Evolution de n avec [Mg 2+ ]

Nous avons analysé l’évolution de n en fonction de la concentration en magnésium, pour les molécules d’ADN en solution et pour les molécules d’ADN adsorbées. La figure III- 3 montre que quand les molécules sont adsorbées sur la surface, elles sont moins coupées par la bléomycine que les molécules en solution. De plus la variation de n en fonction de la concentration en magnésium est nettement plus faible (dépendance en [MgCl2]^-0,55 pour les molécules adsorbées sur la surface et en [MgCl2]^-0,92 pour les molécules en solution).

L’inhibition du clivage est donc à la fois plus forte sur la surface et moins dépendante de la concentration en magnésium que dans le volume. Il est bien connu qu’en solution, le magnésium inhibe le clivage de l’ADN par la bléomycine (11,12), ce que nous observons bien. Mais c’est la première fois qu’un tel effet différentiel est mis en évidence entre une réaction sur l’ADN adsorbé sur la surface, et sur la même réaction sur l’ADN en solution.

en présence d’ascorbate en absence d’ascorbate

Figure III-3 : Effet du magnésium sur le clivage. Les molécules d’ADN adsorbées sur la surface sont moins coupées par la bléomycine et le nombre moyen de coupures varie plus faiblement avec [Mg²⁺]. [bléomycine] = 30 nM ; [ascorbate] = 100 µM. Figure d’après (15).

Pour essayer d’expliquer ces différences observées entre le clivage en solution et le clivage sur la surface nous nous sommes intéressés aux interactions entre les cations de la solution (magnésium, bléomycine, dont nous avons fait varier les concentrations dans notre étude expérimentale) et la surface du mica. La surface du mica non prétraité étant globalement chargée négativement, la concentration de ces différents cations décroît à partir de la surface.

Comme au chapitre précédent, nous utilisons un modèle de double couche électrique et la théorie de Poisson-Boltzmann pour relier les concentrations de ces différentes espèces au niveau de la surface du mica à leurs concentrations en solution. Pour simplifier, comme nous ne faisons pas varier la concentration en Hepes dans notre étude expérimentale, nous ne considérons pas les cations Hepes du tampon dans les équations, bien qu’ils interviennent dans la neutralisation de la surface (rappelons que la molécule d’Hepes porte une charge négative et deux charges positives). De plus, les concentrations en bléomycine utilisées (~1 nM à 1 µM) sont inférieures de plusieurs ordres de grandeur aux concentrations en magnésium utilisées (~1-20 mM), ce qui nous permet de considérer que la neutralisation de surface de mica est uniquement due aux cations Mg²⁺.

(a) clivage de l’ADN en solution

(b) clivage de l’ADN adsorbé sur la surface

Figure III-4 : Evolution de la concentration en magnésium en fonction de la distance à la surface. Dans le modèle électrostatique proposé, aux distances inférieures à 1 nm, la concentration sur la surface dépend peu de la concentration dans la solution. Figure d’après (15).

La décroissance de la concentration en cations à partir de la surface s’exprime à l’aide de l’équation de Poisson-Boltzmann non linéaire (16):

Equation 3 :

d : distance à la surface

nb : concentration en magnésium en solution

ns : concentration en magnésium à la surface du mica (~ 1-6 M) λz : épaisseur de la couche de magnésium condensée sur la surface

La décroissance de n(d) pour plusieurs concentrations en magnésium est indiquée figure III- 4. Loin de la surface, n(d) tend vers la concentration en volume de magnésium, tandis que très près de la surface (d<1 nm), la concentration en magnésium est beaucoup plus élevée et dépend très peu de la concentration en volume. Dans le modèle d’adsorption présenté au chapitre précédent, les cations doivent être situés à une distance de la surface inférieure à lb~0,7 nm pour assurer l’adsorption des molécules d’ADN. Nous pouvons donc considérer que les molécules d’ADN adsorbées sur la surface sont à l’intérieur d’une couche de magnésium condensée au voisinage de la surface de mica. Ainsi, les concentrations en magnésium autour des molécules d’ADN en solution et des molécules d’ADN adsorbées sur le mica sont très différentes.

Les résultats sur l’ADN adsorbé sont tout à fait cohérents avec ce modèle :

- la concentration réelle en magnésium sur la surface est plus élevée que la concentration en solution, et l’ADN adsorbé est situé dans cette couche de magnésium concentré, d’où une inhibition accrue

- la concentration en magnésium sur la surface varie peu avec la concentration en volume, d’où un facteur de dépendance de n vis-à-vis de [Mg²⁺] plus faible qu’en solution (0,55 au lieu de 0,92 dans le fit avec une loi en exposant)

b z

s n

d d n

n +

= + ₂

) 2 1 ) (

( λ

La molécule de bléomycine porte une charge positive, avec plusieurs domaines de la molécule qui interviennent dans sa charge globale. Nous appelons zeff sa charge effective, qui doit être proche de la valeur +1 donnée par sa formule chimique. Les équations de Poisson- Boltzmann pour le magnésium et pour la bléomycine s’écrivent :

Equations 4 et 5 :

T k Mg

e B

Mg ns

ψ 2

]

=[

T k z blm

B eff

e Blm ns

ψ

]

=[

Elles permettent de relier les concentrations en magnésium et en bléomycine en surface et en volume :

Equation 6 :

2 2 ] 2

[

]

[ ^zeff

zeff Mg

blm ns

Mg ns Blm

+

=

L’équation 6 nous permet d’estimer la charge effective zeff de la bléomycine, en supposant que le nombre de coupures moyen de l’ADN, n, est proportionnel à la concentration de bléomycine sur la surface, nsblm ; avec l’évolution de n en [MgCl2]^-0,55 pour l’ADN adsorbé donnée par la courbe expérimentale de la figure III-3, nous trouvons zeff = 1,1. Il est tout à fait satisfaisant que cette valeur soit proche de la charge réelle connue pour la bléomycine.