Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha

Le premier objectif était d'augmenter la significativité du test comète en ajoutant une étape d'exposition des cellules lysées à une enzyme de détection spécifique des lésions oxydatives.

En effet cette étape permet de détecter des cassures supplémentaires spécifiques de l'oxydation de l'ADN, non détectées par le test comète seul.

1.1. Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha

Dreissena polymorpha a été sélectionnée comme modèle biologique pour de multiples raisons. Il s'agit d'un organisme filtreur, donc très exposé aux contaminants présents dans la colonne d'eau. Vivant fixée sur des supports, la dreissène présente un avantage pour l'étude de la génotoxicité d'une zone bien définie. De plus, il s'agit d'un organisme facile à identifier et à échantillonner possédant une large distribution géographique. Enfin, sa résistance à la

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transplantation en fait un organisme intéressant. En effet, de nombreuses études de biomonitoring utilisent la méthode de transplantation des dreissènes dans le but d'étudier l'impact de la contamination chimique du milieu par la mesure des cassures de brins de l'ADN (Frenzilli et al., 2009), la fréquence des micronoyaux (Mersch and Beauvais 1997) ou encore le taux d'adduits à l’ADN (Le Goff et al., 2006).

1.2. Utilisation des cellules branchiales

La recherche de biomarqueurs de génotoxicité tels que les cassures des brins d'ADN et la fréquence de micronoyaux a été réalisée sur les cellules de la glande digestive (Le Goff et al., 2006), de l'hémolymphe (Mersch et al., 1996; Bourgeault et al., 2010; Vincent-Hubert et al., 2011) ou des branchies (Mersch et al., 1996; Vincent-Hubert et al., 2011). Les branchies présentent un avantage par rapport aux autres types de cellules. En effet l'activité de filtration des moules favorise un contact continu entre les cellules branchiales et les contaminants de l’eau. De ce fait, l'étude des lésions de l'ADN au niveau de ces cellules est très représentative de l'impact des contaminants présents dans la colonne d'eau. La simplicité de prélèvement des branchies de la dreissène en fait un aussi bon outil d’étude. En prenant les précautions nécessaires lors de l'étape de digestion enzymatique, le taux de viabilité cellulaire est suffisamment important (> 90%) et le nombre de cellules satisfaisant pour la réalisation des tests de génotoxicité. C'est donc ce type cellulaire que nous avons choisi d'utiliser dans ce travail de thèse.

1.3. Test comète couplé à hOGG1

Le test comète permet de mesurer les cassures induites par les génotoxiques, de manière directe ou indirecte ainsi que les sites alcali-labiles, nous renseignant sur l'impact des composés génotoxiques présents dans l'environnement. Cependant, ce test rend compte aussi des processus de réparation par excision et resynthèse qui génèrent des coupures transitoires de l’ADN et qui ne doivent pas être considérées comme des dommages en soi, mais comme marqueurs de l’exposition à des facteurs génotoxiques (Shaw et al., 2000; Smart et al., 2006).

Le développement in vitro du protocole du test comet-hOGG1 sur les cellules de branchies de dreissènes, exposées à H₂O₂, agent oxydant, montre qu'il est possible de détecter des cassures supplémentaires par l'incubation des cellules lysées à hOGG1. En effet, le niveau d'oxydation détecté par hOGG1 sur des cellules de branchies exposées in vitro pendant une heure à 200µM

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d'H₂O₂ représente 24% de l'ensemble des cassures à l'ADN détectées par le test comète seul.

Après une exposition in vitro à 99nM de BaP, le niveau d'oxydation correspond à 18%. Les niveaux d'oxydation mesurés par le test comet-hOGG1 sur des cellules exposées à ces deux composés sont du même ordre de grandeur.

In vivo, la spécificité de hOGG1 face aux dommages oxydatifs est retrouvée. En effet, chez les moules exposées au BaP, on observe une augmentation du taux de cassures à l'ADN avec le test comet-hOGG1 suivant une relation dose-réponse (39% avec BaP 40nM et 74% avec BaP 120nM). En revanche, après une exposition des moules au MMS, seul le test comet-Fpg détecte une augmentation du taux de cassures à l'ADN (7%).

D'après la littérature, le niveau d'oxydation de l'ADN détecté par le test comet-hOGG1 varie selon le type cellulaire et selon l'agent oxydant. En effet, après une irradiation aux rayons γ de 10Gy, le taux de cassures indiquant le niveau d'oxydation correspond à 25% des cassures détectées par le test comète seul, tandis que le traitement des cellules de lymphomes de souris par le KBrO₃ (2,5mmol/L) produit une augmentation du taux de cassures supplémentaires correspondant à 4000% du taux de cassures à l'ADN par le test comète seul (Smith et al., 2006).

Dans une autre étude, le taux d'oxydation induit dans des fibroblastes humains par 1µM de 6- thioguanine irradiés par des UV-A (1J/cm²) pendant 48h est équivalent à 50% du taux de dommages à l'ADN détectés par le test comètes seul (Cooke et al., 2008).

Des mesures des dommages oxydatifs de l'ADN ont été réalisées sur des bivalves avec le test comet-Fpg, enzyme moins spécifique que hOGG1 envers la lésion 8-oxodG. On retrouve un niveau d'oxydation de l'ADN correspondant à 38% sur des hémocytes d'huîtres exposés in vitro à 88µM de H₂O₂ (Gielazyn et al., 2003). Une autre étude a permis de mesurer des taux de sites sensibles à la Fpg chez Dreissena polymorpha de 13,8 et 23,3% après exposition à 10µg/L de Cd, après respectivement 1 et 3 jours d'exposition (Vincent-Hubert et al., 2011). Ces différentes études montrent un niveau d'oxydation de l'ADN des cellules de bivalves assez proche de ceux mesurés dans notre étude. Le taux de dommages oxydants à l'ADN détecté par le test comète modifié, après exposition à H₂O₂ et au BaP, se situe entre 10 et 40% du taux de cassures à l'ADN détecté par le test comètes seul.

- 151 - 1.4. Conclusions

Les résultats du test comet-hOGG1 sur cellules branchiales de moules zébrées sont concluants et permettent de mettre en évidence une oxydation de l'ADN aussi bien in vitro, qu'in vivo. De plus, le test comet-hOGG1 montre un effet-dose du BaP. Enfin, l'absence de sites sensibles à hOGG1 après exposition au MMS confirme la validité du protocole comet-hOGG1 in vitro et in vivo.

2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des