R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 1 7 : 4 1 - 4 3 , J a n - M a r , 1 9 8 4
NOTA PRÉVIA
INSULIN REDUCES THE REQUIREMENT FOR SERUM IN
P L A S M O D I U MF A L C I P A R U M
CULTURE
Carlos Eduardo Tosta and Felício Sala-Neto
I n s u l i n a d d e d t o P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m c u l t u r e s ( 0 . 2 I U / t n l ) r e d u c e d t h e r e q u i r e m e n t f o r h u m a n s e r u m f r o m t e n t o f i v e p e r c e n t . T h i s r e p r e s e n t s a n o b v i o u s a d v a n t a g e b y i t s s e r u m - s p a r i n g e f f e c t a n d b y r e d u c i n g t h e c h a n c e s o f u s i n g c o n t a m i n a t e d s e r u m i n c u l t u r e s . T h e g r o w t h p r o m o t i n g a b i l i t y o f i n s u l i n w a s o b s e r v e d e i t h e r i n c u l t u r e -a d -a p t e d P . f a l c i p a r u m o r i n n e w l y - i s o l a t e d s a m p l e s .
K e y w o r d s : P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m . M a l a r i a . I n s u l i n . C u l t u r e m e d iu m .
T h e p o s s i b i l i t y t o k e e p a p a r a s i t e in c u l t u r e r e p r e s e n t s a n i m p o r t a n t s t e p t o w a r d s a b e t t e r k n o w - l e d g e o f i ts b io l o g y . I t a l s o f a c i l i t a t e s t h e s t u d y o f th e a c t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s a n d i m m u n e f a c t o r s i n v i t r o , a n d c o n s t i t u t e s a p r a c t i c a l w a y t o o b t a i n p a r a s i t e a n t i g e n s . W i t h t h e d e v e l o p m e n t b y T r a g e r a n d J e n s e n in 1 9 7 6 8 o f a s i m p l e a n d e f f e c t i v e s y s t e m , i t h a s b e e n p o s s i b l e t o k e e p P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m i n c o n t i n u o u s c u l t u r e . P a r a s i t i z e d e r y t h r o c y t e s a r e m a i n - t a i n e d i n H E P E S - b u f f e r e d R P M I 1 6 4 0 m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h h u m a n s e r u m ( lO O m l p e r l i t e r o f m e d i u m ) f o r o p t i m a l p a r a s i t e g r o w t h . T h i s r e q u i r e m e n t is a n i m p o r t a n t l i m i t a t i o n o f t h e m e t h o d , s in c e i t is n o t a l w a y s e a s y t o o b t a i n f r e s h h u m a n s e r u m in th e r e q u i r e d a m o u n t . A l s o , s e r u m i t c a n c a r r y d a n g e r o u s p a t h o g e n s , o r a n t i m a l a r i a l a n t i b o d i e s a n d d r u g s w h i c h i n t e r f e r e w i t h t h e g r o w t h o f t h e p a r a s i t e . T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n w a s c a r r i e d o u t in a n a t t e m p t f ín d a s u i t a b l e w a y t o r e p l a c e o r r e d u c e t h e r e q u i r e m e n t f o r h u m a n s e r u m in P . f a l c i p a r u m c u l t u r e s .
M A T E R I A L S A N D M E T H O D S
P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m i s o l a t e s : T w o P . f a l c i p a r u m i s o l a t e s w e r e u s e d : F 8 3 / 2 i s o l a t e d i n 1 9 8 0
f r o m a n i n f e c t e d p a t i e n t f r o m I t u x i R i v e r , S t a t e o f A m a z o n a s , a n d k e p t in c o n t i n u o u s c u l t u r e f o r t w e l v e m o n t h s , a n d F 6 6 / 1 n e w l y i s o l a t e d f r o m a p a t i e n t f r o m t h e l o c a l i t y o f E m b a ú b a , S t a t e o f R o n d o n i a .
