Análise de Imagens e Sinais

As dimensões da célula (comprimento e largura) e ângulo em relação às linhas de campo elétrico foram medidos pelo software de imagens ImageJ (ImageJ 1.50i, National Ins- titutes of Health, EUA, domínio público). A partir das dimensões celulares, do ângulo e de ET, calculamos a máxima variação de potencial transmembrana limiar (VTmáx) por meio das

equações descritas por Klee e Plonsey (1976). Essas medidas foram feitas a título de compa- ração de suas características com células utilizadas nos protocolos seguintes.

A Figura 24 resume as etapas realizadas pelo código de análise. Após a aquisição dos vídeos, uma máscara da célula foi desenhada baseada na imagem da célula em campo claro e sobreposta aos vídeos de fluorescência para verificar a correspondência de formato e a localização da máscara. Esta máscara foi usada como entrada para a padronização das ROIs com um total de 32 ROIs por célula. A partir daqui, o processamento foi diferente dependen- do do sinal a ser extraído.

O sinal de cada ROI teve seu desbotamento corrigido por ajuste de curvas por meio de uma função que resultasse no mínimo de ruído em instantes onde não havia presença sinal (intervalo de inatividade). Os intervalos onde o sinal está presente ou ausente foram de- terminados de maneira análoga às simulações, mas agora por precaução aumentamos o inter- valo de atuação do sinal de PA, que definimos como indo de 0,4s até 1s, e o intervalo de atua- ção do sinal correspondente à eletroporação foi definido como indo de 2,4s até o final do ví- deo.

Para os vídeos com PA, as funções usadas para correção de desbotamento foram a equação (5) e também as funções mostradas abaixo:

𝑃𝑏(𝑡) = −𝐶𝑡 + 𝐷 𝑃𝑏(𝑡) = 𝐴𝑒−𝐵𝑡_{− 𝐶𝑡 + 𝐷}

Além disso, foram fornecidas como entrada para o ajuste de curvas pontos fora do intervalo de atuação do sinal de PA, isto é, pontos antes de 0,4s e pontos depois de 1s, portan- to, usamos DBPC.

Para o vídeo com eletroporação, as funções usadas foram a equação (6) e a função abaixo:

𝑃𝑏(𝑡) = 𝐴𝑒−𝐵𝑡_{− 𝐶𝑡 + 𝐷 − 𝐸𝑢(𝑡 − 2.5)}

onde t é tempo, A, B, C, D e E são parâmetros a serem estimados pelo ajuste de curvas não-linear (exceto (7) que é um ajuste linear) e u(t-2.5) é a função degrau deslocada no tempo de 2,5s. Portanto, aqui utilizamos FDPC.

Após a correção de desbotamento, nós calculamos, para cada ROI, um sinal médio de PA por meio da média do sinal de PA do segundo vídeo com o sinal de PA do terceiro ví- deo, com o objetivo de amenizar o ruído. Já os sinais do primeiro vídeo foram apenas utiliza- dos para confirmar ausência de variações de sinal não condizentes com desbotamento ou ruí- do de disparo e não foram analisados além deste ponto. Em seguida, cada sinal de ROI com- pensado de desbotamento foi usado como uma observação de entrada para os algoritmos de

(7)

(9) (8)

BSS. Os parâmetros dos algoritmos foram m=1, n=32 e as mesmas wavelets das simulações, os quais foram selecionados focando principalmente em minimizar o Er_Amp. Para os sinais de PA, foi utilizado ICA e para os sinais de eletroporação foi utilizado wPCA. A seleção de componente foi feita automaticamente por meio da escolha da componente que apresentava maior energia no intervalo de atuação de sinal (ou maior módulo de somatório no caso sinal de eletroporação). SNR foi estimado computando a potência de cada sinal recuperado dividida pela potência do ruído obtida do intervalo de inatividade antes de BSS, mas após correção de desbotamento.

Figura 24: Diagrama de blocos representando as etapas da análise de imagens e processamento de sinais das ROIs dos vídeos associados às variações de potencial transmembrana. Dependendo do tipo de sinal a ser extraído (sinal de PA ou sinal de eletroporação), uma sequência distinta de métodos foi utilizada.

