DIAGRAMA DE FASES PARA UTILIZAÇÃO EM SISTEMA BIFÁSICO AQUOSO COM DIFERENTES MASSAS MOLARES DE PEG E phs

DIAGRAMA DE FASES PARA UTILIZAÇÃO EM SISTEMA

BIFÁSICO AQUOSO COM DIFERENTES MASSAS MOLARES

DE PEG E pHs

Giovana S. Padilha1, Juliana F. Ferreira1, Ranulfo M. Alegre2, Elias B. Tambourgi1*

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Depto. de Engenharia de Sistemas Químicos e Informática, (F EQ) Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP Av. Albert Einstein, 500, Cx. Postal: 6066, CEP: 13083-970 – Cidade Universitária- Campinas/SP - Brasil -

eliastam@feq.unicamp.br

DIAGRAM OF PHASES FOR USE IN AQUEOUS TWO-PHASE SYSTEM WITH DIFFERENT MOLECULAR MASSES OF PEG AND pHs

In recent years, aqueous two-phase systems have been used in various areas of biotechnology. The two-phase systems are obtained through the mixture of two polymers or one polymer and a salt solution forming two immiscible phases. This work presents the phase diagrams studies for different poly(ethylne glycol) molecular weight (ranging from 400 to 4000) and potassium phosphate salts at pH varying from 6 to 11 at standard conditions. The influence of PEG molecular mass at different pHs were studied from the phase diagrams formed.

Introdução

Técnicas de isolamento e purificação de biomoléculas tem apresentado um acentuado crescimento nos últimos anos. Métodos convencionais não são adequados para separar produtos de origem biológica, por isso novos sistemas de separação estão sendo estudados e desenvolvidos. Entre eles, o sistema bifásico aquoso (SBA) que é um eficiente método para extração de produtos biológicos de misturas complexas. São geralmente formados pela incompatibilidade, em soluções, de dois polímeros hidrofílicos, naturais ou sintéticos, ou pela combinação de um polímero com um sal dissolvidos em água. A separação das fases ocorre acima das concentrações termodinâmicas críticas desses componentes 1, 2. Quando essas concentrações excedem determinado valor, há a formação das duas fases aquosas, que por sua vez formam um meio propicio à manutenção da atividade biológica das macromoléculas a serem particionadas3.

As composições das fases e as concentrações das misturas polímero-polímero ou polímero-sal necessária para que ocorra a separação das fases pode ser representado num diagrama de equilíbrio de fases. Os diagramas de equilíbrio de fases representam os dados termodinâmicos do SBA e são de grande importância para estudos de separação de biomoléculas, pois são usados como ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de extração4.

Na construção de um diagrama de fases, um dos componentes é representado no eixo vertical e o teor do outro, no eixo horizontal. A curva que divide o diagrama em duas fases distintas, ou seja,

região bifásica e monofásica é denominada curva binodal ou curva de equilíbrio. Pontos acima da binodal resultam em sistemas bifásicos e abaixo, sistemas monofásicos5.

Como o diagrama de fases pode sofrer influências de alguns fatores como a massa molar do polímero e o pH, e esses efeitos não têm sido completamente estudados6, o objetivo deste trabalho foi, portanto, a construção de diagramas de fases utilizando a mistura PEG/sal fosfato com diferentes massas moleculares de PEG em diferentes pHs (6,7,8,9,10,11), a fim de verificar influência da variação desses fatores para posterior partição de biomoléculas.

Experimental

Materiais: Foi utilizado o polietileno glicol 400 (Sigma Chemical Co (St. Louis, Mo, USA)) e

4000 (Vetec Química Fina (Rio de Janeiro)) e uma mistura dos sais para solução estoque - Potássio Fosfato Monobásico da Ecibra e o Fosfato de Potássio Bibásico da Synth. Foi utilizada também NaOH (Synth (São Paulo)). Todos os reagentes foram para análise.

Determinação dos diagramas de fases: Segundo a metodologia proposta por ALBERTSSON

(1971)3, os diagramas de fases foram estabelecidos pelo método de turbidez, que é uma observação direta anterior ao aparecimento de uma segunda fase. Em tubos de ensaio foram colocados uma certa quantidade de sal com posterior gotejamento da solução de PEG, para isso utilizou-se uma balança analítica (10-3g) e um vortex para pesagem e agitação dos tubos, respectivamente. O mesmo procedimento foi usado para obtenção dos pontos com alta concentração de PEG. A construção dos diagramas de fases foi a partir das diferentes composições das soluções de PEG e sal em temperatura ambiente. Concentrações de 100% e 50% (w/w) foram preparadas para PEG 400 e 4000, respectivamente. A 20% a solução estoque do sal fosfato foi também preparada de forma a obter os pHs desejados (6,7,8 e 9). Para os pHs 10 e 11 além dos sais, foi utilizado uma solução de NaOH 1M para ajuste. As diferentes composições permitiram a construção da curva binodal do sistema para cada massa molar de PEG em diferentes pHs. Neste trabalho, por convenção, a concentração do sal (% sal fosfato) que se distribui preferencialmente na fase inferior foi plotada na abscissa e a concentração do PEG (% PEG) que se distribui preferencialmente na fase superior foi plotada na ordenada.

