Em virtude dos focos que promoveram a recorrência da doença na década de 90 poderem ter origem em tubérculos de batateira com infecções latentes, e da existência de tolerância zero no que diz respeito a este organismo nocivo, foi posto um grande esforço no trabalho laboratorial, por forma a obter um diagnóstico fidedigno em amostras desta matriz.
No caso da batateira foi sujeito a análise laboratorial um reduzido número de plantas apresentando sintomas de doença, pelo que os resultados obtidos através do diagnóstico incidiram, sobretudo, sobre amostras de tubérculos.
Parece existir uma associação significativa entre a presença de sintomas da doença visíveis e os resultados das análises laboratoriais (χ2 = 1,167; p=0,2799). Existe, contudo, uma clara
diferença entre o número de amostras apresentando sintomas e o resultado final do diagnóstico, correspondendo cerca de 44,5% dos casos positivos a amostras com infecções latentes.
Conforme se mostra na Tabela 2.5, é vasta a panóplia de métodos de rastreio empregues, uma vez que esta fase do diagnóstico é crítica, conduzindo, ou não, à detecção de R. solanacearum, e condicionando o resultado final da análise.
Entre os vários métodos apresentados, poderá fazer-se a distinção entre aqueles que permitem obter um resultado presuntivo no prazo de 24 a 48 horas, como D-IIF e D-PCR ou E-PCR, e outros, como a aglutinação a partir de colónias ou o bioensaio, que permitem uma leitura mais tardia dos resultados.
A aglutinação em lâmina tem vindo a ser aplicada nesta matriz, sobretudo na “identificação” de colónias suspeitas obtidas em meio semi-selectivo após seis dias de incubação. A sua utilização na detecção de R. solanacearum em extractos não tem sido realizada de forma sistemática na análise laboratorial, uma vez que a quase totalidade das amostras de tubérculos não apresentava sintomas visíveis de doença e que, na presença de infecções latentes, o nível da população bacteriana se pode situar abaixo do limiar de detecção deste método.
O bioensaio poderá revelar a presença de sintomas característicos de doença para amostras com elevados níveis populacionais, passados quatro dias da inoculação.
Tabela 2.5 – Fidedignidade de diferentes métodos de diagnóstico na detecção de
Ralstonia solanacearum em tubérculos de batateira utilizando o isolamento em
meio gelosado modificado SMSA como ‘gold standard’ (%).
AGL D-IIF D-PCR E-PCR BIO
Positivos V 1,4 (4)* 1,3 (9) 1,4 (3) 2,0 (14) 1,4 (6) Positivos F 0,0 (0) 4,3 (29) 0,5 (1) 0,6 (4) 0,0 (0) Negativos V 98,6 (292) 94,4 (644) 98,2 (214) 97,4 (671) 98,6 (419) Negativos F 0,0 (0) 0,0 (0) 0,0 (0) 0,1 (1) 0,0 (0) SENS 100,0 100,0 100,0 93,3 100,0 ESP 100,0 95,7 99,5 99,4 100,0 VPP 100,0 23,7 75,0 77,8 100,0 VPN 100,0 100,0 100,0 99,9 100,0
AGL – Aglutinação em lâmina; D-IIF – Imunofluorescência indirecta sem enriquecimento; D-PCR – Reacção em cadeia da polimerase sem enriquecimento; E-PCR – Reacção em cadeia da polimerase com enriquecimento; BIO – Bioensaio; * - Os valores assinalados entre parêntesis referem-se ao número de casos em cada categoria.
Os métodos D-IIF, D-PCR e E-PCR possuem elevados níveis de sensibilidade e especificidade, parecendo não haver qualquer vantagem, neste caso, em proceder ao enriquecimento do extracto em meio líquido durante 48 horas. Possuem igualmente elevados valores preditivos para amostras negativas. Inversamente, os valores preditivos mais baixos para as amostras positivas poderão, em parte, resultar do baixo número de casos positivos nas amostras estudadas, conduzindo a algum enviesamento na análise do seu potencial de detecção neste tipo de amostras.
O limiar de detecção conseguido sem recorrer a processos de purificação de DNA, ou seja, promovendo apenas a libertação de DNA por utilização de choque térmico, e utilizando os “primers” desenhados por Opina et al. (1997), foi de 103 ufc.mL-1. Para níveis populacionais
inferiores, a obtenção de resultados positivos só se mostrou possível utilizando métodos de extracção e purificação de DNA mais sofisticados (Sousa Santos et al., 1999).
