Streptavidine

Figure III-10 : Récapitulatif schématique des trois niveaux de contrôle de la cellule liquide : flux entrant, surface du mica, flux sortant.

Toutes les images en milieu liquide ont été obtenues en mode contact intermittent sur un AFM Multimode de Veeco Instruments associé au contrôleur Nanoscope IIIa. Nous avons utilisé pour l’observation en milieu liquide les microleviers contact DNP commercialisés par Veeco Instruments avec une excitation en mode acoustique entre 5 et 20 kHz et une amplitude d’oscillation de quelques nanomètres. Une correction de planéité (flatten) est effectuée sur toutes les images brutes avec le logiciel du Nanoscope.

5.4. Mesures.

Pour les mesures de distance bout à bout des molécules d’ADN ou le comptage des plots sur la surface à densité élevée, nous avons en outre utilisé le logiciel de traitement et d’analyse d’images « ImageJ » développé par les National Institutes of Health (NIH) américains et distribué sur le site http://rsb.info.nih.gov/ij/.

Les distances bout à bout sont mesurées sur au moins 200 molécules à partir d’images d’ADN contrôle de 1440 paires de bases (extrémités libres) ou d’images des complexes entre ce même ADN et les plots de chaque type (un plot à chacune des deux extrémités) observés à l’air.

Les comptages de plots sont effectués après seuillage et binarisation des images AFM.

Le même niveau de seuillage est pris pour les différentes images d’une même expérience ; en revanche il est en général changé d’une expérience à l’autre.

est d’utiliser un rinçage à l’eau après le rinçage avec le tampon d’adsorption, ce qui avait déjà été suggéré par Seong et al (71).

La densité observée après un rinçage à l’eau constitue donc notre condition de référence pour l’observation à l’air. En absence comme en présence de cations divalents dans la solution de dépôt, dans la gamme de conditions ioniques testée (MgCl2 entre 0 et 10 mM, NaCl entre 0 et 50 mM), la streptavidine s’adsorbe sur la surface, sans que ces conditions aient une influence nette et reproductible sur la densité en plots sur la surface. Nous avons en revanche mis en évidence une différence significative en comparant l’effet d’un rinçage à l’eau et l’effet d’un rinçage à haute concentration en sel monovalent : le rinçage par une solution de Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM fait partir la majorité des plots de streptavidine de la surface, que l’adsorption ait été faite en absence ou en présence de cations divalents. Ce résultat est vérifié pour une large gamme de concentrations en streptavidine dans la solution d’adsorption (1 nM à 1 µM) ; l’exemple de la figure III-11 correspond à une concentration de 100 nM.

Figure III-11 : Effet d’un rinçage Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM sur les plots de streptavidine adsorbés sur mica non traité.

Dépôt : [streptavidine] = 100 nM dans Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM.

Gauche : surface rincée seulement à l’eau ; ~25-30 plots/µm².

Droite : surface rincée au Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM puis à l’eau ; ~0 plot/µm².

AFM à l’air ; scans : 3 µm x 3 µm ; échelle en Z : 5 nm.

Cet effet d’un rinçage à haute force ionique en NaCl est confirmé en milieu liquide, en se limitant à tester la gamme 1 nM-100 nM en streptavidine pour éviter d’atteindre trop vite une densité élevée de plots sur la surface lors de l’adsorption. En injectant la streptavidine en Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM les molécules se déposent sur la surface, et en augmentant la concentration en sel monovalent à Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM les molécules se désorbent de la surface. L’augmentation de la concentration en sels monovalents désorbe la streptavidine de la surface de mica non traité.

1.2. Complexes ADN-plots sur mica non prétraité.

La comparaison entre les distances bout à bout moyennes des molécules d’ADN contrôle (extrémités libres) ou avec une streptavidine à chacune des deux extrémités sur mica non prétraité (figure III-12) ne met pas en évidence de différence significative. Ce sont vraisemblablement les interactions ADN-surface médiées par les cations qui dominent ici et on n’est pas suffisamment sensible à ce qui se passe aux extrémités.

Figure III-12 : Distance bout à bout moyenne entre les extrémités des molécules d’ADN : comparaison extrémités libres / extrémités streptavidine. ADN de 1440 paires de bases. Mica non prétraité ; tampon de dépôt : Tris 10 mM pH 7,5 MgCl2 10 mM NaCl 50 mM.

1.2 Plots seuls sur mica prétraité nickel.

Nous nous sommes alors demandés si l’interaction de la streptavidine avec le mica prétraité nickel serait plus forte. Pour cela nous avons comparé par observation à l’air l’effet de rinçages à force ionique en NaCl élevée sur la streptavidine adsorbée sur des surfaces de mica non prétraitées et prétraitées par du nickel 1 mM. Par exemple, après une adsorption en tampon Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM à une concentration de streptavidine de 1 µM, la densité de streptavidine qui reste sur la surface après un rinçage au Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 400 mM est beaucoup plus importante sur mica prétraité nickel que sur mica non prétraité (figure III-13).

0 50 100 150 200 250 300

Contrôle : extrémités libres Streptavidine

Type de plot

Distance bout à bout moyenne (nm)

Figure III-13 : Evolution de la densité de streptavidine sur la surface en fonction du prétraitement. La concentration de streptavidine déposée est de 1 µM. Le tampon de dépôt est NaCl 50 mM Tris 10 mM (pH 7,5). Au bout d’une minute les micas ont été rincés au NaCl 400 mM Tris 10 mM (pH 7,5) puis à l’eau.

Gauche : mica non prétraité ; ~ 0-5 plots/µm².

Droite : mica prétraité par des ions nickel (1 mM) ; ~ 35-40 plots/µm².

1.3 Complexes ADN-plots sur mica prétraité nickel.

Les observations sur les plots seuls ont indiqué que l’adsorption de la streptavidine est plus robuste sur mica prétraité nickel que sur mica non prétraité vis-à-vis d’un rinçage à haute force ionique en NaCl. L’adsorption sur mica prétraité nickel semble donc plus favorable à une utilisation de la streptavidine comme plot d’ancrage de l’ADN.

Pour comparer le comportement de la streptavidine et celui de l’ADN sur cette surface, nous avons testé en milieu liquide l’accroche de la streptavidine complexée à une extrémité d’ADN. Les complexes sont préparés avec l’ADN 1440b, ce qui permet d’analyser la mobilité de chacune des deux extrémités des molécules sur la surface du mica. Les conditions d’adsorption retenues sont des conditions de bonne adsorption de l’ADN (typiquement, Tris 10 mM pH 7,5 MgCl2 10 mM NaCl 10 mM) ; cela aide aussi la streptavidine complexée à l’extrémité biotinylée à venir sur la surface. Nous observons que chacune des deux extrémités (extrémité libre, extrémité liée à une streptavidine) reste mobile sur la surface du mica (déplacement de plusieurs dizaines de nanomètres entre les images successives).

Ces résultats permettent de conclure que dans le référentiel de conditions testées, la streptavidine, malgré une interaction plus forte avec le mica prétraité nickel, n’a pas une adsorption suffisamment robuste pour ancrer l’extrémité de l’ADN à cette surface.