R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T ro p ic a l 2 1 ( 1 ) : 1-6. J a n - M a r , 1 9 8 8
E D I T O R I A L
A S T É C N I C A S D E I M U N O P E R O X I D A S E
N O E S T U D O D A E T I O L O G I A
D A S D O E N Ç A S
I N F E C T U O S A S E P A R A S I T Á R I A S
N a d é c a d a de 4 0 , q u an d o a Im u n o lo g ia se o r g an iza v a febrilm ente com o ciên c ia e su rg iam os p ri m eiros co n h ecim en to s sobre o s m e can ism o s im uno- lógicos d e algum as d o en ças, ap a re c e ra m n a lite ra tu ra os p rim eiro s rela to s d e A lb e rt H . C o o n s sobre a m ar c a ç ã o de an tico rp o s co m p ro d u to s fluo rescen tes e su a u tiliza çã o n a d e te c ç ã o de antígenos no tecid o . E m 1 9 5 0 , C o o n s 10com p leto u seus estu d o s so b re e s s a pro m is so ra tecnologia, in au g u ra n d o a Im uno cito q u ím ica, u m nov o ca m p o d en tro d a Im unologia. D e p o sse d e s sa n o v a ferra m en ta, a Im u n o lo g ia desvencilh o u -se das fro n teiras v ascu la re s e esten d eu -se d efinitivam ente aos tecid o s e seus co m ponentes. A ssim , am pliou-se q u alita tiv a m en te o arse n a l d a P ato lo g ia que, até en tão, se u tiliza v a a p e n as d e co lo raçõ es in específicas p a r a a an álise histo p ato ló g ica. C o m o co n seq ü ên cia, a defi n iç ão d a etiologia de m u itas d o en ças, até e n tão av alia d as só em p iricam en te, p a s so u a ser apen as u m a q u es tã o de tem po.
A p e s a r de to d a a co n trib u içã o d a im unofluores- cên cia, e s sa té c n ic a m o stro u -se b a s ta n te lim ita d a p a ra u m grande n ú m ero de finalidades, em v irtu d e d e vá rias ca ra c te rístic a s p ró p ria s do m étodo, en tre elas: dis to rçõ es d a im agem em itid a d ec o rre n tes d e dificulda des de ajuste d a ilu m in aç ão do ca m p o e d a a b so rç ão lu m in o sa p elo conjugado; lim itaçõ es d o an tico rp o con ju g a d o q u an to à solu b ilid ad e e rea tiv id a d e específica;
o c u rto p erío d o d e tem p o p erm itid o à análise ad e q u a d a das p re p a ra ç õ e s em v irtu d e do d ecaim en to ráp id o d a flu o re sc ên cia em itida. A d e m a is, dev em ser citados fato res que in terferem co m a esp ecificidade do m éto do, co m o au to flu o rescên cia, re a ç ã o do te cid o co m o fluorocrom o n ã o conjugado, além d a im possibilidade de se u s a r tecid o s fix ad o s a d e q u ad a m e n te, p ro ce sso in d isp en sáv el p a ra p re se rv a ç ã o d a m orfologia. A c re s cen tam -se, finalm ente, os eq u ip am en to s rela tiv a m en te c a ro s n ec essário s p a ra a m o n tag em a p ro p ria d a de to d a a tecnologia.
A p a r tir d a d é c a d a de 6 0 , d esenvolveu-se a u tiliza çã o de en zim as m a rc a d o ra s ligadas ao an tico r po co v a len tem en te ou atrav és de p o n te s n atu ra is, ao invés d os com p o sto s flu o rescen tes. O sítio d a en zim a era, p o sterio rm en te, rev e lad o atra v és d e m é to d o his- toqu ím ico co m o auxílio d e u m núm ero relativ am en te grande de p ro d u to s coloridos q u e se d ep o sita m n o lo cal d a rea ção . C o n v é m le m b rar de dois req u erim en to s b ásico s in eren tes a d e te rm in a d a en z im a q ue se d eseja
R e c e b id o p a ra p u b lic a ç ã o e m 1 5 /1 2 /8 7
I M M U N O P E R O X I D A S E T E C H N I Q U E S
I N T H E S T U D Y O F T H E E T I O L O G Y O F
I N F E C T I O U S A N D P A R A S I T I C
D I S E A S E S
A lb e rt H . C o o n s w as o n e o f the first to re p o rt o n th e lab elin g o f an tib o d ies w ith flu o re sc en t d yes an d th e ir u tilizatio n to th e d etec tio n o f antigens in tissues. T h a t h a p p e n e d in th e fourties w h en Im m unology w as getting feverishly o rg an iz ed as a scien ce an d th e first initial rep o rts on im m unologic path o g en esis o f som e d iseases ap p e a re d in th e literatu re . I n 19 5 0 C o o n s 10 fin ish ed his stu d ies w ith this p rom ising technology, getting s ta rte d th e Im m u n o c y to ch e m istry , a new b ra n c h o f Im m unology. W ith this new to o l Im m u n o logy w e n t b e y o n d th e b lo o d v essel frontiers and re a c h e d th e tissu es a n d th e ir co m ponents. T h e old n on-specific h isto p ath o lo g ic stain s w ere im proved w ith m o re so p h istica te d reso u rce s. A s a co n seq u en ce th e definition o f th e etiology o f several d iseases b y th e n , o n ly know n em p irically , w as sim ply a m a tte r o f tim e.
