urbaine et variabilité naturelle des lésions de l’ADN

Ce travail de fin d'études a été réalisé au sein de l'unité Hydrosystèmes et Bioprocédés du Cemagref à Antony. Je tiens à remercier Cécile Loumagne, Sophie Morin et Valérie Dansin de m'avoir accueilli au département. Merci de m'avoir permis de vivre ces trois années de thèse qui ont été très enrichissantes tant sur le plan professionnel que personnel.

Le premier objectif est d'adapter le test comet-hOGG1 au polymorphe de Dreissena et d'étudier si le BaP et le Cd provoquent des lésions oxydatives lorsque les dreissena sont exposés en laboratoire. Cette partie comprend le chapitre II qui couvre le développement in vitro et in vivo de la détection des dommages oxydatifs de l'ADN par le test comet-hOGG1.

Contamination chimique du bassin de la Seine et présentation des sites d'étude

• Localisation et présentation du bassin de la Seine
• Contamination de la Seine
• Micro-contaminants présents dans la colonne d'eau

Le bassin de la Seine (Figure 1) est arrosé par la Seine et ses affluents (principalement Marne, Yonne, Oise). L’industrialisation et l’urbanisation croissantes au cours des deux derniers siècles ont marqué le cœur du bassin de la Seine (Mouchel et al., 1998). C’est cette fraction labile qui présente un intérêt pour étudier l’impact de la pollution chimique des eaux sur les organismes.

2007) a réalisé l'étude de la pollution de la Seine par mesure des métaux totaux, dissous et labiles (Figure 5). Concentrations en métaux totaux dissous obtenus après filtration (barres oranges) et en métaux labiles obtenus par DGT (barres rouges), mesurées sur plusieurs semaines sur 6 sites du bassin de la Seine.

Utilisation des biomarqueurs pour l'évaluation de la qualité biologique du milieu

• Définition et description des biomarqueurs
• Utilisation d’espèces sentinelles en biomonitoring

Parmi ces dernières, l'induction de la synthèse de métallothionéines, protéines soufrées de faible poids moléculaire capables de fixer des ions métalliques, est typique de la pollution métallique (Hamer 1986). Les biomarqueurs d'effet diagnostiquent un excès, parfois transitoire, des capacités de régulation de l'organisme entraînant des conséquences sur la pérennité (cellule, tissu, individu). Parmi les biomarqueurs de l'effet, on retrouve des dommages à l'ADN résultant de l'effet génotoxique de certains polluants, de la réduction de la stabilité membranaire ou de l'induction ou de l'inhibition d'enzymes antioxydantes.

La taille de la population devrait être suffisante pour empêcher que les prélèvements réguliers n’affectent la structure et la densité de la population. Pour étudier les effets chroniques de la pollution chimique de l’environnement, la durée de vie de ces organismes devrait être assez longue, de l’ordre de plusieurs années.

Sources, effets et outils de détection des altérations du matériel génétique

• Sources de génotoxiques
• Dommages de l'ADN

Le Cd est également capable d'induire l'oxydation de l'ADN en induisant la production d'espèces radicalaires. Ces défauts sont dus à l'absence de kinétochores, de centrosomes, de tubuline ou de lame. Les adduits volumineux à l'ADN résultent de la liaison covalente d'un métabolite à un nucléotide (Pfohl-Leszkowicz A. 1994 ; Guengerich 2001 ; Wogan et al., 2004 ; Jeffrey et Williams 2005).

Le site carbone 8 de la guanine est le plus facilement oxydable (Steenken et Jovanovic 1997) et correspond donc à la première cible de modification oxydative (Cadet et al., 2002), conduisant à la formation de la lésion 8-oxo-7. 8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodG) (Figure 10). Cette disposition, qui imite la thymine, provoque l'insertion de l'adénosine à la place de la cytosine dans le brin complémentaire (Figure 11).

