O registo da temperatura das águas superficiais na colheita permitiu verificar que, para a totalidade das colheitas efectuadas entre 1999 e 2006, as amostras possuíam temperaturas entre os 12 e os 29ºC. A detecção e identificação de R. solanacearum, com a confirmação das características dos isolados obtidos, verificou-se para temperaturas superiores a 13ºC. Agrupando os dados em três classes de temperatura das águas superficiais (<15ºC; ≥15 e ≤20ºC; >20ºC), verifica-se que existe uma associação altamente significativa entre os intervalos das temperaturas das águas superficiais e os resultados dos ensaios laboratoriais (χ2 = 23,310; p=0,0000087). Parece, assim, mais fácil detectar e identificar R. solanacearum
para temperaturas mais amenas (15 a 20ºC).
Entre os meses de Março e Novembro, os valores médios das temperaturas parecem encontrar-se sistematicamente acima dos 13ºC (Figura 2.4), revelando assim a possibilidade
de se obterem resultados positivos para os ensaios laboratoriais.
Utilizando o conjunto de métodos de diagnóstico acima referidos, essa detecção não é possível entre Dezembro e Fevereiro, tornando-se clara a necessidade de intensificar as análises laboratoriais entre os meses de Março e Novembro.
Um estudo efectuado em Espanha por Caruso et al. (2005) confirmou também a existência de uma correlação entre a capacidade de isolar R. solanacearum em meio sólido e a temperatura das águas superficiais, tornando-se impossível o seu isolamento para temperaturas inferiores a 14ºC. Conclusões semelhantes tinham já sido retiradas no Reino Unido (Elphinstone et al., 1998) e Holanda (Janse et al., 1998; Janse & Schans, 1998).
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
Meses do ano T ( ºC ) 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 T média
Figura 2.4 – Representação gráfica da temperatura média das águas superficiais ao longo do ano, e da temperatura média anual para o período de 2000 a 2006.
É notório que a sensibilidade obtida pelos métodos de rastreio E-PCR e E-IIF fica aquém da desejada na análise de águas superficiais (Tabela 2.9).
A utilização de um passo intermédio de enriquecimento dos sedimentos parece não ser suficiente. Estes resultados poderão resultar, em parte, dos baixos níveis populacionais que este organismo frequentemente detém nesta matriz, donde resulta a possibilidade de detecção de um reduzido número de colónias utilizando uma alíquota de 50µL de suspensão no método de diluição em placas (102 a 103 ufc.L-1), mas não nos 5 ou 20 µL utilizados em E-
PCR e E-IIF, respectivamente. Por outro lado, e no que diz respeito a E-IIF, a constituição dos sedimentos, onde se inclui uma enorme variedade de outros organismos (protozoários e bactérias), originam uma fluorescência incaracterística e podem sobrepor-se, nas lâminas, às células de R. solanacearum, explicando, também, o reduzido contributo que este método possui para determinação dos casos positivos (14,6%).
Tabela 2.9 – Fidedignidade dos diferentes métodos de rastreio utilizados na detecção de Ralstonia solanacearum em águas superficiais, utilizando o isolamento em meio gelosado modificado SMSA como ‘gold standard’ (%).
AGL E-PCR E-IIF BIO
Positivos V 30,3 (149)* 18,6 (100) 14,6 (69) 18,2 (107) Positivos F 1,4 (7) 6,1 (33) 2,5 (12) 1,4 (8) Negativos V 67,9 (334) 67,7 (365) 74,9 (353) 70,8 (417) Negativos F 0,4 (2) 7,6 (41) 7,9 (37) 9,7 (57) SENS 98,7 70,9 65,1 65,2 ESP 97,9 91,7 96,7 98,1 VPP 95,5 75,2 85,2 93,0 VPN 99,4 89,9 90,5 88,0
AGL – Aglutinação em lâmina; E-PCR – Reacção em cadeia da polimerase com enriquecimento; E-IIF – Imunofluorescência indirecta após enriquecimento; BIO – Bioensaio; * - Os valores assinalados entre parêntesis referem-se ao número de casos em cada categoria.
Esta reduzida sensibilidade revela igualmente a necessidade imperiosa de prosseguir para a etapa seguinte do diagnóstico, mesmo no caso em que ambos os resultados são negativos, uma vez que os seus valores preditivos, sobretudo os de positividade, são reduzidos.
