Os experimentos foram realizados num sistema de microfluorimetria desenvolvi- do no CEB/UNICAMP (ZOCCOLER; OLIVEIRA, 2015), o qual possibilita obter imagens de fluorescência de células depositadas em uma câmara de perfusão e estimuladas por pulsos de campo elétrico uniforme. O fato do indicador de potencial de membrana RH-237 apresentar pequena variação do sinal e fototoxicidade acentuada fez com que precisássemos adaptar nos- so sistema de microfluorimetria para conseguir realizar os experimentos com este indicador e desenvolver um método de processamento de imagens e sinais mais robusto para extrair os sinais de potencial de membrana.
O sistema de microfluorimetria contava anteriormente com um shutter manual, o que inviabilizava a execução dos experimentos com curta exposição das células à luz de exci- tação. Realizamos alguns testes onde observamos que a longa e contínua exposição à luz de excitação (1-2min) causava oscilações mecânicas e, eventualmente hipercontratura celular, especialmente quando essa exposição prolongada era acompanhada de estimulação elétrica. Este efeito também se acentuava quando utilizamos concentrações de RH-237 de 5 a 10μM. Entretanto, este efeito não foi observado na exposição à luz de excitação de células não carre- gadas com RH-237, assim como não foi detectado em células carregadas com RH-237 não expostas à luz de excitação, semelhante a relatos com cardiomiócitos de cobaia carregados com o indicador potenciométrico di-4-ANEPPS (WINDISCH et al., 1995).
Por isso, substituímos o shutter manual por um automático e construímos um cir- cuito sincronizador capaz de interligar os sinais do estimulador elétrico, do shutter automático e da câmera (mod Ixon-3, Andor Technology, Belfast, Reino Unido). As modificações do sistema estão ilustradas em contorno vermelho na Figura 7. Os filtros óticos foram substituí-
dos por parte do conjunto Zeiss Filter Set 00 (excitação BP 530-585nm; espelho dicróico FT 600nm) com filtro de emissão 600-670nm.
Figura 7: Diagrama do sistema de microfluorimetria com modificações destacadas em vermelho.
3.2.1 Shutter Automático
O shutter automático foi obtido de um microscópio desativado. Trata-se de um obturador de 5 lâminas da marca COPAL com 4 fios: 2 para comando de abertura e fecha- mento das lâminas feito por meio da magnetização de bobinas internas, e outros 2 para averi- guar a configuração do mesmo entre aberto ou fechado. Uma foto do shutter automático é mostrada na Figura 8.
Com o shutter aberto, medimos a potência luminosa entregue à amostra por meio de sensor fotodiodo (OPT101, Texas Instruments) posicionado no charriot do microscópio no plano focal da objetiva 40x (40/0.75 160/0.17, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e obtive- mos uma densidade de potência luminosa de 380mW/cm2. Esta potência é maior do que outro trabalho com exposição à laser (38mV/cm2, WARREN et al., 2010), mas menor que outro com lâmpada halógena 100W, a mesma utilizada em nosso microscópio (≈1W/cm2, WINDISCH et al., 1995). O valor é aproximadamente nulo com o shutter fechado, indicando que o shutter utilizado consegue bloquear completamente a luz de excitação.
3.2.2 Circuito Sincronizador
O circuito sincronizador foi projetado com o objetivo de realizar a abertura do
shutter momentos antes do início da gravação de imagens pela câmera e esta, por sua vez,
necessitava capturar uma certa quantidade de imagens antes da aplicação do estímulo elétrico na célula para que posteriormente pudesse ser feita correção de desbotamento. O circuito também precisava garantir que o shutter seria fechado apenas após o fim da aquisição das imagens. O comutador (Figura 7), cuja função é definir qual dos estimuladores elétricos envia seu sinal para a câmara de perfusão, produz um sinal de sincronismo positivo de 5V de mes- ma duração e na mesma frequência do estimulador de baixa intensidade. Este sinal, original- mente usado como trigger externo do estimulador de alta intensidade, foi utilizado como o sinal de referência para o circuito sincronizador, pois trata-se de um sinal sincronizado com o estimulador de baixa intensidade (trigger do estimulador).
O circuito é composto basicamente de dois elementos: um microcontrolador PIC16F628A e um driver L293E e está mostrado no Anexo B. As entradas do circuito sincro- nizador são: o trigger do estimulador; o sinal camera fire, uma saída da câmera que indica o instante em que a câmera grava cada imagem; o status do shutter (aberto ou fechado); e al- guns botões e chaves, dentre eles o botão SET que, quando pressionado, determina o início de uma sequência de aquisição de imagens. As saídas do circuito são: o sinal camera trigger, uma entrada da câmera que permite definir externamente o instante do início da gravação; o sinal de abertura do shutter (shutter open); e o sinal de fechamento do shutter (shutter close). Os outros botões e chaves do circuito são um botão CANCEL para cancelar o início da se- quência, uma chave para alternar entre shutter manual e automático (auto/manual) e uma
chave que envia comando direto para abertura ou fechamento do shutter (manual open/close) se a chave auto/manual estiver na opção manual.
A Figura 9 mostra os principais sinais atuantes na sequência de aquisição automá- tica e seus sinais foram medidos diretamente do circuito por meio de um osciloscópio. O eixo do tempo foi deslocado para que seu início coincidisse com o início da gravação do vídeo. Primeiro, o microcontrolador aguarda até que o botão SET seja pressionado (Figura 9B), o que indica o início do protocolo de aquisição automática. Após isso, o microcontrolador aguarda o próximo sinal de sincronismo (sinal sincronizado com o estimulador de baixa inten- sidade, Figura 9A) e, ao detectá-lo, aguarda 1136ms e envia o sinal Camera Trigger (Figura 9C). O sinal para a câmera é enviado antes da abertura do shutter, pois há um atraso de 364ms entre o recebimento do trigger pela câmera e o início da gravação de imagens. Então, 100ms antes do início da gravação, o microcontrolador envia um sinal de abertura do shutter (Shutter
Open, 5V, 30ms, Figura 9D), o qual leva cerca de 19,3ms para abrir completamente (medido
pelo canal Shutter Status, Figura 9E). A abertura do shutter é confirmada pela transição da entrada Shutter Status. Exatos 1,5s após o sinal do estimulador, o vídeo começa a ser gravado, o que pode ser visto pelas transições de sinal da entrada Camera Fire (Figura 9F). A duração do vídeo deve ser pré-definida no programa da câmera e, através de Camera Fire, o micro- controlador calcula a taxa de aquisição média e aguarda até que a aquisição termine. Isto é feito quando ele não detecta mais transições em Camera Fire pelo dobro do tempo da taxa de aquisição (indicativo de que o canal ficou inativo). Por fim, ele envia o sinal de fechamento do shutter (Shutter Close, 5V, 30ms, Figura 9G), o qual leva cerca de 12ms para fechar com- pletamente (medido com fototransistor posicionado no centro do shutter).
Figura 9: Sinais do circuito sincronizador. A. Sinal do estimulador de baixa intensidade. B. Sinal do botão SET. C. Sinal camera trigger. D. Sinal shutter open. E. Sinal shutter status. F. Sinal camera fire. G. Sinal shutter close.
O circuito final foi impresso em placa e montado dentro de uma caixa chamada unidade de controle de shutter, como mostrado na Figura 10. O código para o microcontrola- dor foi feito em C no programa MPLAB X IDE utilizando interrupções e timers do microcon- trolador e foi incluído no Anexo C.
Figura 10: Painel e interior do circuito sincronizador