Validation de la spécificité des anticorps par Western-Blot

Les anticorps disponibles dans le commerce sont tous certifiés comme étant spécifiques dans leur espèce-cible. Il faut donc s’assurer de la spécificité de ces anticorps dans le muscle bovin par une méthode simple. Pour cela, un Western-Blot de l’anticorps testé contre des échantillons de muscle bovin permet de vérifier si la taille de la protéine reconnue est conforme à la taille théorique attendue chez le bovin. Cette technique permet également de vérifier la spécificité de l’anticorps, c'est-à-dire si l’anticorps ne reconnaît pas d’autres cibles.

Deux techniques de révélation sont disponibles : la chemiluminence, qui a été remplacée par la fluorescence après la mise au point de cette dernière au cours de la thèse.

Les échantillons sont dénaturés par ajout d’un volume égal de solution de lyse (glycérol 20 %, Tris 12,5 mM pH6,8, SDS 4 %, Pyronin Y 10 mg, -mercaptoéthanol 1,42 M). Les échantillons reposent 10 minutes à température ambiante avant d’être incubés à 60°C pendant 10 minutes. Ensuite, les échantillons sont déposés dans un gel SDS-PAGE. Le premier gel de concentration à 4 % (acrylamide 4 %, bisacrylamide 0,08 %, Tris 125 mM pH6,8, SDS 0,1 %,

Matériels et Méthodes

74 TEMED 0,08 %, PAS 0,04 %) sert de support aux puits de dépôt, et à concentrer les protéines au début de la migration. Le second gel de séparation SDS-PAGE à 12 % (acrylamide 12 %, bisacrylamide 0,23 %, Tris 375 mM pH8,8, SDS 0,1 %, TEMED 0,08 %, PAS 0,04 %) sert à séparer les protéines selon un gradient de taille, par un maillage moléculaire.

Après polymérisation des gels, 15 g de chaque échantillon sont déposés dans un puit formé dans le gel de concentration. Puis le gel SDS-PAGE est placé dans une cuve Biorad remplie de tampon d’électrophorèse TG-SDS 1X fourni par Amresco (USA). La cuve est ensuite reliée à un générateur, générant un courant électrique (1000 mA, 300 W) faisant migrer les protéines, d’abord à 80 V pendant 20 minutes afin de concentrer les protéines dans le premier gel, puis 120 V pendant 1 heure et 30 minutes afin de séparer les protéines dans le second gel. Toute cette opération est réalisée à 4°C.

Une fois la séparation électrophorétique achevée, les gels sont placés sur une membrane en PVDF de même dimension qu’eux, cette dernière ayant été lavée au préalable à l’alcool. Puis l’ensemble est monté entre des feuilles de papier Wathmann, et placé dans une cuve de Transfert Biorad, remplie de tampon de transfert TG 1X d’Amersham. La cuve est reliée à un générateur, fournissant un courant électrique (600 V, 210 mA, 300 W) afin de transférer les protéines du gel vers la membrane pendant 1 heure. Cette opération est réalisée à 4°C.

Une fois le transfert réalisé, les membranes sont lavées avec une solution de T-TBS 1X (Tris-HCl 11,3 mM, Tris Base 8,75 mM, NaCl 0,137 mM, Tween20 0,05 %) à température ambiante. Puis, elles sont saturées avec une solution de T-TBS 1X contenant 10 % de lait écrémé, à 37°C pendant 20 minutes, lavées, et congelées à -20°C. Cette étape de congélation est nécessaire afin de conserver les membranes en attendant de réaliser l’étape de révélation par anticorps.

Les membranes décongelées sont lavées avec le tampon T-TBS 1X. Une solution d’hybridation sans ce tampon T-TBS est préparée avec la concentration optimale d’anticorps primaire dirigé contre la protéine d’intérêt. Pour certains anticorps, cette concentration a été déterminée au laboratoire lors d’expérimentations précédant ma thèse. La majeure partie des anticorps utilisés a nécessité une optimisation des conditions d’utilisation. Ces optimisations ont été effectuées dès le début de ma thèse et sont présentées dans la partie Résultats et Discussion. Les membranes sont hybridées avec cette solution, à 37°C pendant 1 heure et 30 minutes, avant d’être révélées, soit par chémiluminescence, soit par fluorescence.