I n sp ite o f th e g re a t co n trib u tio n o f im m unofluo rescen ce, this te ch n iq u e is to o lim ited b y its ow n p ecu liarities. S om e o f th e m are: d isto rtio n s o f th e im age due to difficulties in th e ad ju stm e n t o f the field illum ination an d light ab so rp tio n b y th e co njugate as w ell a s specific rea ctiv ity and solubility o f th e an tib o d y conjugate; the sh o rt length o f tim e useful for ad e q u ate an aly sis o f the p re p a ra tio n due to th e q u ick d e c a y o f th e em itted fluo- recence. T h e se are also som e fac to rs w hich in terfere w ith the m e th o d su ch as au to -flu o resc en c e and re a c tio n o f th e unconju g ated flu o ro ch ro m e w ith th e tissue, an d im possibility o f its u se w ith fixed tissu e w hich is c ritical fo r th e m orp h o lo g y p reserv atio n . B esides, equ ip m en ts o f high c o s t are required.
his-E d ito r ia l. B a r b o s a , A lfr e d o J A . A s té c n ic a s d e im u n o p e r o x id a s e n o e s tu d o d a e tio lo g ia d a s d o e n ç a s in f e c tu o sa s e p a r a s i tá r i a s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 1 : 1 - 6 , J a n - M a r , 1 9 8 8
u tilizar com o m a rc a d o r em h istoquím ica: o p ro d u to d a re a ç ã o en z im á tic a deve s e r i n s o l ú v e l e v i s í v e l . A pero- x id ase, u m a d a s en zim as m ais u tiliza d as p a ra essa finalidade, reag e co m seu su b stra to , o p eró x id o de hi drogênio, resu ltan d o n a o x id a çã o de seu grupo prosté- tic o hem e e fo rm an d o u m “ com plexo p rim á rio ” . N a p re se n ç a de u m a te rc e ira su b stân cia d o a d o ra de elé tro n s, o “ com plexo p rim á rio ” d isso cia-se reg en eran do a p ero x id a se a seu esta d o red u zid o e lib e ran d o o
d o a d o r d e e l é t r o n s o x id a d o que s e p o lim eriza e preci-
p ita -se no lo cal d a re a ç ã o . U m a d a s su b stân cias m ais u tiliza d as p a r a a d etec çã o h isto q u ím ica d a p e ro x id a se é a 3 ,3 -d iam in o b en zid in a, p rim eiram en te u tiliza d a com esse objetivo em 1 9 6 6 12. A diam in o b en zid in a o x id a d a fo rm a u m p olím ero in ten sam en te colorido (m arro m escu ro ) e altam en te insolúvel, p o d en d o as p re p a ra ç õ e s h istológicas ser d e s id ra ta d a s em álcool, d ia fa n iza d as em xilol, m o n ta d a s em b álsam o o u equi v alen te e ex a m in a d as p o sterio rm en te. E s s a s p ro p rie d ad es d a d ia m in o b en zid in a tran sfo rm aram a re a ç ã o de p ero x id a se em u m a d as m ais confiáveis em histo q u í m ica.
D o is m éto d o s tê m sid o u sa d o s am p lam en te em im un o cito q u ím ica te n d o com o d esfecho com um a re v e la ç ã o d a p e ro x id a se com o ac im a descrito. P rim eiro, o m é to d o do an tico rp o p rim á rio livre e o secu n d á rio m a rc ad o com a en z im a e q ue ch am arem o s de “ im uno p e ro x id a se in d ire ta” , co m o j á te m sido d esignado, p o r que se p ro c e ssa em dois estágios à sem elh an ça d a im u- n o flu o rescên cia ind ireta. S eg undo, o m éto d o q ue utili z a a n tico rp o n ã o m a rc a d o e se p ro c e ssa em três e stá gios, sendo o te rc eiro deles co n stitu íd o p elo com plexo “ p ero x id a se -a n tip e ro x id a se ” ou, ab rev iad am en te, P A P . E sse com p lex o é constituído g eralm ente p o r d u as m olécu las de im unoglobulina e três de p e ro x id a se ligadas p o r p o n te s n atu ra is. O m é to d o do P A P foi aplicad o p e la p rim e ira v ez p o r S tem b e rg e co ls20 e foi ilu stra d o com a d em o n straç ão específica d o T r e p o n e -m a p a l l i d u -m . N e s s e m éto d o , o an tico rp o p rim ário é livre e p ro d u zid o n a m e sm a espécie anim al que o an ti co rp o ac o p lad o à p ero x id a se. O an tico rp o se cu n d ário serve de lig ação en tre o an tico rp o p rim á rio e ao in te grado n o co m p lex o P A P . O an ticorpo p rim á rio poli- clonal p o d e se r su b stitu íd o p o r an tico rp o m ono clo n al co m as dev id as m odificaçõ es a d a p ta tiv a s n a casc ata .
