L'accessibilité de l'ADN aux ligands doit ensuite être caractérisée pour définir des conditions expérimentales optimales. Nous confrontons ensuite ce modèle à une étude expérimentale de la force d'adsorption de l'ADN sur le mica par AFM.
Les différentes approches d’étude de l’ADN et des interactions ADN-
L’ADN
- Structure
- Courbure et flexibilité locales
- Topologie
À des concentrations plus faibles, la molécule d'ADN est beaucoup plus rigide (Lp~ 80-100 nm à NaCl<1 mM), en raison de la répulsion entre les phosphates de l'ADN. Tw correspond au nombre de tours hélicoïdaux d'un brin d'ADN autour de l'autre brin.
Interactions ADN-protéines
- Reconnaissance chimique et structurale
- Implication des propriétés locales de l’ADN
- Des processus dynamiques complexes
Le mécanisme de reconnaissance implique généralement l'accessibilité des sillons mineurs et majeurs, dont la taille et les propriétés géométriques varient en fonction de la séquence d'ADN. L'interaction permanente d'association et de dissociation de complexes permet à de nombreux processus dynamiques de se dérouler sur l'ADN impliquant différents acteurs protéiques.
Etude in vitro de l’ADN et des interactions ADN-protéines
- Paramètres et ordres de grandeurs
- Techniques d’étude
Les réponses mécaniques de la molécule d'ADN nue et de la même molécule après injection de protéine sont enregistrées. Les pinces magnétiques permettent de contrôler un paramètre supplémentaire - la torsion - à l'échelle d'une molécule d'ADN individuelle (41).
Microscopie électronique en transmission (MET) et cryoMET
La courbure locale et la flexibilité de l'ADN peuvent être mesurées par des méthodes statistiques d'analyse d'images, dont certaines ont été développées en laboratoire (Figure II-2) (73,74). C'est également possible en cryoMET, cette fois sans coloration, avec une résolution typique de l'ordre de 3 nm (84).
Microscopie de fluorescence
Enquête expérimentale sur l'effet de la charge de surface et des concentrations de cations sur l'adsorption de l'ADN. En apparence, le nombre moyen de coupures d'ADN ne varie plus de manière linéaire avec [bleo].
Microscopie à force atomique
Les différents modes de fonctionnement de l’AFM et leurs applications en
Mode contact
La micropoignée est balayée à hauteur constante au-dessus de la surface et se déforme en fonction du relief rencontré par la pointe. L'image du relief superficiel est reconstituée à partir de corrections de la position verticale de l'échantillon.
Mode non contact
Ce mode d'imagerie peut fonctionner soit à hauteur constante (le microfoie est balayé à une hauteur constante au-dessus de la surface) soit à force constante (la force avec laquelle le microfoie palpe la surface est maintenue constante pendant le balayage par rétroaction) (Figure I-4). ). Le mode contact est simple et rapide à mettre en œuvre, mais des forces de frottement importantes sont induites entre la pointe et la surface.
Mode contact intermittent
Le déphasage entre le signal d'excitation et la réponse du microlevier dépend des propriétés mécaniques locales de la surface. A proximité de la surface et a fortiori en situation de contact intermittent, l'oscillation dépend davantage de l'interaction avec la surface.
Utilisation du mode contact intermittent à l’air
- Propriétés de la résonance
- Modélisation de l’interaction pointe-surface
Pour le microlevier décrit ci-dessus, le facteur de qualité de résonance est généralement de l'ordre de 300. Le rayon de courbure de la pointe de l'AFM est généralement beaucoup plus grand que le diamètre de l'ADN ; dans
Utilisation du mode contact intermittent en milieu liquide
- Modes d’excitation de l’oscillation
- Facteur de qualité de la résonance
- Modélisation de l’interaction pointe-surface
Le champ électrique est plus intense à la pointe et donc essentiellement la force électrique agit à ce niveau. Le facteur de qualité de résonance dans un milieu liquide est de l'ordre de quelques unités, bien inférieur (environ deux ordres de grandeur) au facteur de qualité de l'air.
Temps d’acquisition des images
- Paramètres de construction intrinsèques à l’instrument
- Fréquence de résonance des microleviers
- Paramètres d’imagerie
- Performances
Le système de rétroaction sert à maintenir constante l'amplitude d'oscillation du microlevier lors du balayage de la surface. Réduire le nombre de pixels dans l'image réduit donc le temps d'acquisition ; Dans le même temps, la taille de la zone numérisée doit être réduite du même facteur, afin de ne pas perdre en résolution (cela revient à conserver la même taille absolue en pixels).
Biomolécules
- Imagerie
- Courbes force-distance
A ma connaissance, c'est avec l'AFM développé par Ando et al (22) que la fréquence d'acquisition d'images la plus élevée a été atteinte, en milieu liquide, après amélioration des principaux facteurs limitants présentés précédemment. D'autres assemblages supramoléculaires tels que les fibrilles (28) ou des éléments du cytosquelette cellulaire (filaments d'actine, microtubules) (26) sont également étudiés par l'AFM.