Matériels et Méthodes

75 Pour la révélation par chémiluminescence, après hydridation, les membranes sont lavées au T-TBS 1X, puis incubées dans une solution d’anticorps secondaire (anti-souris, anti-lapin, anti-chèvre, selon l’anticorps primaire) pendant 1 heure à température ambiante. Cet anticorps secondaire, couplé à une enzyme peroxidase à son extrémité, est dilué au 1 / 20 000^ème. Les membranes sont ensuite lavées avec le T-TBS 1X, séchées, et mises en présence pendant 1 minute d’un mélange réactionnel, composé de luminol et de ferricyanate de potassium, provenant d’un kit ECL fourni par Pierce (ECL Western-Blotting, Référence 32209). Le luminol est alors catalysé par la peroxidase de l’anticorps secondaire, si ce dernier est fixé sur la membrane par réaction avec l’anticorps primaire, pour former un composé émettant des photons, capable d’impressionner un film photosensible (Figure 35A). Les membranes, isolées sous un papier Saran puis dans une cassette Kodak protégeant de la lumière, sont placées sous un film photosensible provenant de chez Kodak. La durée d’impression du film par les photons est de 10 minutes, mais pouvait être adaptée en fonction de la qualité du signal obtenu. Le film est alors révélé par une solution fournie par Kodak, puis fixé par une autre solution également fournie par Kodak. Ce film est scanné pour être ensuite quantifié.

Cette quantification est réalisée avec le logiciel ImageQuant. Les bandes correspondantes à la protéine d’intérêt sont alors repérées et leur signal quantifié. L’intensité du bruit de fond est soustraite à l’intensité du signal. La valeur de l’intensité propre de chacune des bandes est alors obtenue.

Pour la révélation par fluorescence, après hybridation, les membranes sont lavées au T-PBS 1X (NaCl 690 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄ 45 mM, KH₂PO₄ 5 mM, Tween20 0,1 %), puis incubées dans une solution d’anticorps secondaire fournis par LI-COR Biosciences (anti- souris, anti-lapin, anti-chèvre, selon l’anticorps primaire) pendant 30 minutes à 37°C. Cet anticorps secondaire, couplé à un fluorochrome à son extrémité, est dilué au 1 / 20 000^ème. Les membranes sont ensuite lavées avec le T-PBS 1X, puis au PBS (T-PBS 1X sans le Tween20), le tout à l’obscurité. Elles sont ensuite scannées par le scanner à fluorescence Odyssey LICOR à 800 nm. En effet, le fluorochrome fixé à l’anticorps secondaire, lorsqu’il est excité par un laser d’une longueur d’onde de 778 nm, émet un signal fluorescent à une fréquence de 795 nm. Cette excitation est produite par le scanner, qui reçoit ensuite le signal émis par le fluorochrome en réponse (Figure 35B).

La quantification est réalisée avec le logiciel ImageQuant. Les bandes correspondantes à la protéine d’intérêt sont alors repérées et leur signal quantifié. L’intensité du bruit de fond est

LuminolAcide 3-aminophtalique Enzyme peroxidase Émission de photons Impression du film photosensible

Oxydant Anticorps secondaire, fixé à l’anticorps primaire Quantification de l’intensité du signal de la bande d’intérêt par ImageQuant

A.

Révélation par chémiluminescence Réception du signal à 795 nm par le scanner Odyssey Figure 35.Principe des révélations d’anticorps par chémiluminescence et fluorescence

Anticorps secondaire, fixé à l’anticorps primaire

Fluorochrome

Émission d’un signal à 795 nmExcitation à 778 nm Quantification de l’intensité du signal de la bande d’intérêt par ImageQuant

B.

Révélation par fluorescence

Matériels et Méthodes

76 soustraite à l’intensité du signal. La valeur de l’intensité propre de chacune des bandes est alors obtenue.

No documento Marqueurs protéiques de la tendreté de la viande bovine : étude prédictive et fonctionnelle (páginas 146-150)