Biomarqueurs de génotoxicité adaptés aux organismes aquatiques

• Le test comète
• Détection des adduits encombrants par la méthode du post-marquage au phosphore
• Test micronoyaux
• Voies de réparations des lésions de l'ADN

Ce test est moins coûteux que d'autres méthodes telles que les aberrations chromosomiques et l'échange de chromatides sœurs (Dhawan et al., 2009). Plus tard, il a été démontré que l'enzyme analogue de la Fpg humaine, la 8-hydroxyguanine ADN glycosylase humaine (hOGG1), était spécifique pour la détection du 8-oxodG (Smith et al., 2006). Enfin, la persistance des adduits et leur stabilité dans le temps (plusieurs mois chez le poisson) constituent un avantage pour leur utilisation comme biomarqueur (Sikka et al. 1990).

De plus, on retrouve une bonne relation entre la teneur en HAP et le taux d'adduits chez les espèces sessiles (Collier et al., 1993). En plus de ces anomalies, ce test permet la détection de cellules apoptotiques (Izquierdo et al., 2003).

La moule zébrée, un organisme utilisé en biomonitoring

• Présentation de Dreissena polymorpha
• Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène

Cette capacité à s'attacher et à se regrouper en grappes fait du dreissen un organisme relativement nuisible. La coquille du dreissen a une forme triangulaire caractéristique avec une surface ventrale aplatie et une surface postérieure convexe (Figure 23). La musculature dreissen est composée d'un gros muscle adducteur situé en postéro-dorsal.

La période de reproduction du dreissene s'étend de juin à octobre, selon la température de l'eau. Le cycle de vie des Dreissene (Ackerman et al., 1994) commence par la fécondation externe des gamètes, qui sont libérés dans la colonne d'eau (Figure 24). Les moules zébrées accumulent donc les polluants directement à partir de la colonne d’eau et des particules.

Le Goff et coll. 2006) ont démontré la capacité des dreisses à métaboliser le BaP en détectant les adduits à l'ADN. Pour optimiser l'utilisation de cette espèce comme bioindicateur, plusieurs outils ont été utilisés pour évaluer la réponse génotoxique des organismes à la pollution environnementale. Une proportion de cassures de brins, mesurée par le test des comètes, est le résultat de coupures résultant de la réparation des dommages à l'ADN.

Une autre étude (Fisher et al., 1999) a révélé que la toxicité environnementale augmentait avec l'augmentation de la température de l'eau. L'activation de la période de reproduction semble augmenter la sensibilité des organismes aux polluants (Blaise et al., 2002). Dans le chapitre III, nous avons recherché la présence de lésions oxydatives sur des moules exposées à des composés modèles de pollution urbaine (BaP et Cd) pendant 24 heures, puis nous avons mesuré la stabilité de ces lésions dans le temps en plaçant les moules dans un milieu propre. environnement pendant six jours (phase de dépuration).

Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to models

These lesions detected by the comet assay were not a result of the direct effect of the Cd on DNA (Valverde et al., 2001). 34;Assessment of the genotoxic potential of benzo(a)pyrene and pp'-dichlorodiphenyldichloroethylene in Zebra mussel (Dreissena polymorpha)." Mutation research/genetic toxicology and environmental mutagenesis. 34;The Comet assay for evaluation of genotoxic impact in the aquatic environment." Mutation research/reviews in mutation research.

Soft tissue growth led to a decrease in PAH concentration in soft tissue (Bourgeault et al., 2010). 34;The Comet test for the evaluation of the genotoxic impact in aquatic environments. "Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 34; DNA damage in eelpout (Zoarces viviparus) from Gothenburg harbour." Mutational research/fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis.

34;Report of the In Vitro Micronucleus Assay Working Group." Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 34;Detection of DNA Damage in Zebra Mussel Hemocytes Using the Comet Assay." Mutation research - genetic toxicology and environmental mutagenesis. Therefore, in this study we wanted to search for specific oxidative lesions with the comet hOGG1 assay (Michel et al., submitted).

34;Application of comet and micronucleus assays to butterfish (Pholis gunnellus) erythrocytes from the Firth of Forth, Scotland.". 34;Advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method." Mutation research - genetic toxicology and environmental mutagenesis. Möller "Variation in measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial."

Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ

Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel

34;Mollus-shellfish biomarker study of the Quebec, Canada, Saguenay Fjord with the soft-shelled clam, Mya arenaria.". 34;Persistent toxicant inputs to the River Seine Basin (France) via atmospheric deposition and urban sludge application." Science of the total environment. 34;Genotoxicity biomarkers in Mytilus galloprovincialis: wild versus caged mussels.” Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.