Membranes
La faisabilité de ces études est désormais largement démontrée, mais l'interprétation des données issues des courbes force-distance dépend du modèle physique utilisé pour décrire la mécanique de la macromolécule et reste généralement délicate. B : Courbe force-distance enregistrée au niveau d'une protéine individuelle, dont la position dans l'image AFM est donnée par la flèche blanche en C.
Cellules
Les courbes force-distance commencent à être utilisées pour analyser les propriétés mécaniques des cellules vivantes, telles que l'adhésion cellule-cellule (38) ou les propriétés élastiques locales des cellules (39). L’interprétation des résultats au-delà de la propriété mécanique apparente reste cependant délicate : la cellule est un objet très complexe à modéliser, composé de composants aux propriétés mécaniques très différentes (membrane, cytosquelette, etc.) et peut être déformé dynamiquement au cours de l’étude. conditions dans le milieu liquide.
CryoAFM
Adsorption et étalement de l’ADN sur le mica
Présentation du substrat AFM, le mica
Le mica, de par sa planéité une fois clivé et ses propriétés de surface, est la surface la plus utilisée en AFM pour déposer des molécules biologiques, même si d'autres surfaces sont parfois utilisées : verre, silicium, graphite HOPG, or, doubles couches lipidiques supportées (2). La charge à la surface du mica clivé est donc généralement négative, mais cette charge négative n'est pas répartie de manière homogène. De plus, en présence de liquide déposé en surface, un échange s'effectue entre les ions K+ de la surface et les cations de la solution ; cet échange s'effectue également de manière hétérogène (4).
Problématique de l’étalement de l’ADN sur la surface
Problématique de l’observation des interactions ADN-protéines par AFM
En travaillant en milieu liquide on peut aussi tenter de suivre l'évolution dynamique des complexes, la condition supplémentaire est alors de parvenir à un compromis entre adhésion à la surface et disponibilité des molécules. La possibilité de travailler en milieu liquide en AFM a suscité de grands espoirs pour l’analyse du comportement des protéines le long de l’ADN. Cependant, l’observation en milieu liquide doit s’inscrire dans la continuité de la démarche d’observation dans l’air, puisque les interactions des biomolécules avec la surface sont de même nature.
Méthode des cations divalents
- Données principales sur l’adsorption
- Applications
Avec certains traitements de surface, l'adsorption est plus brutale et la capture rapide des molécules en surface est plus susceptible de donner des conformations de type « projection 3D-2D » de la chaîne d'ADN. Les cations divalents (ici le magnésium) génèrent une attraction électrostatique entre l'ADN et la surface du mica. Cependant, l'activité enzymatique des complexes actifs en surface et le taux de transcription (~1 nucléotide/seconde) de l'ADN sur le mica sont inférieurs à l'activité (~70-80 % des complexes actifs en solution) et le débit (~5 nucléotides/s) de la même réaction effectuée dans la solution (18).
Méthodes de fonctionnalisation par des groupes chargés positivement
- AP-mica
- Surfaces dérivées de l’AP-mica
- Autres fonctionnalisations
La surface de l'APS-mica est moins réactive que celle de l'AP-mica, mais l'étude de la cinétique d'adsorption en surface suggère que les molécules s'y fixent de manière irréversible. Le mica traité à la poly-L-lysine (56) ou à la poly-L-ornithine (41) permet de stocker l'ADN en surface pour une imagerie dans l'air ou en milieu liquide d'une manière assez similaire aux souris AP- (41) . Sur ces surfaces, la conformation de l'ADN ressemble plus à une projection 3DÆ2D de la conformation en solution qu'à une conformation résultant d'un équilibre 2D sur la surface (41).
Discussion
Dans le cas des complexes ADN-protéine, aucune des deux méthodes de fixation et de propagation de l'ADN n'est vraiment satisfaisante à ce jour. Ce qui ressort de cette évaluation est la nécessité d’une approche encore plus rationnelle de l’adsorption et de la dispersion de l’ADN. Les données empiriques sur la méthode des cations divalents indiquent certains paramètres importants pour l'adsorption de l'ADN sur le mica.
Modélisation des forces d’interactions électrostatiques ADN-mica
- Force d’interaction des doubles couches électriques
- Force associée aux corrélations de position entre cations
- Comparaison des forces de répulsion et d’attraction
Etude expérimentale de l’effet de la charge de la surface et des concentrations en
- Matériels et méthodes
- Effet d’un prétraitement par les ions nickel
- Effet des concentrations en cations monovalents et divalents
Par conséquent, la force de l’interaction entre les doubles couches électriques du mica et de l’ADN n’explique pas l’absorption de l’ADN sur le mica. La liaison entre les positions des cations divalents de l’ADN et du mica génère une force attractive. La force d’attraction prévaut et il existe une possibilité d’adsorption forte de l’ADN à la surface du mica.
