Interaction de Ku avec les protéines impliquées dans le NHEJ

1. L’association Ku-DNA-PKcs.

Le complexe Ku+DNA-PKcs forme l’enzyme DNA-PK, l’un des acteurs principaux du mécanisme NHEJ de réparation des cassures double brin de l’ADN (pour des revues sur la DNA-PK voir (36-40)). La DNA-PK (Ku + DNA-PKcs) s’assemble en présence d’ADN (41).

1.1. La DNA-PKcs.

La DNA-PKcs (ou p460) est une protéine d’environ 460 kDa. Le gène de la DNA- PKcs est désigné par XRCC7 (7). La partie C-terminale de la protéine la rattache à la famille des phosphatidyl inositol 3 – kinases (PI3-kinases), mais son activité est de type protéine- kinase (37). La phosphorylation intervient sur un motif S/T-Q (sérine ou thréonine suivie d’une glutamine). La structure de la DNA-PKcs (42,43) et les changements conformationnels induits par l’ADN (44) ont été étudiés par microscopie électronique (revue dans (29)). La DNA-PKcs libre peut être décrite par une organisation en trois domaines : tête, paume, et bras connectant la tête et la paume. La DNA-PKcs liée à l’ADN présente des changements conformationnels substantiels. En particulier, la paume est repliée vers la tête, laissant libre entre les deux un petit canal suffisamment large pour accueillir de l’ADN double brin (figure I-5).

Figure I-5 : Organisation tridimensionnelle de la DNA-PKcs seule ou liée à l’ADN. Figure d’après (29).

1.2. Interactions Ku/DNA-PKcs.

La région C-terminale de Ku80, en particulier ses 12 derniers acides aminés, a une interaction fortement spécifique avec la DNA-PKcs (19), que Ku recrute aux extrémités de l’ADN dans le NHEJ (l’association de la DNA-PKcs aux extrémités de l’ADN peut cependant

se faire même en l’absence de Ku (45)). Le recrutement de la DNA-PKcs induit une translocation de Ku de l’extrémité vers l’intérieur de la molécule d’ADN (46). Une structure tridimensionnelle de la DNA-PKcs associée à Ku sur l’ADN vient très récemment d’être établie, avec une résolution d’environ 2,5 nm (47).

1.3. Activité DNA-PK.

a. Activation.

La DNA-PKcs seule a une activité kinase considérée comme faible. Elle peut se lier à l’ADN linéaire et son activité kinase en être stimulée même en l’absence de Ku (48) mais l’activité est grandement stimulée par l’association avec Ku aux extrémités de l’ADN. Ku et la DNA-PKcs ne peuvent pas se lier simultanément à un fragment d’ADN s’il est trop court (18 paires de bases ne permettent la fixation que d’une des deux protéines, exclusivement de l’autre) ; le fragment d’ADN doit être suffisamment long pour une liaison simultanée pour que Ku stimule l’activité kinase de la DNA-PKcs (48). La DNA-PKcs est aussi activée par les extrémités simple brin (49,50). Nous ne détaillerons pas ici les protéines autres que Ku pour lesquels un effet activateur a été montré, plusieurs sont récapitulées dans la revue (37).

b. Inhibition, ciblage pharmacologique.

L’activité DNA-PK peut être inhibée notamment par la wortmannine et par le composé LY294002 (51) ou par le composé Nu7026, dérivé du précédent et beaucoup plus spécifique (52). La DNA-PK est une cible pharmacologique dans le traitement du cancer par chimiothérapie et radiothérapie ; son inhibition a un effet de radio- et chimiosensibilisation (53).

c. Substrats impliqués dans le NHEJ.

La DNA-PK phosphoryle Ku, XRCC4 et Artemis. La DNA-PKcs est également capable de s’autophosphoryler, ce qui est nécessaire pour qu’elle se dissocie de Ku. Cela conduit à la libération de la DNA-PKcs des extrémités de l’ADN, nécessaire pour la progression ultérieure du NHEJ avec les étapes de maturation des extrémités à rabouter puis leur ligation. XRCC1, impliquée dans la voie de jonction des extrémités alternative au NHEJ évoquée en I-C., est aussi phosphorylée par la DNA-PK (54).

d. Régulation de l’entrée de Ku sur l’ADN.

L’activité DNA-PK régule l’entrée de Ku sur l’ADN (53). En situation de kinase active, Ku rentre et s’accumule le long de l’ADN, qu’elle rend inaccessible ; des mécanismes tels que la réparation par la voie de Nucleotide Excision Repair ou NER (55,56) ou la transcription (56) sont alors inhibés. En situation de kinase inhibée, Ku reste à l’extrémité, avec la DNA-PKcs ; l’activité enzymatique aux extrémités (dégradation, synthèse ou ligation) est en grande partie empêchée (57) mais le reste de la molécule d’ADN est accessible et le NER ou la transcription ne sont pas bloqués (56) (figure I-6).