T ra b a lh o s co m p arativ o s têm dem o n strad o , ta n to a nível de m ic ro sco p ia ó p tic a com o d e m ic ro sco p ia eletrô n ica, a su p e rio rid ad e d o m éto d o do an tico rp o n ão m a rc ad o ( P A P ) so b re o m arcad o , p rin cip alm en te em re la ç ã o à sensibilidade e à q u alid ad e das p re p a ra çõ e s7 1317
22
A p e s a r d essas d iferenças, am bos os m é to d o s têm sido em pregados com êxito n a identificação de antígenos teciduais os m ais diversos, entre eles agen tes b iológicos ca u sa d o re s de d o en ç as, p rin cip alm en te antígenos virais, b a c te ria n o s e alguns p a ra sita s de difí cil id en tificação p elo s m é to d o s co n v e n cio n ais3 6 8 910to c h em ica l d etectio n o f p e ro x id a s e 12. A fte r o xidation d iam in o b en zid in e b ec o m e s highly inso lu b le an d d a rk brow n. T h e p rec ip ita te c a n go th ro u g h alcohol and xylen e an d be m o u n te d w ith p araffin sectio n s as usual. T h e p re p a ra tio n is k ep t p erm an en tly . T h ese diam in o b enzidine p ro p ertie s m a d e th e p ero x id a se rea ctio n one o f th e m o st reliab le h isto ch e m ica l p ro ced u res. T w o m e th o d s are w idely u se d in im m unocytochem istry. B o th h av e in co m m o n th e p ero x id a se d ev e lo p m e n t as d escrib ed above. O n e o f th e m is th e prev io u sly n am ed “ in d ire ct im m u n o p ero x id ase” b ec au se it goes through tw o ste p s like in d ire c t im m un o flu o rescen ce. T h e p ri m a ry an tib o d y is free a n d th e se co n d a ry is la b ele d w ith pero x id a se. T h e se co n d m e th o d u tilizes u n la b ele d an tib o d y an d goes th ro u g h th re e steps. T h e th ird step is the an tip ero x id a se co m plex or, fo r sh o rt, P A P . T his com plex is u su a lly m a d e u p o f tw o m olecu les o f im m u noglobulin an d th ree o f p e ro x id a se conjugated b y n a tu ral bridges. S te m b e rg e t a l20 w ere th e first o nes to u se the P A P m ethod. T h e y u se d it to d em o n strate specifi cally th e T r e p o n e m a p a l l i d u m . I n th is m e th o d th e p ri m ary antibody is free and harvested from the sam e anim al sp ecies as th e o n e c o n n e cted to th e p ero x id ase. T h e se c o n d a ry an tib o d y serves as a co n n e ctio n b etw een th e p rim a ry an tib o d y a n d the P A P com plex. T h e policlo- n a l p rim a ry an tib o d y m a y b e rep la ce d b y a m o n o clo n a l an tib o d y w ith th e m odifications req u ired fo r the reaction.
T h e b e tte r sensitivity an d p re p a ra tio n q u ality w ith th e u n la b ele d an tib o d y ( P A P ) w h en co m p ared to the la b ele d o ne h a s b een show n b y light an d elec tro n m ic ro sco p y 7 13 17 22_ i n Sp ite o f th e se differences b o th p ero x id a se m e th o d s reliab ly d e te c t a g re a t n u m b er o f tissu e antigens fro m d ise ase ca u se d b y b iological agents m ainly viral, b a c te ria l a n d so m e p a ra sitic ones, u su a lly difficult to identify b y th e co nventional te ch n i q u e s 3 6 8 919 x h is u tiliza tio n is also en c o u rag ed b y th e fa c t th a t th e ro u tin e ly fo rm alin-fixed tissu es are p erfec tly ad e q u a te for th ese te ch n iq u e s. T h e in tra cellu la r p a rasites are the o n es m o st difficult for diagnosis b y ro u tin e m ethods. T h e ir ty p ic al m orphology is n o t alw ays w ell p rese rv e d an d th e y m a y n o t b e a d e q u ately id en ti fied.
