por meio da análise de Δ[Ca2+]
i e a análise do tempo de recuperação da fluorescência basal também resultou nas mesmas conclusões. No entanto, não foi observada diferença dessas variáveis em relação a orientação da célula.
Embora também tenhamos inferido a ocorrência de eletroporação por meio dos sinais de potencial de membrana, sua caracterização espacial não ficou bem determinada, provavel- mente em virtude do pequeno número de amostras obtido e da falta de um sincronismo mais preciso entre aplicação do pulso elétrico e captura de imagens. Ainda assim, a calibração ba- seada na amplitude do PA como referência resultou em valores de potencial condizentes com a ocorrência de eletroporação na maioria das ROIs (valores próximos de zero).
A ocorrência de exocitose também não foi observada em nosso sistema de microfluo- rimetria, provavelmente por falta de sensibilidade do sistema para capturar as variações sutis de fluorescência esperadas do protocolo utilizado.
Apesar disso, apresentamos neste trabalho diversos métodos de processamento de imagens de fluorescência e sinais biológicos, sendo alguns deles originais. Introduzimos um novo método de definição automática de ROIs baseado no formato celular e na igualdade das áreas das ROIs. Demonstramos que a aplicação de métodos de BSS em ROIs de imagens de fluorescência pode ser um importante e novo método para extrair sinais de amostras ruidosas. Além disso, as simulações permitiram selecionar as melhores combinações de métodos para recuperação do sinal biológico com menor erro. A aplicação desses métodos em amostras biológicas extraiu sinais, cujas características são condizentes com o fenômeno estudado, nes- te caso, PA cardíaco e eletroporação.
Esperamos que os resultados biológicos obtidos nesse trabalho possam auxiliar na compreensão da caracterização da eletroporação em cardiomiócito e na compreensão dos me- canismos celulares envolvidos no selamento do sarcolema após a lesão. Esperamos também
que os métodos de processamento de imagens e sinais introduzidos aqui possam servir como novas ferramentas para a extração de sinais de pequena amplitude de amostras ruidosas e que sirvam de inspiração para o melhoramento das técnicas de filtragem de sinais biológicos de imagens de fluorescência.
REFERÊNCIAS
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