Os sinais filtrados das ROIs são médias de fluorescência em unidades arbitrárias (u.a.) representado uma proporção da contagem de fótons que atingem o sensor da câmera. O PA é um evento rápido, de variação de potencial conhecida e é esperado que apresente a mesma variação de potencial ao longo da célula considerando a frequência de amostragem atingida em nossos experimentos. Nós partimos dessa premissa para calibrar a amplitude do sinal de potencial de membrana, calculado a partir do sinal de fluorescência, e checar se o potencial transmembrana também varia de maneira similar ao redor da célula ou não após a aplicação de um campo elétrico de alta intensidade. Os valores do módulo de Vrepouso e da am- plitude do PA (PAAmp) foram definidos em 80mV e 120mV, respectivamente, obtidos da lite- ratura em experimentos de patch-clamp aplicados em cardiomiócitos isolados de rato adulto (BOUCHARD; CLARK; GILES, 1995; WATANABE et al., 1983). O potencial transmem- brana (V(j,t)) em cada ROI de número j foi calibrado de acordo com a seguinte equação:

V(𝑗, 𝑡) = (−(𝐹(𝑗, 𝑡) 𝑃𝐴⁄ 𝑝𝑖𝑐𝑜(𝑗)) ∗ 𝑃𝐴𝐴𝑚𝑝) − 𝑉𝑟𝑒𝑝𝑜𝑢𝑠𝑜

onde t é tempo, F(j,t) é o sinal de fluorescência relacionado à eletroporação em u.a. e PApico(j) é o módulo da máxima amplitude de PA em u.a. em cada ROI r. Esta conver- são levou a um sinal de potencial transmembrana calibrado para cada ROI, o qual tinha a mesma forma de onda, mas podia ter uma amplitude diferente dependendo da variação do sinal relacionado à eletroporação normalizado pela variação do sinal de PA.

3.5.2 Resultados

Na Figura 25 mostramos um exemplo de aplicação dos métodos de BSS em ima- gens de um cardiomiócito isolado, com os sinais de uma das ROIs, as correções de desbota- mento, a aplicação de BSS e a o resultado da padronização das ROIs com a calibração em escala de cores. Mostramos na Figura 25A as curvas cinzas claras que são as médias espaciais de fluorescência obtidas da ROI destacada em branco na Figura 25C. Os gráficos à esquerda nas Figura 25A e Figura 25B e a Figura 25C foram gerados a partir dos vídeos para o sinal PA, e os gráficos à direita nas Figura 25A e Figura 25B e a Figura 25D foram gerados a partir do vídeo com a estimulação de alta intensidade, que gerou variações condizentes com a ele- troporação. Também mostramos no gráfico à esquerda da Figura 25A o melhor ajuste de cur- vas (DBPC, curva tracejada azul-clara) dada pela equação (8), e no gráfico à direita o melhor ajuste de curvas (FDPC) feito pela equação (9) com o degrau (curva tracejada verde-clara) e

sem ele (curva ponto-tracejada verde-escura). Esta última é a curva que é subtraída dos dados para corrigir o desbotamento.

Na Figura 25B mostramos os dados ruidosos com desbotamento compensado (curvas cinzas claras), e o resultado dos sinais recuperados a partir de alguns métodos de BSS, com a SNR estimada acima dos gráficos. Nesta célula, a SNR estimada para o sinal do PA permaneceu entre -8,92dB e 5,36dB, com uma média de -0,42dB. Quantificamos a eliminação de ruído pelos algoritmos em relação às observações ruidosas: ICA reduziu a presença do ruído por uma média de 14dB enquanto wICA reduziu, em média, 11,4dB. A SNR estimada para o sinal de eletroporação ficou entre -4,67dB e 9,74dB com uma média de 3,93dB. PCA reduziu a presença do ruído por uma média de 14,2dB enquanto wPCA eliminou o ruído, com uma redução média de 34,2dB.