E d ito r ia l. B a r b o sa , A lf re d o J A . A s té c n ic a s d e im u n o p e r o x id a s e n o e s tu d o d a e tio lo g ia d a s d o e n ç a s in fe c tu o s a s e p a r a s i tá r ia s . R e v is ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T ro p ic a l 2 1 : 1 - 6 , J a n - M a r , 1 9 8 8
E s ta u tiliza çã o é en c o ra ja d a ta m b ém pelo fato d e que, n a m aio ria d as v ezes, tecid o s fixados ro tin e ira m e n te em form ol, p resta m -se ad e q u ad a m e n te p a ra a ap lica ção d estas té cn ic as. O s p a ra sita s de lo c aliza ção in tra celu lar e stão en tre os que oferecem m a io r dificul d ad e p a r a o diag n ó stico , atra v és d e m étodos h isto ló gicos ro tin eiro s, te n d o em v ista q ue su a m orfologia tí p ic a nem sem pre e s tá bem p rese rv a d a o u nem sem pre p o d e ser identificada.
N a p ad ro n iz a ç ã o d as té c n ic a s de im uno p ero x i d ase n ec essita -se d e an tico rp o s p rim ário s q ue p ossibi litem a ltas diluições, a fim de m in im izar as ligações inespecíficas (n o ca so de an tico rp o p o liclonal) e de controles p ositivos e n egativos com uns a q u alq u er re a ção im unocitoquím ica, en tre eles a p ré-ab so rçã o do an ticorpo específico p elo antígeno hom ólogo. T o d o cu id ad o d eve ser d isp e n sad o ao tra ta m e n to d os tecidos p elas soluções fixad o ras. O fra c a sso n a d em o n straç ão de d eterm in a d o s antígenos p rese n tes no te cid o deve-se freq ü en tem en te ao tip o d e fix ad o r u tilizado o u ao m o do com o se u tiliz a d eterm in a d o fixador. C o m o exem plo, a a p re se n ta ç ã o an tig ên ica d a s im unoglobulinas e im unocom plexos co s tu m a ser afe tad a p e la s fixações usuais. N e ss e s c a so s, o p ré-trata m en to d o s co rtes co m en zim as p ro teo lític as, com o a trip sin a, p o d e ser ú til18. E m no sso la b o ra tó rio , sem p re que possível, te sta m o s diversos tip o s de fix ação do te cid o d u ra n te os testes de p a d ro n iz a ç ã o do m é to d o do P A P p a r a iden tificação de d eterm in a d o antígeno, inclusive p ara sitá rio . O s dois fixadores líquidos q u e u sa m o s ro tin e ira m e n te são o fo rm o l salino tam p o n ad o , a 10% , e B o u in co m 1,5 a 2 ,0 % de ácid o acético. A m o stra s do m e sm o te cid o são, tam b ém , co n g elad as em F re o n im erso em nitrogê nio líquido, liofilizad as, inclu íd as em p a ra fin a d ire ta m ente (sem fix ação ) e ap ó s fix aç ão em v a p o r de p ara- form aldeído e d e b e n z o q u in o n a cristalizad a; té cn ic as essas u tiliza d as em o u tro s la b o ra tó rio s de histoquím i- ca. E m geral, ap e n as p a r a a id e n tificação g ro sseira d e p a ra sita s no te cid o , o s fixad o res líquidos tê m se rev e lado suficientes. E n tre ta n to , os resu ltad o s p o dem v a ria r en tre diferentes la b o ra tó rio s, co n sid eran d o q ue so luções e an tico rp o s u tilizad o s n ão sã o o s m esm os. E x em p lifican d o , C o n le y e c o ls9 d em o n straram pelo P A P T o x o p l a s m a g o n d i i em te cid o s form alizad o s en q u an to que, em n o sso la b o ra tó rio , tecid o s d e cam u n dongos co m to x o p la sm o se ex p erim en tal fixados em form ol, n ão ap resen taram im unorreatividade satisfató ria em re la ç ã o ao p a ra sita ; j á n as am o stras fix ad as em B ouin o u liofilizad as o resu ltad o foi excelente.