Discussion
- Discussion du modèle proposé
- Discussion des applications à l’étude des complexes ADN-protéines
Ainsi, nous avons la possibilité de modifications réversibles de la force d'adsorption des molécules d'ADN sur le mica prétraité au nickel. Nos travaux suggèrent des moyens de moduler la force d'adsorption de l'ADN sur le mica, qui sont pleinement confirmés expérimentalement d'un point de vue qualitatif. III - Trouver un système d'ancrage des extrémités d'ADN au mica entre deux plots distants.
Matériel et méthodes
- Préparation d’ADN fonctionnalisé à une ou deux extrémités
- Plots couplés aux extrémités en une étape de réaction
- Plots couplés aux extrémités en deux étapes de réaction
- Microscopie électronique à transmission
- Méthodologies de test de l’ancrage des plots à la surface
La stabilité de l’ancrage des extrémités à la surface doit être testée par rapport au référentiel d’adsorption et de désorption d’ADN développé précédemment (Partie II de ce chapitre). C'est un avantage de pouvoir connecter des plots aux extrémités de l'ADN en une seule étape de réaction. Ceci permet, outre la question de l'adsorption et de la désorption, de répondre à la question de la mobilité des taches complexées à l'ADN en surface.
Résultats et discussion
- Streptavidine
- Streptavidine-peroxydase
- IgG anti-digoxygénine
- ADN simple brin biotinylé
- Etiquette histidine biotinylée
- BSA biotinylée
The main actor of binding to the surface is usually the adsorption of DNA molecules. In addition, we explain how a reversible binding of DNA molecules to a pretreated mica surface can be obtained. Weak electrostatic binding of DNA to the surface is achieved by using divalent cations.
In addition, we describe the effect of the surface charge density on the DNA adsorption. Low surface concentration of divalent cations leads to a very loose attachment of the DNA to the surface.
Accessibilité et réactivité de l’ADN adsorbé sur la surface
Méthodologie de préparation des échantillons
- Clivage de l’ADN adsorbé sur le mica par la bléomycine
- Clivage de l’ADN en solution par la bléomycine
- Paramètres testés
- Observation AFM
Méthode de détermination du nombre moyen de coupures par molécule d’ADN. 138
Avant nos travaux, le clivage de l'ADN par la bléomycine n'avait jamais été étudié par l'AFM, même qualitativement, et il n'existait aucune méthodologie pour analyser l'influence de la surface sur les interactions ADN-bléomycine. Nous adsorbons l'ADN sur le mica pendant une minute, puis diluons la concentration d'ADN d'environ un facteur 5 lorsque nous ajoutons la solution de bléomycine. En plus d'être un acteur important dans l'absorption (voir chapitre 3), le magnésium est connu pour avoir, en solution, un rôle inhibiteur dans le clivage de l'ADN par la bléomycine (11,12).
Validation de la méthode de détermination de n
Nous avons commencé par tester si notre méthodologie permettait de quantifier de manière fiable le taux moyen de coupe n de l'ADN par la bléomycine, puis nous avons étudié l'influence de la surface sur l'évolution de n en fonction des différents paramètres conservés.
Etude de l’influence de la surface
- Evolution de n avec [Mg 2+ ]
- Evolution de n avec [Ni 2+ ]
- Evolution de n avec [bléomycine] et effet de l’ascorbate
5 Plot of number of DNA breaks per molecule versus Fe(III)-bleomycin concentration for large-scale reactions. On the mica surface, the number of DNA breaks is slightly increased by about threefold. Figure 8 shows the number of DNA breaks per molecule in relation to the concentration of 1 ll NiCl2.
Etude des interactions entre l’ADN et la protéine Ku
- Localisation cellulaire
- Données structurales sur l’hétérodimère Ku70/80
- Implication de Ku dans la réparation des cassures double brin de l’ADN
- Interaction de Ku avec les protéines impliquées dans le NHEJ
- L’association Ku-DNA-PKcs
- Interaction de Ku avec d’autres partenaires impliqués dans le NHEJ
- Cas de la recombinaison V(D)J
- Implication de Ku dans d’autres mécanismes
- Introduction
- Matériels et méthodes
- Protéine Ku
- ADN
- Complexes streptavidine - ADN biotinylé aux extrémités
- ADN avec cassures simple brin
- Microscopie électronique à transmission
- Microscopie à force atomique
- Résultats et discussion
- Etude par AFM
- Etude en MET
- Discussion
La structure de l'ADN-PKcs (42, 43) et les changements conformationnels induits par l'ADN (44) ont été étudiés par microscopie électronique (examiné dans (29)). WRN est capable de déplacer l'ADN-PKc des extrémités de l'ADN (62) et intervient dans la maturation des extrémités à joindre (62, 63). Où joue un rôle majeur dans la réparation des cassures double brin de l’ADN à travers la voie NHEJ.