Figure I-6 : Implication de l’activité kinase ou de son inhibition sur la réparation des cassures double brin dans le NHEJ. Figure d’après (58)

e. Autres substrats.

Comme les protéines ATM et ATR, la DNA-PK joue un rôle essentiel dans la signalisation des dommages de l’ADN et l’initiation de la réponse de la cellule à ce stress génotoxique (59). LA DNA-PK phosphoryle de nombreux substrats, récapitulés dans la revue (38), après la détection des dommages.

2. Interaction de Ku avec d’autres partenaires impliqués dans le NHEJ.

Ku interagit directement (par contact physique) ou indirectement (par la régulation de l’activité kinase de la DNA-PKcs) avec les autres partenaires du NHEJ, qui interviennent dans les étapes postérieures au recrutement de la DNA-PKcs au niveau extrémités à rabouter. Nous présentons ici succinctement ces partenaires et leurs interactions connues avec Ku.

2.1. WRN.

La protéine du syndrome de Werner (WRN) est une protéine de 160 kDa (1432 acides aminés), qui possède une activité hélicase et exonucléase avec une directionnalité 3’Æ 5’

(pour une revue voir (60)). Ku70/80 et WRN interagissent directement, en l’absence d’ADN ; les deux protéines copurifient et coimmunoprécipitent (61). Ku n’a pas d’effet sur l’activité hélicase ou ATPase de WRN mais stimule fortement son activité exonucléase (61). WRN est capable de déplacer la DNA-PKcs des extrémités de l’ADN (62) et intervient dans la maturation des extrémités à rabouter (62,63).

2.2. Artemis.

La protéine Artemis (pour une revue voir (64)) purifiée possède une activité exonucléase orientée 5’Æ3’ sur les extrémités simple brin sortantes. Elle est capable de

former un complexe avec la DNA-PKcs en l’absence d’ADN (65) mais n’a pas à notre connaissance d’interaction directe avec Ku. Artemis est l’une des cibles de phosphorylation de la DNA-PK (66). La phosphorylation d’Artemis lui confère une activité endonucléase sur les extrémités simple brin 5’ ou 3’ et les hairpins (65). Artemis intervient à la fois dans la maturation des extrémités à rabouter dans le NHEJ, et dans l’ouverture des hairpins dans la recombinaison V(D)J.

2.3. Polymérases λ et µ.

Ces polymérases interviennent pour la synthèse d’ADN à l’étape de maturation des extrémités dans la voie NHEJ (67,68). Dans des extraits cellulaires, Pol µ s’associe avec Ku.

In vitro, Pol µ a besoin de Ku et du complexe XRCC4-ligase IV pour former un complexe stable sur l’ADN. Réciproquement Pol µ facilite le recrutement de XRCC4-ligase IV sur l’ADN lié à Ku et la jonction des extrémités par la ligase IV (67). Pol λ pourrait être la principale responsable du remplissage des brèches au niveau de la jonction (69).

2.4. PNK.

La PNK est une 5’kinase/3’phosphatase qui génère les extrémités 5’

phosphate/3’hydroxyle prérequises pour l’étape de ligation du NHEJ (70). La structure de cette enzyme a été déterminée par cristallographie (71). Il a été montré une interaction directe de la PNK avec XRCC4 (72) mais à notre connaissance pas avec Ku ni avec la DNA-PKcs.

La PNK interagit aussi avec XRCC1 (73), impliquée dans l’initiation de la réparation par la voie de Base Excision Repair ou BER à partir de cassures simple brin et dans la voie de jonction des extrémité alternative au NHEJ évoquée en I-C. .

2.5. Le complexe XRCC4-ligase IV.

XRCC4 et la ligase IV forment un complexe dans la cellule, avec une interaction particulièrement forte. La cristallographie indique que ce complexe est un dimère de XRCC4 associé à un monomère de ligase IV (74). La ligase IV catalyse l’étape finale de ligation dans le NHEJ. Il existe une interaction protéine-protéine spécifique et directe (ne nécessitant pas l’ADN comme cofacteur) entre Ku et la ligase IV (75). XRCC4 et la ligase IV font également partie des cibles de phosphorylation de la DNA-PK. Le recrutement du complexe XRCC4- ligase IV sur les cassures double brin est dépendant à la fois de Ku et de la DNA-PKcs. Lors de sa liaison à une extrémité d’ADN, il pourrait induire une translocation de Ku vers l’intérieur de la molécule (76).

3. Cas de la recombinaison V(D)J.

Comme évoqué en I-C., les partenaires de Ku dans le NHEJ interviennent aussi dans la recombinaison V(D)J. Il a de plus été en mis en évidence une interaction entre Ku et l’enzyme TdT (Terminal Deoxinucleotidyl Transferase), qui suggère que Ku pourrait recruter TdT au niveau des extrémités d’ADN pendant la recombinaison V(D)J (77). Cette enzyme ajoute des nucléotides aux extrémités 3’ libres, contribuant ainsi de manière majeure à la génération de diversité de séquence au niveau des extrémités produites pendant la recombinaison V(D)J.