A id e n tifica çã o de v árias espécies de L e i s h m a -n i a p e la im u n o p ero x id ase in d ire ta 16 19 e p elo P A P 4 tem sido re la ta d a em tecid o s form alizad o s. E n tre ta n to, in d e p en d e n tem en te do m é to d o em pregado, os anti- soros te sta d o s d e ra m resu ltad o p ositivo som en te em a ltas co n c en tra çõ e s (títulos até 160) o que resu lta em níveis rela tiv a m en te altos de co lo ra çã o
inespecífi-th o se cases inespecífi-th e pre-treatm en t w iinespecífi-th p roteolytic enzym es su ch as tripsin, m a y be u se fu l18. In o u r la b o ra to ry w h en ev er p o ssib le w e te s t se v eral k inds o f tis su e fixa tio n w h en ev er th e P A P m e th o d for som e an tig en is sta n d ard iz ed . T h e ro u tin e ly u se d liquid fixatives are 1 0 % buffered salin e form ald eh y d e a n d B o u in ’s solu tio n w ith 1.5 to 2 % ac etic acid. S am p les o f the sam e tissue are also freeze-dryed after frozen w ith liquid ni tro g en coo led F re o n . T h e sam p les a re em b ed d ed in p ara ffin eith er w ith o u t fix atio n o r after fix atio n in p a raform aldehyde or crystaline benzoquinone vapour. T he se te ch n iq u e s h av e also b e e n u tilized b y o th e r histo c h e m istry la b o ra to ries. U s u a lly liq u id fixatives h av e b e e n sa tisfac to ry for tis su e iden tificatio n o f p a rasites. H o w ev er, th e resu lts m a y v ary am ong different la b o ra to ries consid erin g th a t th e solutions an d th e antibodies em p lo y ed are n o t th e sam e. F o r ex am p le, C o n ley e t a l9 h av e d e m o n strate d b y P A P m e th o d
T o x o p l a s m a g o n d i i in fo rm alized tissue. In o u r la b o r a to ry m ice tissu e w ith ex p erim en tal to x o p lasm o sis p ro c e sse d w ith th e sam e fixatives d id n o t show sa tis fac to ry im m u n o re ac tiv ity to th e p ara site ; the resu lts w ere e x c e le n t w ith sam p le e ith e r fix ed w ith B o u in o r freeze-dryed.
F o rm a lin fix ed tissu es h av e b ee n u se d for the iden tificatio n o f sev eral species o f L e i s h m a n i a b y in d ire c t im m u n o p e ro x id a s e ' 6 19 and b y P A P 4. H o w e ver, w ith b o th m eth o d s positive resu lts w ere found o n ly w ith high an tise ru m co n c e n tra tio n s (tite rs u p to 160) w hich c a u se u n a c c e p ta b ly high levels o f n o n specific staining an d interfere w ith th e q uality o f the prep aratio n s. T h ese low w S \ - L e i s h m a n i a titers o f sera do n o t se em to b e d ue to fixativ e ac tio n o n the p a ra site o r to the low a firn ity o f th e te ste d antibody: w ith free- d ry e d tissu e the titers ra re ly u go b ey o n d 3 2 0 (B arb o sa , A . J . A e t al. u n p u b lish ed d a ta ). T h e sa m e a n tise ra u se d to d e te c t T . c r u z i rev eals am astig o tes w ith dilutions abo v e 1 :2000, w ith sev eral s tra in s4.
T h e difficulties fou n d in the id e n tifica tio n o f
E d i to r ia l. B a r b o s a , A lfr e d o J A . A s té c n ic a s d e im u n o p e r o x id a s e n o e s tu d o d a e tio lo g ia d a s d o e n ç a s in fe c tu o s a s e p a r a s i tá r i a s . R e v is ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 1 : 1-6, J a n -M a r , 1 9 8 8
ca , p reju d ican d o a q u alid ad e d as p re p a ra çõ es. E ste s títulos baix o s dos soros anti- L e i s h m a n i a p are c e m n ão se r resu ltad o d a aç ã o dos fixadores sobre o p a r a sita, nem d o g rau de afinidade d os anticorpos tes ta d o s, u m a vez qu e, em te cid o s liofilizados os titulos raram e n te u ltra p a ssa m a 3 2 0 (A .J .A . B a rb o s a e cols: d ad o s n ã o p u b lic ad o s) e, a u tiliza çã o d estes m esm os an ti-so ro s p a r a d e te c ta r o T . c r u z i rev ela am astig o tas c o m titu lo s su p erio res a 2 .0 0 0 , em re la ç ã o a div ersas
c e p a s 4 .
A s d ificuldades e n c o n trad a s p a ra a id entifica ç ã o do T . g o n d i i eL e i s h m a n i a , em p re p a ra ç õ e s h isto lógicas rotineiras, ocorrem tam bém com o T. c r u z i , princi p alm en te n a fase crô n ic a d a d o en ç a de C h ag as. N e m sem pre os am astig o tas fo rm am nin h o s in tra celu lares característico s que sejam facilm ente id entificados em p re p a ra ç õ e s conven cio n ais e n em sem pre o s p a ra s ita s a p re sen ta m m orfologia típ ica e bem c o n s e rv a d a 15. N o sentido de facilitar a id en tificação de am astig o tas do
T . c r u z i foram p ro p o stas a u tiliza çã o d a im unoperoxi d a s e in d ire ta 11 e a do P A P 3. E m b o ra em am b as as té c n ic as p ro p o sta s te n h a m sido u tilizad o s an tico rp o s po- liclonais p ro d u zid o s em coelhos, a p rim e ira ap re sen to u p ositividade com título m u ito b aix o do an tico rp o p rim á rio , o u seja, 4 0 , reagindo até u m m áx im o de 3 2 0 . P o r o u tro lado, o m é to d o do P A P d eu b o n s re su ltad o s com títulos en tre 1 .0 0 0 e 1.6 0 0 , ap re s e n tan d o p ositividade até 4 .0 0 0 . V erificou-se, p o s te rio rm en te, que em tecid o s de feto m ace ra d o , o m éto do do P A P funcio n o u sa tisfato ria m e n te e p erm itiu a iden tificação de nin h o s d e am astig o tas que n ão p u d e ram ser d iag n o sticad o s em p rep a ra çõ es co ra d as p ela h em ato x ilin a e eo sin a ( H E ) , em virtude do av an çad o g rau de a u tó lis e 15. Ig u alm en te, tecid o s fixados ro tin ei ram e n te e co n serv ad o s p o r d é c a d a s em p arafin a, pres- ta ra m -se m u ito b e m à id e n tifica çã o de n in h o s de am as tigotas p elo P A P 5. E s ta c o n s ta ta ç ã o ab re as p o rtas p a ra a ex ecu ção de p esq u isas im un o cito q u ím icas retro s p ectiv as em te cid o s incluídos em p a ra fin a e arq u iv a d os p o r longo tem po.
