ADN simple brin biotinylé

L’idée de tester l’ADN simple brin pour ancrer l’ADN double brin à la surface se fonde sur le travail d’Allemand et al sur le peignage de l’ADN. Il y est indiqué que dans une situation où il y a une certaine dénaturation au niveau des extrémités de l’ADN double brin, celles-ci ont une affinité particulière pour les surfaces (73).

Nous avons donc testé l’utilisation de plots d’ADN simple brin pour ancrer les extrémités de l’ADN sur le mica, en commençant par des petits ADN simple brin linéaires biotinylés, sur mica non prétraité. Nous avons utilisé des fragment d’ADN simple brin de 50 bases, biotinylés en 5’, dont la séquence (une suite répétée de CAA ACC) ne permet pas d’appariement intramoléculaire de type liaison Watson-Crick, afin de conférer à nos fragments une réactivité envers la surface a priori meilleure.

L’ADN simple brin est connu pour ne pas s’étaler sur les surfaces et rester sous forme globulaire. Les fragments d’acides nucléiques simple brin d’aussi petite taille apparaissent donc sous forme de petits globules sur la surface (74,75). Leur taille est comparable à celle des corpuscules parasites qui sont fréquemment observés sur la surface lors des expériences d’AFM, notamment en milieu liquide, ce qui les rend difficiles à identifier sans ambiguïté (75). Plutôt que de tester directement l’accroche sur les petits ADNs simple brin, nous avons voulu utiliser la streptavidine, de taille suffisante pour une visualisation et un comptage directs plus fiables des plots sur la surface.

4.1. Mica non prétraité nickel.

Comme montré en 1.1, l’accroche de la streptavidine sur le mica non prétraité ne résiste pas aux rinçages Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM. Si les petits fragments d’ADN simple brin biotinylés s’accrochaient bien sur le mica, ils seraient capables d’y retenir la streptavidine face à cette augmentation de la concentration en sel monovalent. Nous avons testé deux stratégies, en milieu liquide : injection de l’ADN simple brin dans la cellule liquide une heure avant l’injection de streptavidine, ou préincubation de l’ADN simple brin une heure avec la streptavidine avant l’injection du mélange dans la cellule liquide. Dans les deux cas nous n’avons pas clairement constaté une meilleure accroche de la streptavidine sur la surface en présence des ADNs simple brin par rapport aux expériences contrôle sans ADN simple brin (injection de la streptavidine seule), dans toute la gamme de conditions ioniques d’adsorption testée, en absence comme en présence de cations divalents. Nous avons alors décidé de travailler avec des ADNs simple brin de plus grande taille, faciles à visualiser sur la surface et a priori également susceptibles d’assurer une meilleure accroche.

Nous avons comparé par AFM à l’air le dépôt d’ADN de 1440 paires de bases et d’ADN de 1440 paires de bases dénaturé, dans les mêmes conditions de tampon et en présence de cations divalents (magnésium 5 mM), sur mica non prétraité. Les plots d’ADN simple brin sont suffisamment longs pour être faciles à identifier sans ambiguïté sur la surface et montrent une nette différence d’étalement par rapport à l’ADN double brin (figure III-18).

Mais nous n’avons pas mis en évidence de différence vis-à-vis de la désorption par le NaCl 200 mM de l’ADN non dénaturé et de l’ADN dénaturé.

Figure III-18 : Différence d’étalement sur le mica entre l’ADN double brin et l’ADN simple brin. Longueur de l’ADN double brin : 1440 pb. Longueur de l’ADN simple brin : 1440 n.

Mica non prétraité ; [MgCl₂] = 5 mM.

4.2. Mica prétraité nickel.

Nous avons aussi fait cette comparaison simple brin/double brin sur mica prétraité nickel en utilisant un ADN simple brin de 6400 nucléotides (M13) observé en milieu liquide.

A basse concentration en sel monovalent (Tris 10 mM pH 7,5 MgCl2 5 mM NaCl 2 mM), l’ADN simple brin est adsorbé et bien visible sur la surface. Après passage en Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM, il devient peu ou pas visible. Qualitativement, ce comportement vis-à-vis de l’adsorption et de la désorption n’est pas différent de celui de l’ADN double brin.

Figure III-19 : Construction hybride d’ADN simple et double brin observée en AFM à l’air.

Pour une comparaison directe nous avons étudié l’adsorption et la désorption d’une construction d’ADN hybride comportant une partie simple brin de 831 nucléotides et une partie double brin de 609 paires de bases, mise au point et préparée au laboratoire comme décrit dans (76) (figure III-19). Sur mica prétraité par des ions nickels, en AFM en milieu liquide, la partie double brin est capable de tourner autour de la partie simple brin, qui forme donc un plot d’ancrage, tant que l’on reste à basse concentration en sel monovalent (Tris 10 mM pH 7,5 MgCl2 10 mM NaCl 10 mM) (figure III-20). Lorsque la concentration en sel monovalent est augmentée (Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM), le plot ne reste par contre pas mieux attaché à la surface que la partie double brin. Un ADN hybride avec une partie double brin centrale de 881 paires de bases et des extrémités simple brin de 279 et 285 nucléotides a ensuite été préparé au laboratoire (figure III-21). Les tests avec observation en milieu liquide

831 n 609 pb

AFM à l’air.

Scan : 250 x 500 nm.

Echelle en Z : 3 nm.

AFM à l’air.

Scans : 4 µm x 4 µm Echelle en Z : 3 nm.

montrent sur certaines molécules une accroche plus forte par les extrémités, mais l’interaction pointe-surface pourrait ici être un paramètre crucial et au bout de quelques dizaines de secondes les extrémités perdent leur immobilité et la molécule se déplace sur la surface (figure III-22).

Figure III-20 : Accroche différentielle sur le mica des parties simple brin et double brin d’une construction hybride. L’ADN double brin est beaucoup plus mobile sur la surface que la partie simple brin. AFM en milieu liquide ; une image toutes les 8,4 s ; scan : 500 nm x 500 nm ; échelle en Z : 5 nm.

Figure III-21 : Observation en AFM à l’air d’une construction hybride d’ADN double brin avec deux extrémités ADN simple brin.

L’ancrage par l’ADN simple brin est donc possible mais il est limité aux conditions de bonne adsorption du référentiel de conditions établi pour l’ADN double brin. Il nécessite des longueurs d’ADN simple brin importantes et semble également très sensible à l’interaction

0 s 8,4 s 16,8 25,2

33,6 s 42 s 50,4 s 58,8 s

67,2 s 75,6 s 84 s 92, 4 s

Longueur de la partie double brin : 881 pb.

Longueur des extrémités simple brin : 279 et 285 n.

AFM à l’air.

Scan : 375 nm x 375 nm.

Echelle en Z : 5 nm.

avec la pointe AFM lors du balayage en milieu liquide. Au vu de nos résultats, nous pouvons émettre l’hypothèse que le mécanisme d’adsorption de l’ADN simple brin sur la surface est proche de celui de l’ADN double brin. La grande différence d’étalement et la haute densité (grande proximité) des points d’adsorption de l’ADN simple brin pourraient être les caractéristiques qui le rendent beaucoup moins mobile que l’ADN double brin sur la surface de mica.

Figure III-22 : Test de la mobilité de la construction double brin avec extrémités simple brin par AFM en milieu liquide. La distance entre les deux extrémités de la molécule ne varie pas sensiblement pendant les premières images de la séquence (250 nm +-8 nm), puis une des extrémités se décroche. Ensuite toute la molécule se déplace sur la surface (images non montrées).