W o r k f r o m t h e L a b o r a t ó r i o d e I m u n o l o g i a C e l u l a r , M D C , U n i v e r s i d a d e d e B r a s í l i a , s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m C N P q a n d U N D P / W o r l d B a n k / W H O S p e c i a l P r o g r a m m e f o r R e s e a r c h a n d T r a i n i n g i n T r o p i c a l M e d i c i n e .
A d d r e s s f o r c o r r e s p o n d e n c e : D r . C a r l o s E d u a r d o T o s t a , L a b o r a t ó r i o d e I m u n o l o g i a C e l u l a r , D e p a r t a m e n t o d e M e d i c i n a C o m p l e m e n t a r , U n i v e r s i d a d e d e B r a s í l i a , 7 0 9 1 0 B r a s í l i a , B r a s i l .
R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 3 1 / 1 2 / 1 9 8 3 .
C u l t u r e c o n d i t i o n s : C u l t u r e s w e r e i n i t i a t e d b y d i l u t i n g P . f a l c i p a r u m -p a r a s i t i z e d e r y t h r o c y t e s w it h n o n - p a r a s i t i z e d 0 + o u t d a t e d e r y t h r o c y t e s f r o m b l o o d d o n o r s t o a p a r a s i t a e m i a o f 0 . 1 % . E r y t h r o c y t e s w e r e s u s p e n d e d i n R P M I 1 6 4 0 m e d i u m c o n t a i n i n g 2 5 m M o f H E P E S , 0 . 2 g / l o f s o d i u m b i c a r b o n a t e , 2 5 m g / l o f g e n t a m y c i n , a n d e i t h e r 5 o r 1 0 % h u m a n t y p e O + s e r u m , o r 5 % h u m a n s e r u m p l u s b o v i n e c r y s t a l l i n e i n s u l i n o r N P H z i n c in s u l i n ( m a n u f a c t u r e d b y E l i L il ly a n d s u p p l i e d b y C E M E ) a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s . C u l t u r e s w e r e k e p t i n 5 0 m l t i g h t l y c l o s e d c u l t u r e f la s k s , g a s s e d w ith a m i x t u r e o f 5 % C 0 2 in a i r , a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C . C u l t u r e m e d i u m w a s c h a n g e d d a i l y till p a r a s i t a e m i a r e a c h e d 4 % , w h e n c h a n g e s o c c u r r e d t w i c e a d a y . P a r a s i t a e m i a w a s a s s e s s e d b y e x a m i n i n g 2 0 0 e r y t h r o c y t e s i n G i e m s a - s t a i n e d s m e a r s .
R E S U L T S
A l t h o u g h in s u l i n w a s n o t a b l e t o r e p l a c e h u m a n s e r u m in P . f a l c i p a r u m c u l t u r e s , i t a l l o w e d a r e d u c t i o n t o h a l f t h e a m o u n t o f s e r u m r e q u i r e d f o r o p t i m u m g r o w t h o f t h e p a r a s i t e . F r o m t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f i n s u l i n u s e d ( 0 . 0 5 , 0 . 1 , 0 . 2 a n d 0 . 5 I U / m l ) , th e b e s t r e s u l t s w e r e a c h i e v e d w i t h 0 . 2 u n i t s p e r m i l lili te r o f m e d i u m . T h e i n c r e a s e o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f g l u c o s e ( 2 X t h e a m o u n t i n t h e o r i g i n a l f o r m u l a t i o n o f th e m e d i u m ) d i d n o t e n h a n c e t h e g r o w t h r a t e o f th e p a r a s i t e i n d u c e d b y in s u l in . T h e e f f e c t o f c r y s t a l l i n e i n s u l i n a n d N P H z i n c i n s u l i n o n p a r a s i t e g r o w t h w a s c o m p a r a b l e .