O m éto d o d o P A P , ap lica d o ao s te c id o s fixados em form ol, rev e la form as am astig o tas íntegras prin ci p alm en te p e la rea tiv id a d e d os antígenos p rese n tes n a m e m b ran a c e lu la r3. P o d e , en tre tan to , rev e lar frag m entos de p a ra sita s o u p a ra s ita s p arc ialm en te digeri dos e d ep o sita d o s no in terio r de m acrófagos, com o o b servado em b aço de cam u n d o n g o s im unes que rec eb e ram cargas elev ad as de form as sangü ín eas d o T . c r u z i
e que a p re sen ta ra m , sim u ltan eam en te, q u ed a d a p ara- s ite m ia 14. P a r a d e te c ta r p artícu la s antigênicas m en o res d o T . c r u z i , p ro v av e lm en te o m a teria l fo rm alizad o n ão se p resta , e m b o ra ex o-antígenos d ifundidos a p a r tir d o p a ra sita , às v ezes, p o ssa m ser d em o n strad o s. A p are d e in te rn a dos nin h o s d e am astig o tas em células m u scu lares lisas a p re se n ta forte im u n o rreatividade p e lo P A P 1 3 o que p o d e ria ser co n seq ü ê n cia d a im
preg-R o u tin ely fix ed tissu es k e p t for d ec ad e s in paraffin w ere a d e q u ate fo r th e iden tificatio n o f am astig o te cy sts w ith P A P 5. T h is d iscovery o p en e d th e d o o rs to re tro s pective re se a rc h w ith p araffin em b ed d e d tissue kep t for a long tim e.
T h e P A P m e th o d ap p lied to form alin fixed tissu e show s in ta c t am astig o tes esp ecially by the rea ctivity w ith th e cell m e m b ran e an tig en s3. I t also m ay d e m o n strate p a ra site fragm ents o r p a rtia lly d igested p ara site s phagocytosed b y m acrophages. T h is h a s b ee n sh o w n w ith spleens o f im m unized m ice receiving la r ge d oses o f b lo o d form s o f T . c r u z i and developing low p a ra s ite m ia 14. P ro b a b ly form alin fixed tissu e is n o t adequate for detecting m inute am ounts o f T. c r u z i antige nic particles. H ow ever, exo-antigens difused from the p a rasite m ay sometim es be dem onstrated. T he internal wall o f am astigote cysts in sm ooth m uscle cells has strong im m u n o reactiv ity w ith P A P 1 3. I t m ight be c a u se d by lo c al im p reg n atio n o f p a ra site antigens. T h e strongly im m unoreactive m aterial in m acrophage and giant cells cy to p lasm s b o th b y in d ire c t im m u n o p e ro x id a s e 19 a n d P A P 21 in form ald eh y d e fixed tissu e infected w ith
E d ito r ia l. B a r b o sa , A lf re d o J A . A s té c n ic a s d e im u n o p e r o x id a s e n o e s tu d o d a e tio lo g ia d a s d o e n ç a s in fe c tu o sa s e p a r a s i tá r ia s . R e v is ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic i n a T r o p ic a l 2 1 : 1 - 6 , J a n - M a r , 1 9 8 8
n a ç ã o lo c al d e an tíg en o s p a ra sitá rio s . O e n c o n tro de m a te ria l fo rte m e n te im u n o rrea tiv o no c ito p la sm a d e m a cró fag o s e d e cé lu la s g igantes ta n to p e la im u n o p e ro x id a se in d ire ta 19 co m o p elo P A P 21, em tecid o s in fectad o s p o r L e i s h m a n i a e fix ad o s em form ol, foi su gerido co m o se n d o an tíg en o s p a ra sitá rio s .