No que diz respeito a D-IIF é também elevado o número de amostras consideradas suspeitas (14,03%), por possuírem células com fluorescência e/ou morfologias características semelhantes às de R. solanacearum, cuja identidade não é confirmada por isolamento e ensaios de patogenicidade.
Resultados positivos para aglutinação em lâmina de colónias suspeitas e bioensaio, permitem concluir que o resultado final da amostra é positivo, embora seja usual proceder a essa confirmação por reisolamento, PCR de lisados de colónias suspeitas e ensaio de patogenicidade, procedimentos que se tornam dispensáveis. Esta conclusão poderá ser discutível na medida em que não implica o cumprimento dos Postulados de Koch.
Tomateiro
A utilização de diversas técnicas laboratoriais, baseadas em princípios biológicos distintos, permitiu a detecção e identificação quase sistemática de R. solanacearum em plantas com sintomas característicos da doença. Verifica-se que existem diferenças significativas entre a presença de sintomas visíveis da doença e a identificação de R. solanacearum nas amostras em estudo (χ2 = 8,697; p=0,0032), uma vez que sintomas característicos da doença, como
murchidão e necrose dos feixes vasculares poderão ser atribuíveis a outras causas, incluindo outras bactérias ou fungos fitopatogénicos (23,88% dos casos em que se procedeu ao registo dos sintomas). Assim, a correlação entre a presença destes sintomas e a identificação de R. solanacearum não é absoluta.
Foi igualmente possível identificar este organismo a partir de plantas com infecções latentes, obtendo-se resultados positivos nos ensaios de rastreio de aglutinação em lâmina e de isolamento.
Sthephani et al. (2005) utilizando em condições experimentais os métodos propostos pelos trabalhos do projecto SMT e agora descrito na Directiva 2006/63/CE, conseguiram detectar e identificar R. solanacearum numa amostra em que procederam à adição de um segmento de caule infectado a 999 potencialmente sãos, revelando também, deste modo, a elevada sensibilidade dos métodos de diagnóstico disponíveis para esta matriz.
No que diz respeito ao tomateiro, E-PCR parece não possuir grandes vantagens relativamente a D-PCR uma vez que a sua utilização implica maiores recursos e que os seus resultados são obtidos passadas 48 horas, altura em que já é possível visualizar colónias típicas de R. solanacearum em SPA e proceder à confirmação da sua identidade por aglutinação em lâmina. Deste modo, a sua utilização foi abandonada nesta matriz.
A D-PCR possui elevados padrões de fiabilidade (Tabela 2.6) e a obtenção de falsos negativos pode facilmente ser ultrapassada pela utilização de polivinilpolipirrolidona, que complexa parte importante dos inibidores da amplificação presentes nos extractos obtidos a
partir de tomateiro, ou pela realização de diluições decimais a partir dos extractos iniciais, em se tratando de material sintomático (Cruz, 1996).
O ensaio de aglutinação em lâmina, realizado a partir dos macerados iniciais possui, comparativamente aos outros métodos apresentados, valores muito semelhantes de avaliação dos parâmetros de qualidade (Tabela 2.6). Por outro lado, possui valores de sensibilidade superiores a D-PCR, parecendo não ser afectado por resultados negativos falsos. D-IIF possui um desempenho inferior. Assim, sendo menos oneroso, moroso e menos exigente em termos de qualificação dos operadores, a escolha recairá sobre o ensaio serológico de aglutinação em lâmina.
O bioensaio possui uma fidedignidade absoluta, pelo que parece poder substituir o ensaio de patogenicidade na determinação da virulência de R. solanacearum como agente causal da doença.
Tabela 2.6 – Fidedignidade de diferentes métodos de diagnóstico na detecção de
Ralstonia solanacearum em tomateiro utilizando o isolamento em meio
gelosado modificado SMSA como ‘gold standard’ (%).
AGL D-IIF D-PCR BIO
Positivos V 29,3 (27)* 44,7 (17) 32,0 (24) 36,0 (27) Positivos F 1,1 (1) 2,6 (1) 0,0 (0) 0,0 (0) Negativos V 69,6 (64) 50,0 (19) 66,7 (50) 64,0 (48) Negativos F 0,0 (0) 2,6 (1) 1,3 (1) 0,0 (0) SENS 100,0 94,4 96,0 100,0 ESP 98,5 95,0 100,0 100,0 VPP 96,4 94,4 100,0 100,0 VPN 100,0 95,0 98,0 100,0
AGL – Aglutinação em lâmina; D-IIF – Imunofluorescência indirecta sem enriquecimento; D- PCR – Reacção em cadeia da polimerase sem enriquecimento; BIO – Bioensaio; * - Os valores assinalados entre parêntesis referem-se ao número de casos em cada categoria.