Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des lésions

- 151 - 1.4. Conclusions

Les résultats du test comet-hOGG1 sur cellules branchiales de moules zébrées sont concluants et permettent de mettre en évidence une oxydation de l'ADN aussi bien in vitro, qu'in vivo. De plus, le test comet-hOGG1 montre un effet-dose du BaP. Enfin, l'absence de sites sensibles à hOGG1 après exposition au MMS confirme la validité du protocole comet-hOGG1 in vitro et in vivo.

2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des

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Ces études soulignent donc la nécessité de prendre en compte la capacité de réparation de l'ADN dans l'interprétation des niveaux de cassures à l'ADN détectés lors d'études de biomonitoring. Il est donc nécessaire de coupler le test comète à d’autres biomarqueurs mettant en évidence des lésions plus stables dans le temps, comme par exemple les micronoyaux. De nombreuses études de biomonitoring recoupent les informations obtenues par le test comète et le test micronoyaux (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Bourgeault et al., 2010), montrant une bonne corrélation entre les deux tests et une différence inter-sites basées sur une augmentation du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence des micronoyaux sur les sites contaminés.

Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1

Nos résultats montrent que le BaP induit une oxydation rapide de l’ADN dans les cellules de branchies de moules dès 6h d'exposition. Par ailleurs, le taux de cassures supplémentaires détectées par l'enzyme hOGG1 correspond en moyenne à 30% du taux de cassures à l’ADN détectées par le test comète seul. Mitchelmore et al. (1998) ont montré, par l’utilisation de l'anti- radicalaire N-N-t-butyl-α-phenylnitrone (PBN), une diminution du taux de cassures à l’ADN de près de 75%, confirmant l’implication des radicaux libres dans la génotoxicité du BaP et donc dans l’induction de lésions oxydatives. Bien que la capacité de métabolisation du BaP par les bivalves soit faible (Mitchelmore et al., 1998) nos résultats montrent que les cellules branchiales des dreissènes sont capables de transformer le BaP en métabolites actifs pouvant altérer l’ADN et induire des dommages oxydatifs.

Réparation des lésions oxydatives induites par le BaP

Les lésions oxydatives de l'ADN induites par le BaP sont rapidement réparées, puisqu’après 24h de dépuration les sites sensibles à hOGG1 ne sont plus détectés, quelle que soit la concentration en BaP. En effet, la même observation a été faite sur des moules marines, où le taux de 8-oxodG mesuré dans les moules marines revient au niveau des valeurs du témoin, après cinq jours de dépuration, confirmant l’existence de mécanismes de réparation des lésions oxydatives, notamment par la voie BER (Akcha et al., 2000).

- 153 - 2.2. Exposition de Dreissena polymorpha au Cd Détection des cassures de brins par le test comète

Nos résultats confirment que l’exposition des dreissènes au Cd induit une augmentation significative et rapide du taux de cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011) suivant une relation dose-réponse. Ces cassures à l'ADN ne résultent pas de l'action directe du Cd sur l'ADN (Valverde et al., 2001). En effet, le cadmium affecte la stabilité du génome en induisant la génération de ROS telles que l'ion superoxyde, le radical hydroxyle et le peroxyde d'hydrogène (Bertin and Averbeck 2006), mais aussi en inhibant les systèmes de réparation de l'ADN, en induisant une déplétion du glutathion et des protéines à groupements thiols. Emmanouil et al.

(2007) ont détecté une augmentation de cassures à l’ADN après exposition au Cd chez la moule marine. L'hypothèse émise pour expliquer cette observation concerne l’enzyme de détection des bases oxydées chez les moules. S'il s'agit d'une enzyme homologue de OGG1 contenant des groupements thiols, l’affinité du Cd pour les groupements thiols pourrait inactiver la réparation des lésions oxydatives (Potts et al., 2001). En effets, la liaison du Cd sur les groupements thiols de l'enzyme pourrait nuire à son activité de réparation des lésions oxydatives (Bravard et al., 2006).

Stabilité des cassures de brin

Le taux de cassures de brin induit par le Cd diminue légèrement à la fin de la période de dépuration (6 jours) mais n'atteint pas le niveau basal. Seul le taux de cassures induit par la plus forte concentration de Cd (81µg/L) retrouve un niveau basal. Ces résultats montrent un retard de réparation des lésions de l'ADN induite par le Cd (à la plus faible concentration). A notre connaissance, aucune étude de mesure de cassures de brins par le Cd n'est suivie par une période de dépuration des organismes après l'exposition, ce qui ne nous permet aucune comparaison de nos résultats. Une étude d’exposition de la dreissène au Cd (10µg/L) induit une augmentation des cassures de brins mais à cinq et onze jours on observe une diminution significative du taux de cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011). Cette diminution du taux de cassures à l'ADN pourrait être due à une détoxification du Cd par les moules (Vincent-Hubert et al., 2011).

- 154 - Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1

Notre étude montre une induction de lésions oxydatives de 25% par le Cd. Le Cd n'est pas un génotoxique direct mais il est cependant impliqué dans la production de radicaux libres, du radical superoxyde, du radical hydroxyle et de l’oxyde nitrique (Waisberg et al., 2003).

Emmanouil et al. (2007) n'ont pas détecté de dommages oxydatifs significatifs sur des moules exposées au Cd (200µg/L) durant dix jours, mais ont observé une augmentation de produits finaux de péroxydation lipidique suggérant la formation de ROS par le Cd. En revanche, l’étude de Vincent-Hubert et al. (2011) a mis en évidence la présence de sites sensibles à Fpg par le test comet-Fpg indiquant la présence de lésions oxydatives. Ce niveau s’élève à 13,8% et 23,3% du taux de final de cassures détecté par le test comet-Fpg. Ces niveaux d'oxydation sont du même ordre que ceux mesurés par nos études confirmant la bonne sensibilité du test comet-hOGG1.

Stabilité des lésions oxydatives induites par le Cd

Le taux de sites sensibles à hOGG1 mesuré lors de la phase de dépuration montre que les lésions oxydatives induites par le Cd sont réparées plus lentement que celles induites par le BaP.

En effet, le Cd est connu pour agir sur l'activité de réparation des lésions de l'ADN en interférant avec la dernière étape de la voie BER. Ainsi, l’inhibition de cette étape finale de ligation peut induire une augmentation de l'accumulation de cassures simple brin, issues de la réparation incomplète des lésions oxydatives (Emmanouil et al., 2007).

2.3. Conclusions

D’après nos résultats, le test comet-hOGG1 permet de détecter des lésions précoces de l’ADN. Les lésions oxydatives induites par le BaP sont rapidement réparées, puisqu’après 24h de dépuration le taux de sites sensibles à hOGG1 devient nul. Le retard de la réparation des lésions oxydantes induites par l’exposition des moules au Cd suggère une inhibition de la réparation de ces lésions par le Cd.

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3. Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un