N ã o re s ta m d ú v id a s de que o m é to d o d o P A P é b e m su p e rio r ao s m é to d o s ro tin e iro s d e c o lo ra ç ã o ta m b é m p a r a estu d o s q u a n tita tiv o s do p a ra sitis m o te- cid u al. N in h o s d e a m astig o tas, rela tiv a m en te g randes e b e m co n serv ad o s, p o d e m se r id e n tificad o s c o m fac i lid ad e, ta n to a tra v é s d e c o lo ra çõ e s ro tin e ira s co m o p e lo P A P . E n tre ta n to , n in h o s p e q u e n o s, ap re se n ta n d o n a se cç ão h isto ló g ic a p o u co s am astig o tas ( < 2 0 ) ou, às v ez es, a p e n as u m o u d ois, só com m u ita d ificuldade p o d e m se r id e n tifica d o s em p re p a ra ç õ e s histológicas co n v e n cio n ais, m e sm o p elo o b se rv a d o r ex p e rim en ta do. A s dificu ld ad es a u m e n ta m q u an d o a m o rfo lo g ia p a d rã o do p a ra s ita n ã o é a p a ren te . C o m o estes n in h o s m e n o re s sã o m a is e n c o n tra d o s n a fase ag u d a d a d o e n ç a e n a c h a m a d a fo rm a su b a g u d a2, o m é to d o do P A P , a p e s a r d e s e r m a is co m p lex o , é rec o m en d á v el. Is to ex p lica , p elo m e n o s em p a rte , o s re su lta d o s do es tu d o co m p arativ o en tre o P A P e o H E em trê s chag ási- cos crô n ico s d os q u ais d o is a p re se n ta v a m rico p a ra s i tism o (d o e n ç a r e a tiv a d a ou su b ag u d a) d e te c ta d o p rin cip alm en te p e lo P A P 5. N o te rc e iro ca so , co m p a ra s i tism o e s c a sso , em u m a c e n te n a d e c o rte s en c o n tro u -se 1 n in h o p elo H E e 2 p elo P A P , p o rta n to , n ã o ap re se n ta n d o d ife re n ç a im p o rta n te. E s s e resu ltad o , so m ad o a ou tro s d e tra b a lh o em an d a m e n to , n o s le v a a a c re d ita r qu e, em ch a g ásico s crô n ic o s, co m esc a sso p a ra s itis m o, os re su lta d o s d a p ro c u ra d e am astig o tas p elo H E e p elo P A P sã o sem elh an te s, q u a n d o se a n a lis a u m p e q u en o n ú m e ro de c o rte s, n ã o se ju stific a n d o a u tiliz a çã o d o m é to d o im u n o c ito q u ím ic o , m a is co m p lex o e disp en d io so , a p e n a s co m e ste objetivo. N e s s e s casos, aco n se lh a-se o p ro c e d im e n to d a p e s q u isa p elos m é to d os co n v e n cio n ais, a p lica n d o -se a té c n ic a do P A P nos cortes se q ü en ciais ao s p o sitiv o s ou su sp eito s, ta n to p a ra e s tu d a r m e lh o r a cé lu la p a r a s ita d a co m o p a r a co n firm ar a n a tu re z a an tig ên ica d o p a ra sita . P o r o u tro la do, c a s o h a ja indícios de que o p a ra sitis m o se ja m ais fre q ü en te q u e o u su a l, re c o m e n d a -se a a p lic a ç ã o do P A P d e fo rm a m a is sis te m a tiz a d a . E v id e n te m e n te que a d e c isã o a ser to m a d a v ai d e p e n d e r d as d isp o n ib ilid a des té c n ic a s d o lo c a l d e tra b a lh o .
A ap licação de m étodo im unocitogênicos m oder n o s es tá presen tem en te galgando seus prim eiros degraus n o terreno d a P atologia T ropical. A asso ciação d esses m é to d o s qualitativos a nível de m icroscopia ó p tica e eletrô n ica, com o u tro s das á re a s de M icro b io lo - gia, Im u n o lo g ia e B io q u ím ic a p ro m e te re sp o n d e r m ui ta s q u estõ es, hoje em ab e rto , so b re o co m p lex o re la c io n a m e n to p ara sito -h o sp e d e iro d e im p o rta n tes d o e n ç a s in fec tu o sa s e p a ra s itá ria s .
th a t th e p a ra s itis m is m o re c o m m o n th a n u su a l. I t is e v id en t th a t this d ec isio n w ill d e p e n d o n th e re so u rc e s a v a ila b le to th e re se a rc h e r.
T h e m o d e m im m u n o cy to c h em ica l m e th o d s are, rea ch in g th e firs t step s in th e stu d y o f the T ro p ic a l D ise a se s. T h e a s so c ia tio n o f th e se qu alitativ e m e th o d s a t light and e letro n ic m ic ro sc o p y levels, w ith o th e rs in th e a re a s o f M icrobiology, Im m u n o lo g y a n d B io ch em istry p ro m ise s an sw e rs to m a n y u n so lv e d q uestions re la te d to th e co m p lex re la tio n sh ip b etw e e n
h o s t an d p a r a s ite from im p o rta n t p a ra s itic an d infec- tios diseases.
