3.3.1 Materiais e Métodos
O método se baseia numa máscara binária representando a célula e automatica- mente realiza segmentação em ROIs de aproximadamente mesmo tamanho e localizações, independentemente do formato ou orientação da célula. A Figura 11 ilustra a sequência apli- cada para uma imagem de cardiomiócito. Primeiramente, a máscara é alinhada automatica- mente na vertical através de rotação de imagem. Então, a máscara é dividida em duas regiões: uma região externa (contorno preto na Figura 11B) e uma região interna (contorno cinza claro na Figura 11B). Esta divisão é feita por meio de sucessivas operações morfológicas de erosão na máscara da célula até que a área se torne aproximadamente metade da área inicial. Deste ponto em diante, cada uma das regiões sofre um método de segmentação distinto.
Para a região externa, três contornos são definidos: o contorno externo (o mesmo contorno da célula alinhada na vertical, contorno preto na Figura 11B), um contorno mediano
(contorno cinza escuro na Figura 11B), e um contorno interno (o mesmo contorno da região interna, contorno cinza claro na Figura 11B). O contorno mediano foi obtido por meio da rea- lização de metade das erosões necessárias para atingir a região interna. O contorno mediano é dividido em segmentos de comprimento similar (pontos pretos sobre contorno mediano na Figura 11B), e um ponto inicial é selecionado (ponto azul na Figura 11B). Este ponto inicial é definido sempre da mesma forma como sendo na metade da máscara de célula no eixo hori- zontal e à direita no eixo vertical. A partir deste ponto, as coordenadas pertencentes aos con- tornos externo e interno com menor distância à ele (símbolos X cinza na Figura 11B) são se- lecionadas e interligadas (linha vermelha tracejada na Figura 11B), definindo o início da pri- meira ROI. Este procedimento é repetido em sentido anti-horário no início de cada segmento do contorno mediano. Desta forma, é como se a região externa fosse fatiada ao longo de seu contorno e, com isso, cada ROI externa é delimitada por linhas retas, pelo contorno externo e pelo contorno interno.
Para a região interna, a definição das ROIs é feita de cima para baixo e limitada pela área de cada ROI, que deve ser semelhante, como mostrado na Figura 11C por linhas vermelhas tracejadas. A única ressalva nesta etapa da divisão é que, com exceção de duas ROIs, a mais superior e a mais inferior, a área central é dividida ao meio (linha vertical trace- jada vermelha da Figura 11C) antes da definição das demais ROIs. A quantidade de ROIs, tanto da região interna quanto da externa, pode ser definida pelo usuário.
Por fim, todas as ROIs são rotacionadas de volta para a orientação original da máscara da célula. Aplicamos correlação de fase (KUGLIN; HINES, 1975) entre a máscara original e a máscara das ROIs conjuntas para corrigir qualquer eventual translação resultante da rotação inversa de cada ROI. Os códigos para o processamento dessas imagens foram de- senvolvidos em Python 3.6.4, usando as bibliotecas Numpy 1.14, SciPy 1.0, scikit-learn 0.19.1 e Matplotlib 2.1.2.
Figura 11: Etapas do método de segmentação em Regiões de Interesse (Regions of Interest, ROIs) padrão. A. Máscara de imagem de cardiomiócito. B. Contornos e segmentação da região externa. Contorno preto é o con- torno da máscara alinhada na vertical, contorno cinza claro é o contorno da região interna e contorno cinza escu- ro é o contorno mediano. Pontos sobre o contorno mediano determinam divisão em comprimentos de arco iguais, símbolos X sobre contornos externo e interno são as coordenadas de menor distância cartesiana aos pontos do contorno mediano, e linhas tracejadas vermelhas definem separação das ROIs externas. C. Contornos externo (preto) e interno (cinza claro). Linhas tracejadas vermelhas definem separação das ROIs internas.
3.3.2 Resultados
Apresentamos na Figura 12 os resultados finais da divisão das máscaras, cujo con- torno é destacado em amarelo, em ROIs apresentadas em diferentes cores e números. Embora o procedimento tenha sido projetado para lidar com células de formato elipsoidal, nós mos- tramos sua aplicação em imagens de outros dois tipos distintos de células como um teste de desempenho. Na Figura 12A temos a imagem do cardiomiócito cuja máscara foi a utilizada para explicar o método e na Figura 12B temos as ROIs resultantes da divisão. Mostramos nas Figura 12C e Figura 12D a aplicação a uma imagem de célula ameboide obtida com micros- cópio de contraste interferencial e nas Figura 12E e Figura 12F a aplicação em uma imagem de fluorescência de neurônio. Nesta última aplicação, alteramos as porcentagens de área da região interna e externa bem como a quantidade de ROIs na região interna.
Figura 12: Imagens de células com contorno sobreposto em amarelo e resultados da padronização das ROIs. A. Imagem de campo claro de cardiomiócito ventricular isolado com contorno da célula sobreposto em amarelo. B. Resultado da padronização da imagem do cardiomiócito em 32 ROIs. C. Imagem de célula ameboide (uma ima- gem de “Shinya Inoue (2011) CIL:11941, Dictyostelium discoideum, amoeboid cell. CIL. Dataset.”