Na Figura 25C mostramos todas as ROIs geradas pela padronização de ROIs pre- enchidas com escala de cores correspondendo à amplitude do potencial de membrana naquele instante de tempo. Três instantes de tempo foram escolhidos para mostrar a variação do PA: antes do PA (Figura 25C, imagem da esquerda), no pico do PA (Figura 25C, imagem central) e no plateau do PA (Figura 25C, imagem da direita). Esses resultados são de calibração usan- do ICA e o pico do PA foi de 40mV, o que já se sabia porque vem do valor definido de PAAmp obtido da literatura. Além disso, as ROIs apresentam a mesma amplitude porque o sinal de fluorescência de cada ROI é normalizado pelo próprio pico de fluorescência. Medimos a du- ração em 25% e 75% da repolarização (APD25 e APD75, respectivamente), obtendo neste exemplo APD25=35,8ms e APD75=251ms. Por fim, na Figura 25D mostramos o potencial de membrana da mesma forma para o vídeo com aplicação do pulso de alta intensidade filtrado usando wPCA. Mostramos o potencial de membrana das ROIs antes do pulso (Figura 25D, imagem da esquerda), no instante de pico do sinal de eletroporação (Figura 25D, imagem cen- tral) e certo tempo após a aplicação do pulso (Figura 25D, imagem da direita).

Figura 25: Exemplo de aplicação da calibração de potencial de membrana. Gráficos em A e B correspondem à média do sinal da ROI destacada em branco em C. Gráficos à esquerda correspondem ao vídeo de aplicação de estímulo elétrico de baixa intensidade (sinal de PA) enquanto gráficos à direita correspondem ao vídeo de apli- cação de pulso elétrico de alta intensidade (sinal de eletroporação). A. Aplicação dos métodos de correção de desbotamento. Curvas em cinza são os sinais captados na ROI, pontos azuis escuros são os dados de entrada para os métodos de correção de desbotamento, curva tracejada azul clara é a correção de desbotamento por meio de DBPC, curva tracejada verde clara é a saída do ajuste de curvas por FDPC e a curva ponto-tracejada verde escu- ra também é a correção por meio de FDPC (saída do ajuste de curvas), mas sem o degrau. B. Aplicação dos métodos de BSS. Curvas em cinza são os sinais captados corrigidos de desbotamento, curva azul é o sinal de PA recuperado por meio de ICA, curva tracejada verde clara é o sinal de PA recuperado por meio de wICA, curva vermelha escura é o sinal de eletroporação recuperado por meio de PCA e curva tracejada laranja é o sinal de eletroporação recuperado por meio de wPCA. Acima dos gráficos estão as SNR estimadas. C. Potencial de membrana em escala de cores nas ROIs da célula em três instantes do vídeo de estimulação de baixa intensidade: antes do estímulo (esquerda), no pico da resposta ao estímulo (centro) e certo tempo após o pico (direita). Os instantes de tempo estão indicados no canto superior direito de cada imagem. D. Potencial de membrana em escala de cores nas ROIs da célula em três instantes do vídeo do pulso elétrico de alta intensidade: antes do pulso (esquerda), no pico da resposta ao pulso (centro) e certo tempo após o pico (direita).

A Figura 26 é semelhante à Figura 25, mas para um exemplo de célula onde o ruí- do era bastante pronunciado na maioria das ROIs em relação aos sinais. Nestes casos onde a SNR é muito baixa, o sinal de PA nem pôde ser recuperado pelos métodos de BSS (regiões azul-escuras em Figura 26C) e a calibração fica comprometida, atingindo os valores de 1V e 3,1V, muito pouco prováveis de ocorrer e incompatíveis com a amplitude do pulso aplicada. Além disso, em ROIs onde ele pôde ser recuperado, mas estava muito contaminado por ruído, como mostrado pelo gráfico da esquerda na Figura 26B, os resultados da calibração também ficam menos confiáveis, uma vez que as simulações indicaram erros de cerca de 80% e menor correlação (Figura 19A, C e D). O SNR médio nesta célula foi -15,64dB para o sinal de PA e -7,21dB para o sinal de eletroporação. Para evitar esse tipo de interferência na análise, estabelecemos um limite mínimo de SNR nas ROIs de -10dB para o sinal de PA e de -12,5dB para o sinal de eletroporação. Estes limites mínimos de confiabilidade foram escolhidos baseados nas simulaçoes de Er_Amp com o objetivo de limitar o erro relativo médio em menos de 10% para os algoritmos utilizados (ICA em Figura 19D e wPCA em Figura 19E).