Resultados e Discussão

A escolha do PEG se deve à boa eficiência do mesmo de formar fases em meio aquoso e não provocar a diminuição da atividade das biomoléculas, além de ser biodegradável e atóxico7. Embora existam diversos sais que formem duas fases com o PEG, foi escolhido neste trabalho o sal potássio fosfato por apresentar alto coeficiente de partição de biomoléculas em relação a outros sais, tais

como NaCl, Na2SO4, além de ser uma boa alternativa de baixo custo aos processos convencionais,

que utilizam a dextrana3.

Os diagramas de fases PEG 400/sal fosfato e PEG 4000/sal fosfato em pHs variando de 6 a 11 são mostrados na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. Analisando o comportamento dos sistemas em diferentes valores de pHs, nota-se que não houve um deslocamento significativo das binodais. Ainda não foram encontrados na literatura dados acerca da influência desse parâmetro sobre a binodal em sistemas polímero/sal, nos levando a concluir a estabilidade desses sistemas frente às variações de pH. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G 4 0 0 ( p /p ) pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

Figura 1- Curva de equilíbrio SBA PEG400/Fosfato

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G 4 0 0 0 ( p /p ) pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

Sendo assim, pode-se verificar que a influência dos pHs sobre os SBAs não apresentaram comportamento definido, ou seja, o deslocamento das binodais seguindo uma tendência. Para isso é necessário um estudo mais aprofundado desses sistemas, embora em trabalhos anteriores, os autores demonstraram que esses efeitos sobre os SBAs não possuem uma característica própria6,8. Por outro lado, VIDEIRA e colaborador (1994)9 observaram que para sistemas bifásicos PEG/sal fosfato, a redução do pH de 8,0 para 7,0 aumentou a concentração de polímeros e sais requeridos para a formação de fases, isto foi observado por outros autores10.

Em relação à massa molar do PEG, segundo ALBERTSSON (1971)3, quanto menor a massa molar do polímero, maior a concentração necessária para a formação de fases3. Isso corrobora com a Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8 que apresentaram maiores concentrações de PEG 400 em relação ao PEG 4000.

A caracterização destes sistemas possibilita obter as linhas de amarração para que se possa purificar bimoléculas, como proteínas e enzimas em seu pH ótimo.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G ( p /p ) PEG 400 PEG 4000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 % Fosfato % P E G PEG 400 PEG 4000

Figura 4 - Curvas de equilíbrio SBA PEG/Fosfato a pH 7

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G ( p /p ) PEG 400 PEG 4000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G ( p /p ) PEG 400 PEG 4000

Figura 6 - Curvas de equilíbrio SBA PEG/Fosfato a pH 9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G ( p /p ) PEG 400 PEG 4000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 % Fosfato (p/p) % P E G ( p /p ) PEG 400 PEG 4000

Figura 8 - Curvas de equilíbrio SBA PEG/Fosfato a pH 11

Conclusões

Para as diferentes massas molares dos polímeros utilizados (PEG 400 e PEG 4000), foi verificado que menores concentrações de soluções são utilizadas para formar o SBA com o PEG de maior massa molar, isto se torna significativo em termos econômicos. Por outro lado, não houve um deslocamento significativo da binodal em relação aos diferentes pHs. O SBA pode ser utilizado para partição de diversas biomoléculas dentro dessa faixa de pH estudado.

Agradecimentos

Ao CNPQ pela concessão das bolsas de mestrado e doutorado.

Referências Bibliográficas

1. M.R. Palomares, M. Hernandez. Journal of Chromatography B, 1998, 711, 81. 2. H.Cabezas, Journal of Chromatography B, 1996, 680, 17.

3. P.A Albertsson, Partition of cell particles and macromolecules, John Wiley & Sons, New York, 1971.

4. M.K. Badr, H. Cabezas. Fluid Phase Equilibria, 1996, 115, 17.

5. A.D.G. Zunica, J.S.R. Coimbra, L.A. Minim, A.J.A. Meirelles. Boletim da Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, 2003, V.37, 102.

6. A.D. Diamond, J.T. Hsu. Advances in Biochemistry Engineering, 1992, V.47, 135.

7. J.M. Harris, Poly (ethylene glycol) chemistry: Biochemical and biomedical applications, Plenum Press, New York and London, 1992.

8. J.C.C. Santana, Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, 2003. 9. M. Videira, M.R., Aires-Barros. Journal of Chromatography A, 1994,668, 240.