O u r r e s u l t s s h o w t h a t t h e d e c r e a s e o f th e c o n c e n t r a t i o n o f h u m a n s e r u m f r o m t e n t o f iv e p e r c e n t c a u s e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n in th e g r o w t h r a t e o f p l a s m o d i u m ( S t u d e n t ’s “ t ” t e s t p < 0 . 0 5 ) . T h i s o c c u r r e d b o t h w ith a n e w l y - i s o l a t e d s a m p l e o f P . f a l c i p a r u m ( T a b l e 1 ) , a n d w ith a s a m p le k e p t in c o n t i n u o u s c u l t u r e f o r t w e l v e m o n t h s in m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % h u m a n s e r u m ( T a b l e 2 ) . T h e a d d i t i o n o f in s u l i n ( 0 . 2 I U / m l ) t o t h e m e d i u m
T o s t a C E , S a l a - N e t o F . I n s u l i n r e d u c e s t h e r e q u i r e m e n t f o r s e r u m i n P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m c u l t u r e . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 1 7 : 4 1 - 4 3 , J a n - M a r , 1 9 8 4
T a b l e 1 - G r o w t h r a t e o f a n e w l y - i s o l a t e d s a m p l e o f P l a s m o d i u m f a i c i p a r u m c u l t u r e d i n R P M I 1 6 4 0 m e d i u m w i t h a n d w i t h o u t c r y s t a l l i n e i n s u l i n ( 0 . 2 I U / m l ) .
D a y s % P a r a s i t a e m i a i n m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h
1 0 % s e r u m 5 % s e r u m 5 % s e r u m + i n s u l i n
0 0 .1 0 .1 0 .1
3 1 .7 0 . 9 2 .1
4 4 .1 2 .1 3 . 2
5 9 . 2 5 . 2 7 . 8
6 1 6 .8 8 .8 1 1 .9
7 1 6 .4 9 .0 1 1 .5
T a b l e 2 - G r o w t h r a t e o f a s a m p l e o / P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m k e p t f o r 1 2 m o n t h s i n c o n t i n u o u s c u l t u r e c u l t u r e d i n R P M I 1 6 4 0 m e d i u m w i t h a n d w i t h o u t c r y s t a l l i n e i n s u l i n ( 0 . 2 I U / m l ) .
D a y s % P a r a s i t a e m i a i n m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h
1 0 % s e r u m 5 % s e r u m 5 % s e r u m + i n s u l i n
0 0 .1 0 .1 0 .1
3 1 .0 0 . 4 1 .3
4 6 .1 3 .2 6 .2
5 1 2 .2 7 .4 1 1 .4
6 1 6 .0 6 .1 1 3 .7
7 1 7 .7 8 .8 1 7 .1
c o n t a i n i n g 5 % s e r u m r e c o n s t i t u t e d i t s p a r a s i t e s u p p o r t i n g p r o p e r t i e s , a n d a l l o w e d p a r a s i t e s to m u l t i p l y a t r a t e s c o m p a r a b l e t o t h o s e o b t a i n e d w ith m e d i u m s u p p l e m e n t e d w ith 1 0 % h u m a n s e r u m ( p > 0 . 1 ) .
D I S C U S S I O N
I n s u l i n h a s b e e n u s e d a s a n e s s e n t i a l c o m p o n e n t in s e v e r a l f o r m u l a t i o n s o f s e r u m - f r e e m e d i a f o r c u l t u r i n g d i f f e r e n t m a m m a l c e l l l i n e s 1 T h e b a s i s f o r it s g r o w t h s t i m u l a t i o n p r o p e r t y is u n k n o w n , a l t h o u g h it m a y b e r e l a t e d t o i t s a b i l i t y t o s t i m u l a t e t h e i n c o r p o r a - t i o n o f g l u c o s e in b o t h g l y c o g e n a n d f a t t y a c i d s - \ W e n o w s h o w t h a t t h e a d d i t i o n o f i n s u l i n ( 0 . 2 I U / m l ) t o P . f a l c i p a r u m c u l t u r e s r e d u c e s t h e r e q u i r e m e n t f o r
h u m a n s e r u m t o h a l f i t s u s u a l c o n c e n t r a t i o n . T h i s r e p r e s e n t s a n o b v i o u s a d v a n t a g e b y i t s s e r u m - s p a r i n g e f f e c t a n d b y r e d u c in g th e c h a n c e s o f u s in g c o n t a m i n a t e d s e r u m in t h e c u l t u r e s . O u r a t t e m p t s t o r e p l a c e s e r u m b y in s u l i n w e r e n o t s u c c e s s f u l , e v e n w h e n m e d i u m w a s s u p p l e m e n t e d w i t h h y p o x a n t h i n e a n d g l u c o s e . I t is p o s s i b l e t h a t s o m e o t h e r g r o w t h f a c t o r s s u c h a s t r a n s f e r r i n , t r i i o d o t h y r o n i n e , t e s t o s t e r o n e o r h y d r o c o r t i s o n e a r e n e c e s s a r y .