Na Tabela 1 mostramos as características das células onde a maioria das ROIs atingiu SNR maior que os limites definidos. Os valores correspondem a médias ± erros pa- drões da média.

Tabela 1: Características das células do protocolo de medida da variação do potencial transmembrana. Compri- mento, largura, amplitude de campo elétrico limiar (ET) e potencial transmembrana máximo calculado (ΔVTmáx). N é o número de células. Os valores correspondem a média ± erro padrão da média.

Longitudinal (N=4) Comprimento (m) 140,09 ± 7,48 Largura (m) 38,78 ± 2,58 ET (V/cm) 2,67 ± 0,14 VTmáx (mV) 20,01 ± 0,34

Figura 26: Exemplo de aplicação da calibração de potencial de membrana quando SNR é muito baixa. Gráficos em A e B correspondem à média do sinal da ROI destacada em branco em C. Gráficos à esquerda correspondem ao vídeo de aplicação de estímulo elétrico de baixa intensidade (sinal de PA) enquanto gráficos à direita corres- pondem ao vídeo de aplicação de pulso elétrico de alta intensidade (sinal de eletroporação). A. Aplicação dos métodos de correção de desbotamento. Curvas em cinza são os sinais captados, pontos azuis escuros são os da- dos de entrada para os métodos de correção de desbotamento, curva tracejada azul clara é a correção por meio de DBPC, curva tracejada verde clara é a saída do ajuste de curvas por FDPC e a curva ponto-tracejada verde escu- ra também é a correção por meio de FDPC (saída do ajuste de curvas), mas sem o degrau. B. Aplicação dos métodos de BSS. Curvas em cinza são os sinais captados corrigidos de desbotamento, curva azul é o sinal de PA recuperado por meio de ICA, curva tracejada verde clara é o sinal de PA recuperado por meio de wICA, curva vermelha escura é o sinal de eletroporação recuperado por meio de PCA e curva tracejada laranja é o sinal de eletroporação recuperado por meio de wPCA. Acima dos gráficos estão as SNR estimadas. C. Potencial de membrana em escala de cores nas ROIs da célula em três instantes do vídeo de estimulação de baixa intensidade: antes do estímulo (esquerda), no pico da resposta ao estímulo (centro) e certo tempo após o pico (direita). Os instantes de tempo estão indicados no canto superior direito de cada imagem. D. Potencial de membrana em escala de cores nas ROIs da célula em três instantes do vídeo do pulso elétrico de alta intensidade: antes do pulso (esquerda), no pico da resposta ao pulso (centro) e certo tempo após o pico (direita).

Na Figura 27, as imagens de células à esquerda são o resultado da padronização de ROIs sobrepostas à imagem da célula em campo claro e as imagens à direita são imagens de fluorescência com potencial de membrana de cada ROI mostrado em escala de cores (limites da escala diferentes daquele das Figura 25 e Figura 26) a cerca de 500ms após a aplicação do pulso de alta intensidade. Note que a Figura 27A à direita é o mesmo resultado mostrado na Figura 25D mais à direita, sendo que as cores não são as mesmas nas ROIs porque os limites da escala de cores não é o mesmo.

Figura 27: Imagens em campo claro de cardiomiócitos (com ROIs sobrepostas em amarelo) à esquerda e ima- gens de fluorescência com potencial de membrana em escala de cores ~500ms após a aplicação de pulso de alta intensidade à direita. Uma imagem de fluorescência sem sobreposição com escala de cores é mostrada em A e ROIs que apresentaram relação sinal-ruído muito baixa (SNR < -10dB) não são mostradas na escala de cores. A. Resultado de célula #1. B. Resultado de célula #2. C. Resultado de célula #3. D. Resultado de célula #4.