R E F E R E N C E S
1. A lm e id a H O , M a rtin s E , F ra n c is c o n J U , T e ix e ira V P A , B a rb o s a A J A , G o b b i H , R e is M A . C a ra c te rís tic a s d a s célu las p a ra s ita d a s p e lo T r y p a n o s o m a c r u z in a p a re d e d a v e ia c e n tra l d a s s u p ra -re n a is d e c h ag á sic o s crô n ic o s. R e v is ta d a S o c ie d a d e B ra s ile ira d e M e d ic in a T ro p ic a l 1 9 :2 2 7 -2 3 1 , 1 9 8 6 .
2. A n d ra d e Z A , A n d ra d e S G . F o r m a su b a g u d a d a m io - c a rd ite c h a g á sic a . R e v is ta d o In s titu to d e M e d ic in a T ro p ic a l d e S ã o P a u lo 5 :2 7 3 -2 8 0 , 1 9 6 3 .
3. B a rb o s a A J A . M é to d o im u n o c ito q u ím ic o p a ra identifi c a ç ã o d e a m a stig o ta s d o T r y p a n o s o m a c r u z ie m c o rte s h isto ló g ico s d e ro tin a . R e v is ta d o In s titu to d e M e d ic in a T ro p ic a l d e S ã o P a u lo 2 7 :2 9 3 -2 9 7 , 1985.
4. B a rb o s a A J A , C o s ta C A , R a m ire z L E , T afu ri W L , R a so P , M a y rin k W . A n tib o d ie s a g a in st L e is h m a n ia sp ecies r e a c t m o re stro n g ly w ith T r y p a n o s o m a c r u z i am a stig o te s th a n w ith th e h o m o lo g o u s a m a stig o te s. A n im m u n o c y to c h em ica l study. M e m ó ria s d o I n s titu to O s- w aldo C ru z 81 (suppl): 131, 1986.
5. B a rb o s a A J A , G o b b i H , L in o B T , L ag e s-S ilv a E , R a m i re z L E , T e ix e ira V P A , A lm e id a H O . E s tu d o c o m p a ra ti v o e n tre o m é to d o c o n v e n c io n a l e o m é to d o d a p e ro x id a - s e -a n tip e ro x id a se n a p e sq u isa d o p a ra s itis m o tis s u la r n a c a rd io p a tia c h a g á s ic a c rô n ic a . R e v is ta d o I n s titu to de M e d ic in a T ro p ic a l d e S ã o P a u lo 2 8 :9 1 -9 6 , 1986. 6. B a rb o s a A J A , Q u e iro z D M M , M e n d e s E N , R o c h a G A ,
L im a J r. G F , O liv e ira C A . Im m u n o c y to c h e m ic a l id en tific a tio n o f C a m p y lo b a c t e r p y l o r iin g a stritis a n d c o rre la tio n w ith c u ltu re . A rc h iv e s o f P a th o lo g y & L a b o ra to ry
M e d ic in e , 1 1 2 :5 2 3 -5 2 5 , 19 8 8
7 . B u rn s J. B ack g ro u n d staining an d sensitivity o f the u n la b e lle d a n tib o d y -en z y m e (P A P ) m eth o d . C o m p a ri so n w ith th e p e ro x id a se lab e lle d a n tib o d y sa n d w ic h
m e th o d using fo rm alin fix ed p a raffin e m b e d d e d m ate ria l. H isto c h e m istry 4 3 :2 9 1 -2 9 4 , 1 9 7 5 .
8. B u m s J . Im m u n o p e ro x id a s e lo c a liz a tio n o f h e p a titis B antigen (H B ) in fo rm alin -p a ra ffin p ro c e ss e d liv e r tissu e. H isto c h e m istry 4 4 :1 3 3 -1 3 8 , 1 9 7 5 .
9. C o n le y E K , Je n k in s K A , R e m in g to n J S . T o x o p la s m a
g o n d i iin fec tio n o f th e c e n tra l n e rv o u s sy stem . U s e o f p e ro x id a se -a n tip e ro x id a s e m e th o d to d e m o n s tra te T o
x o p l a s m a in fo rm alin fix ed , p a raffin e m b e d d e d tissu e se c tio n s. H u m a n P a th o lo g y 1 2 :6 9 0 -6 9 8 , 1 9 8 1 .
10. C o o n s A H , K a p la n M H . L o c a liz a tio n o f a n tig e n in tissu e cells; im p ro v e m en ts in m e th o d fo r th e d e te c tio n o f
E d ito r ia l. B a r b o s a , A lf re d o J A . A s té c n ic a s d e im u n o p e r o x id a s e n o e s tu d o d a e tio lo g ia d a s d o e n ç a s in fe c tu o s a s e p a r a s i tá r ia s . R e v i s ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T ro p ic a l 2 1 : 1 - 6 , J a n - M a r , 1 9 8 8
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