I t is i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t b o t h c r y s t a l l i n e a n d N P H z i n c i n s u l i n a t t a i n e d c o m p a r a b l e r e s u l t s a s a s e r u m s u p p l e m e n L T h i s s u g g e s t s t h a t ( a ) t h e s t a b i l i t y o f i n s u l i n d o e s n o t a p p e a r t o b e c r i t i c a i ( i n s e r u m - f r e e m e d i a 9 0 % o f c r y s t a l l i n e i n s u l i n is d e s t r o y e d w i t h i n 1 h o u r a t 3 7 ° C ^ ) , a n d ( b ) z i n c s t a b i l i z e r h a s n o g r o w t h - i n h i b i t o r y e f f e c t i n o u r s y s t e m , a s i t h a s b e e n s h o w n i n c u l t u r e s o f o t h e r c e l l s 2 .
T h e b e s t s u p p l e m e n t f o r m e d iu m in P . f a l c i p a r u m c u l t u r e s is f r e s h h u m a n s e r u m in c o n c e n t r a t i o n s o f lO O m l p e r li t e r 7 . T h e g r o w t h - p r o m o t i n g a b i l i t y o f h u m a n s e r u m v a r i e s w i d e l y f r o m l o t t o lo t, s o m e b e i n g a b l e t o s u p p o r t o p t i m u m g r o w t h e v e n a t 5 % c o n c e n t r a t i o n s 4 . T h i s l a t t e r e f f e c t h a s a l s o b e e n o b s e r v e d w ith t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n o f h u m a n s e r u m p o o l e d f r o m 1 5 - 2 0 d o n o r s ^ . H o w e v e r , b o t h t h e s e l e c t i o n o f s u i t a b l e l o t s o f h u m a n s e r u m a n d t h e p r o c u r e m e n t o f p o o l s o f s e r a f r o m s e v e r a l d o n o r s a r e v e r y l a b o r i o u s p r o c e d u r e s . O u r r e s u l t s s h o w t h a t , b y a d d i n g i n s u l i n to t h e s y s t e m , e v e n n o n - g o o d g r o w t h p r o m o t i n g s e r a , lik e t h e o n e u s e d in o u r e x p e r i m e n t , m a y b e u s e d a t 5 % c o n c e n t r a t i o n s . T h i s e f f e c t w a s o b s e r v e d b o t h w i t h c u l t u r e - a d a p t e d P . f a l c i p a r u m a n d w i t h n e w l y - i s o l a t e d s a m p l e s . I t w o u ld b e i n t e r e s t i n g t o k n o w
T o s t a C E , S a l a - N e t o F . I n s u l i n r e d u c e s t h e r e q u i r e m e n t f o r s e r u m i n P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m c u l t u r e . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 1 7 : 4 1 - 4 3 , J a n - M a r , 1 9 8 4
w h e t h e r i n s u l i n c o u l d r e d u c e e v e n m o r e t h e r e q u i r e m e n t o f a g o o d - g r o w t h - p r o m o t i n g l o t o f h u m a n s e r u m .
A C K N O W L E D G E M E N T S
T h e a u t h o r s a r e g r a t e f u l t o R e n ê P i r e s f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .
R E S U M O
A a d i ç ã o d e i n s u l i n a ( 0 , 2 ) U l / m l ) à c u l t u r a d e P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m r e d u z i u a n e c e s s i d a d e d e s o r o h u m a n o d e d e z p a r a c i n c o p o r c e n t o . I s t o r e p r e s e n t a u m a ó b v i a v a n t a g e m n ã o s ó p e l a e c o n o m i a d e s o r o c o m o p e l a d i m i n u i ç ã o d o r i s c o d e s e u t i l i z a r a m o s t r a s d e s o r o c o n t a m i n a d a s n a s c u l t u r a s . E s t a c a p a c i d a d e d a i n s u l i n a d e p r o m o v e r a m u l t i p l i c a ç ã o d e p l a s m ó d i o f o i o b s e r v a d a t a n t o e m r e l a ç ã o à P . f a l c i p a r u m a d a p t a d o à c u l t u r a p o r 1 2 m e s e s c o m o e m a m o s t r a s r e c é m - i s o l a d a s d o p a r a s i t o .
P a l a v r a s - c h a v e s : P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m . M a l á r i a . I n s u l i n a . M e i o d e c u l t u r a .
R E F E R E N C E S
1. B r o w n R L , G r i f f i t h R L , N e u b a u e r R H , R a b i n H . D e v e l o p m e n t o f a s e r u m - f r e e m e d i u m w h i c h s u p p o r t s t h e l o n g - t e r m g r o w t h o f h u m a n a n d n o n - h u m a n p r i m a t e l y m p h o i d c e l l s . J o u r n a l o f C e l l u l a r P h y s i o l o g y 1 1 5 : 1 9 1 - 1 9 8 , 1 9 8 3 .
2 . C h a p r o n i è r e - R i c k e n b e r g D M . Z i n c le v e i s in z in c - s t a b i l i z e d i n s u l i n a r e i n h i b i t o r y t o t h e g r o w t h o f c e l l s in v i t r o . I n V i t r o 1 9 : 3 7 3 - 3 7 5 , 1 9 8 3 .
3 . D i v o A A , J e n s e n J B . S t u d i e s o n s e r u m r e q u i r e m e n t s f o r t h e c u l t i v í t i o n o f P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m . I. A n i m a l s e r a . B u l l e t i n o f t h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n 6 0 : 5 6 5 - 5 6 9 , 1 9 8 2 .
4 . J e n s e n J B . S o m e a s p e c t s o f s e r u m r e q u i r e m e n t s f o r c o n t i n u o u s c u l t i v a t i o n o f P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m .
B u l l e t i n o f t h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n 5 7 ( S u p p l 1): 2 7 - 3 1 , 1 9 7 9 .
5 . M a t h e r J P , S a t o G H . T h e g r o w t h o f m o u s e m e l a n o m a c e l l s i n h o r m o n e - s u p p l e m e n t e d , s e r u m - f r e e m e d i u m . E x p e r i m e n t a l C e l l R e s e a r c h 1 2 0 : 1 9 1 - 2 0 0 , 1 9 7 9 .
6 . T a u b M , L i v i n g s t o n D . T h e d e v e l o p m e n t o f s e r u m - f r e e h o r m o n e - s u p p l e m e n t e d m e d i a f o r p r i m a r y k i d n e y c u l t u r e s a n d t h e i r u s e i n e x a m i n i n g r e n a l f u n c ti o n s . A n n a l s o f t h e N e w Y o r k A c a d e m y o f S c i e n c e s 3 7 2 : 4 0 6 - 4 2 1 , 1 9 8 1 .
7 . T r a g e r W . C u l t i v a t i o n o f e r y t h r o c y t i c s t a g e s o f m a l a r i a . I n : T h e i n v i t r o c u l t i v a t i o n o f p a t h o g e n s o f t r o p i c a l d i s e a s e s . T r o p i c a l D i s e a s e s R e s e a r c h S e r i e s n.° 3 , S c h w a b e , B a s e l , P P 3 - 1 3 , 1 9 8 0 .
8 . T r a g e r W , J e n s e n J B . H u m a n m a l a r i a p a r a s i t e s in c o n t i n u o u s c u l t u r e . S c i e n c e 1 9 3 : 6 7 3 - 6 7 5 , 1 9 7 6 .