(http://cellimagelibrary.org/images/11941), usada sob CC BY-NC-SA 3.0
(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/legalcode)) com contorno da célula sobreposto em amarelo. D. Resultado da padronização da imagem da ameba em 32 ROIs. E. Imagem de fluorescência de neurônio multi- polar de rato (“Tonya Anderson, Deanna Benson (2010) CIL:807, Rattus, multipolar neuron. CIL. Dataset.” (http://cellimagelibrary.org/images/807), domínio público) com contorno da célula sobreposto em amarelo. F. Resultado da padronização da imagem do neurônio em 24 ROIs.
3.3.3 Discussão
A padronização automática de ROIs é uma maneira rápida e morfologicamente coerente de produzir várias observações de sinal. Este procedimento é relativamente robusto ao formato da célula porque é baseado no próprio contorno celular e funciona até para forma- tos de célula bastante irregulares (Figura 12). Na literatura há programas que produzem ROIs de maneira automática baseados em gradientes da imagem (KAIFOSH et al., 2014). Nosso código difere no sentido de que faz uma divisão baseada na igualdade de áreas das ROIs cujo único embasamento na imagem original é a máscara da célula.
Se o único objetivo fosse dividir a máscara da célula em regiões de área igual, a maneira mais simples seria fatiar a máscara de cima a baixo ou da esquerda à direita. Tal mé- todo de fato diminui muito o tempo de processamento. Entretanto, esse fatiamento direto faz com que cada ROI perca seu propósito em representar um evento celular localizado, pois as faixas resultantes dessa divisão dificilmente melhor representariam a heterogeneidade do ci- toplasma que uma divisão mosaica (considere o resultado da divisão por fatiamento simples do neurônio na Figura 12E por exemplo). Além do mais, uma segmentação baseada no forma- to celular e que alinha as imagens antes da segmentação torna mais fácil agrupar e comparar dados de amostras distintas de um mesmo tipo celular. No entanto, um problema apresentado foi que, como revertemos a rotação ROI a ROI, alguns pixels dentro da máscara da célula não foram atribuídos a nenhuma ROI (pixels pretos dentro da imagem da célula na Figura 12B por exemplo). Isto ocorreu porque não foi implementada uma interpolação ou critério que os alo- casse em ROIs vizinhas. Mesmo assim, como pode ser observado, a quantidade de pixels em que isso ocorre é mínima em relação aos pixels alocados e acreditamos que dificilmente influ- enciariam nos resultados.
Este método tem várias limitações, começando pelo fato de que uma máscara ini- cial deve ser fornecida. Embora isso possa parecer um problema crítico, já existem na literatu- ra diversas técnicas que separam células do plano de fundo (MEIJERING, 2012). Além disso, dependendo da aplicação, uma definição manual pode ser suficiente. O método também é sensível a artefatos de movimento, pois as ROIs são estáticas. Fica claro que este método não é indicado para analisar células que se locomovem, como é o caso da ameba na Figura 12C. Tal exemplo foi apenas ilustrado para mostrar a capacidade do método em lidar com células de formato bastante irregular. Outra limitação é que, uma vez que a definição das ROIs é feita baseada apenas no formato da célula e na área das ROIs, o experimentador não tem controle específico sobre o local de criação das ROIs, o que pode resultar em algum sinal local termi- nar dividido em duas ou mais ROIs. Nesses casos, mudar a quantidade de ROIs ou suas áreas pode resolver o problema. Isto de fato foi feito na Figura 12F, pois como os dendritos/axônios contribuem significativamente para a área da região externa, tivemos que permitir uma área externa maior (área externa = 70% da área total) porque, de outra forma, alguns axô- nios/dendritos poderiam ter ficado divididos. Para compensar este aumento na área da região externa nós diminuímos a quantidade de ROIs internas para que elas ficassem com uma área maior. Ainda assim o resultado final termina com algumas ROIs apresentando áreas bem maiores que outras, mas ao menos elas são morfologicamente mais coerentes, pois cada um
dos maiores dendritos/axônios está representado por uma única ROI distinta. O método tam- bém tem um limite mínimo de 2 ROIs para a região externa e 4 ROIs para a região interna.
A maioria das outras limitações estão ligadas às limitações de se usar operadores morfológicos. Em primeiro lugar, o método foi desenvolvido para segmentar uma única célula isolada, sem células vizinhas ou outras células fora do plano focal. Desta forma, se a máscara fornecida contiver mais de um elemento ou representar dois elementos distintos, mas que es- tão conectados pela máscara, o método não funcionará. Em segundo lugar, se a resolução da imagem for muito baixa, o que significa que a máscara da célula é representada por uma pe- quena quantidade de pixels, as erosões morfológicas que inicialmente separam as regiões in- terna e externa irão inevitavelmente apagar totalmente a máscara e nenhuma divisão será fei- ta.
3.4 SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS PARA REMOÇÃO DE RUÍDO DE SINAIS