Para melhor visualização, na Figura 27A, na imagem ao centro, mostramos uma imagem de fluorescência sem sobreposição de ROIs. As ROIs onde SNR não atingiu o limite mínimo de confiabilidade, seja no sinal de PA ou no sinal correspondente à eltroporação, não são mostradas para evitar atrapalhar a visualização e interpretação dos resultados mais confiáveis. Nas ROIs mostradas, a SNR estimada para o sinal de PA ficou entre -9,98dB e 5,36dB, com uma média de -3,55dB, e a SNR estimada para o sinal correspondente à eletroporação ficou entre -9,87dB e 9,74dB, com média de 1,97dB. Os parâmetros do PA para essas células foram APD25 = 47 ± 12ms e APD75 = 143ms ± 38ms (média ± erro padrão da

média). Nessas células, o valor máximo de potencial de membrana no pico foi de 157mV (máximo de todas as ROIs de todas as células da Figura 27) e após isso se manteve em 95mV e ocorreu na célula da Figura 27B.

3.5.3 Discussão

O circuito sincronizador e o shutter automático funcionaram de acordo com o programado e permitiram a realização do protocolo experimental com mínimo tempo de ex- posição das células à luz de excitação. Com ele, a exposição foi de no máximo 5s num mesmo vídeo e de um máximo total de 30s (tempo dos vídeos somados mais exposições para ajustes de foco). Isto amenizou os efeitos fototóxicos, pois não observamos oscilações mecânicas (em testes sem blebistatina) nem hipercontratura celular quando expusemos as células carregadas com RH-237 à luz de excitação. Junto a isso, em nenhum vídeo onde usamos blebistatina foi observado movimento da célula, confirmando que o bloqueio de movimento foi total. Ainda assim, não descartamos a possibilidade de que espécies reativas de oxigênio tenham sido ge- radas durante os experimentos e causado distorções nas formas de onda do PA (SCHAFFER et al., 1994). Uma estratégia para diminuir a ação destes elementos é utilizar catalases (SCHAFFER et al., 1994) ou antioxidantes como vitaminas (tocoferol, ácido ascórbico e ou- tros, Warren et al., 2010).

Analisando as variações de fluorescência dos estímulos de baixa intensidade (ΔF/Fest = (Fest - F0)/F0 ) da célula inteira, onde F0 é a fluorescência em repouso e Fest é a flu- orescência no pico da estimulação de baixa intensidade, notamos que elas foram pequenas (ΔF/Fest = 0,034 ± 0,002; média ± erro padrão da média) e o ruído se tornava mais pronuncia- do ao analisar os sinais de ROIs, o que foi a motivação para a utilização de BSS para separar os sinais dos ruídos.

A correção de desbotamento foi eficiente, o que pode ser verificado pela linha de base horizontal nos intervalos de inatividade (Figura 25B e Figura 26B). Sabe-se que o desbo- tamento é melhor modelado por mais de uma função exponencial (SONG et al., 1995) porém usar ajuste de curvas não-linear com duas exponenciais levou várias vezes em falha na con- vergência, portanto, aproximamos uma delas para uma função linear enquanto mantivemos a outra exponencial, como mostrado nas equações (8) e (9). Esta função acabou se mostrando melhor do que as correções por uma única exponencial, como nas equações (5) e (6), ou pu- ramente lineares, como na equação (7), pois os resíduos do ajuste de curvas pelas equações

(8) e (9) foram sempre menores ou iguais àqueles pelas funções exclusivamente exponenciais (equações (5) e (6)) ou exclusivamente linear (equação (7)).

Dadas as diferentes características dos sinais celulares, com o PA sendo um sinal transitório e o sinal de eletroporação sendo não-transitório (ao menos dentro da duração dos nossos experimentos), não pudemos adotar a mesma correção de desbotamento para ambos. Usar DBPC para o sinal de eletroporação distorceria o deslocamento de amplitude, pois a fun- ção decrescente seria modelada cruzando o degrau aproximadamente na metade. Ao mesmo tempo, para implementarmos FDPC no sinal de PA, precisaríamos de uma descrição matemá- tica do sinal de PA, o que iria não apenas introduzir vários parâmetros extras no ajuste não- linear, como também tornaria a utilização de BSS inútil uma vez que sua principal vantagem é a capacidade de separar sinais cujas características não sabemos a princípio. Mesmo com suas pequenas diferenças, DBPC e FDPC parecem conseguir cumprir o mesmo objetivo de corrigir o desbotamento de maneira satisfatória, uma vez que a linha de base do sinal quando a célula está em repouso (intervalo de inatividade) é aproximadamente horizontal.