Solo
No decurso do ciclo cultural, torna-se aparentemente fácil isolar R. solanacearum a partir da rizosfera de plantas hospedeiras apresentando sintomas da doença. No entanto, essa dificuldade aumenta caso a colheita da amostra se faça aleatoriamente em toda a superfície da parcela. Estas observações foram confirmadas através de estudos efectuados em duas parcelas distintas já referidas em 2.3.1.5. Os resultados laboratoriais obtidos pela amostragem de solo de ambas as parcelas, de acordo com a técnica proposta por Pradhanang (1999), revelaram a existência de diferenças significativas relativamente à detecção e identificação de R. solanacearum nas duas parcelas (χ2 = 10,000; p=0,0016). É
de negligenciar a existência de outros factores que pudessem vir a intervir nos resultados laboratoriais, uma vez que as amostragens foram efectuadas em dias consecutivos, e as respectivas sub-amostras processadas paralelamente no laboratório.
Por outro lado, observa-se que, em certos casos, a doença se concentra em manchas e não prolifera por toda a parcela devido a determinados factores, como sejam a orografia do terreno ou o seu pH. Por isso, resultados laboratoriais negativos não se devem, em muitos casos, à ausência de contaminação por R. solanacearum, mas novamente à incapacidade dos meios de diagnóstico para detectar baixas populações deste organismo, associadas a uma flora natural do solo muito rica e a elevados níveis de inibidores.
Os valores de sensibilidade e especificidade observados para E-IIF e E-PCR (Tabela 2.10) não parecem ser particularmente desadequados, contudo, os baixos níveis de resultados positivos resultam do fraco desempenho de SMSA, usado na análise comparativa como método de referência, e que decorre da sua falta de selectividade para a flora presente nesta matriz, a qual compete e inibe o desenvolvimento de R. solanacearum.
Os resultados obtidos para E-PCR resultaram da utilização de extracção de DNA por choque térmico, ou seja, não recorrendo métodos de extracção e purificação de DNA mais sofisticados. Existem numerosos trabalhos onde se recorre a diversos procedimentos, com o objectivo de promover a remoção dos ácidos humicos presentes nesta matriz e principais responsáveis pela inibição do processo de amplificação, os quais não são compatíveis com o processamento rotineiro destas amostras (Tsai & Olson, 1991; Ito et al., 1998). Efectivamente, Miller et al. (2002), num estudo comparativo entre o isolamento e PCR, utilizando “primers” dirigidos para 16S rDNA para detecção e identificação de Burkholderia cepacia a partir do solo, obtiveram resultados muito divergentes, com maior número casos positivos para PCR. Neste estudo foi, contudo, utilizado DNA purificado e os “primers” utilizados pareciam não possuir a especificidade adequada, amplificando o DNA de outras espécies bacterianas.
Tabela 2.10 – Fidedignidade dos métodos de Imunofluorescência após enriquecimento (E-IIF) e PCR após enriquecimento (E-PCR) na detecção de
Ralstonia solanacearum no solo, utilizando o
isolamento em meio gelosado modificado SMSA como ‘gold standard’ (%).
E-IIF E-PCR E-IIF + E-PCR Positivos V 16,4 (12)* 21,9 (16) 19,2 (28) Positivos F 0,0 (0) 2,7 (2) 1,4 (2) Negativos V 83,6 (61) 74,0 (54) 78,8 (115) Negativos F 0,0 (0) 1,4 (1) 0,7 (1) SENS 100,0 94,1 96,6 ESP 100,0 96,4 98,3 VPP 100,0 88,9 93,3 VPN 100,0 98,2 99,1
* - Os valores assinalados entre parêntesis referem-se ao número de casos em cada categoria.
A utilização de novos métodos de diagnóstico visando a detecção das formas cultiváveis e de métodos de detecção directa ou independentes de cultura, para detecção de formas VBNC, permitem agora detectar, de forma mais aproximada, as populações reais e compreender a resposta fisiológica de R. solanacearum ao stress a que se encontra sujeita nos solos de latitudes temperadas (Van Elsas et al., 2000). Entre estes novos meios de diagnóstico
molecular nomeiam-se RT-PCR, capaz de monitorizar a transcrição de mRNA produzido em resposta a um stress, ou a aplicação de cDNA-AFLP para comparação de perfis de mRNA de células sujeitas a diferentes condições de stress (Van Elsas et al., 2005b). Outro método molecular, PCR-DGGE, também já se encontra amplamente divulgado em microbiologia ambiental, para estudo de comunidades microbianas do solo, uma vez que sendo um meio de detecção directa tem em conta uma fracção importante do microbiota do solo não cultivável in vitro (Gelsomino et al., 1999). Embora muito fiáveis, estas estratégias ainda não se encontram em fase de fácil aplicação à rotina laboratorial.