34;Application of the cometè and micronucleus assays to butterfish (Pholis gunnellus) erythrocytes from the Firth of Forth, Scotland." Chemosphere. 34;Effects of temperature on baseline and genotoxicant-induced DNA damage in hemocytes of Dreissena polymorpha.". 34;Effect of temperature on the accumulation kinetics of PAHs and PCBs in the zebra mussel, Dreissena polymorpha." Journal of Great Lakes Research.

34;Use of the alkaline comet test for industrial screening for genotoxicity: comparative study with the micronucleus test." Food and chemical toxicology. 34;Biomonitoring of heavy metals in the Western European rivers Rhine and Meuse using the freshwater mussel Dreissena polymorpha." Environmental pollution. 34;The micronucleus test in the zebra mussel, Dreissena polymorpha, to monitor in situ genotoxicity in freshwater environments." Mutation research / Genetic toxicology and environmental mutagenesis.

34;Human-river interface: multiple effects on water and particle chemistry illustrated in the Seine River basin." Hydrobiologia. 34;Monitoring DNA damage in native blue mussels (Mytilus edulis) sampled from coastal areas in Denmark." Mutation research/genetic toxicology and environmental mutagenesis. 34; Early genotoxic effects in gill cells and hemocytes of Dreissena polymorpha exposed to cadmium, B[a]P and a combination of B[a]P and Cd." Mutation research - Genetic toxicology and environmental mutagenesis.

Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel

• Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha
• Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha
• Utilisation des cellules branchiales
• Test comète couplé à hOGG1
• Conclusions
• Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des lésions
• Exposition de Dreissena polymorpha au BaP
• Exposition de Dreissena polymorpha au Cd
• Conclusions
• Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un niveau
• Vérification de l’absence d’impact dû à la transplantation
• Etablissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN
• Variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité
• Conclusions
• Détection des dommages oxydatifs en milieu naturel

We recently observed that Cd and BaP caused an increase of 8-oxodG in zebra mussels (Michel et al. in prep). Bulky DNA adducts have been recognized to play a role in the initial step of chemical carcinogenesis (Van der Oost et al., 1996). In a previous study, mussels were more vulnerable to genotoxic contaminants in the spring (Michel et al., submitted).

Dans une étude, les niveaux d’oxydation de l’ADN ont été mesurés chez des moules zébrées exposées au Cd (10 µg/L) à l’aide du test Fpg-linked comet assay (Vincent-Hubert et al., 2011). En effet, des mesures des taux de cassure de l'ADN (Klobucar et al., 2003), de la fréquence des micronoyaux (Mersch et Beauvais 1997) et des taux d'adduits (Le Goff et al., 2006) ont été développées dans cet organisme. Un niveau d'oxydation de l'ADN correspondant à 38 % a été trouvé dans les hémocytes d'huîtres exposés in vitro à 88 µM de H2O2 (Gielazyn et al., 2003).

Nos résultats confirment que l'exposition des dreissens au Cd induit une augmentation significative et rapide du taux de cassure de l'ADN (Vincent-Hubert et al. 2011) suite à une relation dose-réponse. Ces cassures de l'ADN ne sont pas dues à l'effet direct du Cd sur l'ADN (Valverde et al., 2001). En fait, la liaison du Cd aux groupes thiol de l'enzyme pourrait nuire à son activité de réparation des lésions oxydatives (Bravard et al., 2006).

Une étude sur l'exposition du dreissene au Cd (10 µg/l) a induit une augmentation du nombre de cassures de brins, mais après cinq et onze jours on a observé une réduction significative du nombre de cassures d'ADN (Vincent-Hubert et al.). Cette réduction du nombre de cassures de l'ADN pourrait être due à la détoxification du Cd par les moules (Vincent-Hubert et al., 2011). En revanche, l'étude de Vincent-Hubert et al., 2011, a mis en évidence la présence de sites sensibles à la comète Fpg. test qui indique la présence de lésions oxydatives.

Ainsi, l'inhibition de cette étape finale de ligature peut conduire à une augmentation de l'accumulation de cassures simple brin résultant d'une réparation incomplète des lésions oxydatives (Emmanouil et al., 2007). Cette même observation d'une augmentation du taux de cassures de l'ADN au printemps a été observée par Bodin et al.