Todos os métodos de BSS diminuíram o ruído, especialmente ICA e PCA para o sinal de PA e wPCA para o sinal de eletroporação. Isto está de acordo com nossas simulações, pois dentro da faixa de SNR estimada do sinal de PA (-9,98dB a 5,36dB) ICA e PCA geral- mente produziram Er_Amp menores que os métodos compostos com wavelets (Figura 19D) e, na média estimada de -3,55dB, eles também apresentam menor RMSE (Figura 19A) do que algoritmos com wavelets. Para a faixa de SNR estimada do sinal de eletroporação (-9,87dB a 9,74dB), Er_Amp é quase indistinguível entre todos os algoritmos de BSS (Figura 19E) e, na média de 1,97dB, RMSE foi menor para métodos com wavelets do que métodos sem elas (Figura 19B). Estes resultados reforçam nossa confiança na escolha dos métodos utilizados para a análise dos dados de células.

Entretanto, vimos que nenhum dos métodos é capaz de eliminar completamente o ruído e acertar a amplitude de sinal corretamente todas as vezes, especialmente quando SNR é menor. Baseado nas nossas simulações e nas SNR estimadas dos experimentos, podemos infe- rir por quanto estaríamos errando o verdadeiro valor. Supondo que erramos PApico da equação (10) pelo pior caso de Er_Amp. A pior SNR estimada para o PA nas ROIs analisadas foi ≈-10dB (-9,98dB). Ao olharmos para Er_Amp de ICA com essa SNR (Figura 19D), temos o valor Er_Amp = -4,68% ± 1,98%, o que significa que podemos esperar a média verdadeira como sendo, no pior caso, -6,66% (Er_Amp1). Apesar disso, a correção de desbotamento por DBPC não pareceu afetar ICA (Figura 22A, barra azul clara vs barra preta em ICA), então não vemos necessidade de adicionar propagação de erros aqui. Vamos supor também que erramos o sinal de fluores-

cência para eletroporação F pelo pior Er_Amp. Nas ROIs analisadas, o pior SNR estimado para o sinal de eletroporação foi também de ≈-10dB (-9,87dB). Olhando para wPCA (Figura 19E), nós temos Er_Amp = 1,81% ± 2,90%, o que significa que a média verdadeira é esperada estar, no pior caso, em 4,71% (Er_Amp2). A correção de desbotamento para wPCA usando FDPC também não diferiu do processamento dos dados sem desbotamento (Figura 22C, barra verde

vs barra preta em wPCA).

Então, se substituirmos PApico da equação (10) por (1 – Er_Amp1)*PApico* onde PApi-

co* é o valor verdadeiro da amplitude do PA, e substituirmos F por (1 – Er_Amp2)*F* onde F* é o valor verdadeiro do sinal de fluorescência de eletroporação, podemos estimar o valor verda- deiro do potencial de membrana V* em função dos erros relativos, por meio da equação abai- xo:

V(𝑗, 𝑡)∗ _{= (}1 + 𝐸𝑟_𝐴𝑚𝑝1

1 + 𝐸𝑟_𝐴𝑚𝑝2) 𝑉(𝑗, 𝑡) + (

𝐸_{𝑟_𝐴𝑚𝑝1}− 𝐸_{𝑟_𝐴𝑚𝑝2}

1 + 𝐸𝑟_𝐴𝑚𝑝2 ) 𝑉𝑟𝑒𝑝𝑜𝑢𝑠𝑜

Por fim, substituindo os valores de Er_Amp1, Er_Amp2 e Vrepouso em (11) chegamos a: V(𝑗, 𝑡)∗ _{= 0,89𝑉(𝑗, 𝑡) − 8,69}

Isto significa que, para as piores SNR analisadas em nossos resultados, o valor verdadeiro do sinal de potencial de membrana pode ser cerca de 11% menor que nossos resul-