4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3. Análise dos dados de HDX da SHsp90
A análise de troca de hidrogênio-deutério foi proposta para obter informações sobre a flexibilidade e dinâmica da proteína SHsp90. As informações de flexibilidade dos peptídeos foram obtidas através da taxa de incorporação de deutério da cadeia principal, isto é, os átomos de hidrogênio da cadeia principal que estão envolvidos em ligações de hidrogênio e/ou em regiões pouco acessíveis ao solvente apresentam taxas de incorporação de deutério menores quando comparados com os átomos de hidrogênio que estão acessíveis ao solvente e/ou em regiões flexíveis.103,105
Antes de realizar os ensaios de cinética de HDX foram realizados ensaios com diferentes concentrações de proteína para otimização da cobertura da sequência de resíduos de aminoácidos para a proteína SHsp90. A otimização dos ensaios resultou em um mapa de cobertura péptico de 77 % da sequência da proteína (Figura 36). Para efeito comparativo da taxa de incorporação de deutério com a estrutura proposta para a proteína foi adicionado informações sobre a
58 estrutura secundária da proteína no mapa de cobertura. As informações da estrutura secundária da proteína foram baseadas no modelo gerado pelo Modeller, pois o modelo gerado pelo Mholline apresenta bastante semelhança nas estruturas secundárias de sua estrutura.
Figura 36. Mapa de cobertura da sequência de resíduos de aminoácidos da SHsp90 obtidas pela otimização do ensaio de HDX. As faixas em azul representam os peptídeos gerados na digestão péptica, analisados por LC-MSE e identificados pelo DynamX,
59 demonstrando 77 % de cobertura. A estrutura secundária é referente ao modelo da SHsp90 gerado pelo Modeller.
Para determinação da porcentagem de incorporação de deutério, foi utilizado um software para o processamento das amostras (DynamX), onde para cada peptídeo é determinado a massa média (em verde, Figura 37) a partir do padrão isotópico do peptídeo e, então, através da massa média dos peptídeos deuterados e do peptídeo no controle, é calculada a taxa de incorporação relativa de deutério utilizando a Equação 03. 105
𝑇𝑎𝑥𝑎 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑢𝑡𝑒𝑟𝑎çã𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = 𝑚 − 𝑚0% Eq. 03
Onde, m é a massa média do peptídeo deuterado e m0% a massa média do peptídeo sem incorporação de deutério.
A porcentagem de incorporação de deutério é obtida comparando a taxa de incorporação relativa de deutério com o máximo de deutério que pode ser incorporado pela cadeia peptídica através da Equação 04. 105
% 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑢𝑡𝑒𝑟𝑎çã𝑜 = 𝑚 − 𝑚0%
𝑚100%− 𝑚0% Eq. 04
Onde, m é a massa média do peptídeo deuterado, m0% a massa média do peptídeo sem incorporação de deutério, e m100% a massa teórica do peptídeo com o máximo de incorporação de deutério na cadeia principal.
60 Figura 37. Representação do padrão isotópico dos peptídeos na análise de HDX para calcular a taxa de incorporação de deutério. (A) Demonstração da massa média (em verde) e largura do padrão isotópico (em laranja) dos peptídeos. (B) Curva de incorporação de deutério para o peptídeo MRKPEEITKEEY. Esta curva apresenta no eixo y o número máximo de átomos de deutério que podem ser incorporados para este peptídeo, isto é, 10 átomos de deutério podem ser incorporados pelo peptídeo MRKPEEITKEEY.
Após a análise utilizando o DynamX foram obtidos peptídeos com diferentes taxas de incorporação de deutério, conforme pode ser observado na Figura 38. Através destas informações de taxa de incorporação relativa, foram calculadas as porcentagens de deuteração para cada peptídeo da proteína SHsp90. Estas informações, então, foram correlacionadas com a estrutura da SHsp90. Os gráficos de taxa de incorporação de deutério para os peptídeos da proteína SHsp90 obtidas através do DynamX podem ser observadas no ANEXO I.
61 Figura 38. Exemplos de curvas de cinética da taxa de incorporação de deutério obtida pelo processamento utilizando o Dynamx após a análise de HDX acoplado a LC-MSE para
proteína SHsp90.
Para correlacionar as informações dos ensaios de HDX com a estrutura da SHsp90 foi necessário propor um modelo dimérico para esta proteína, já que este ensaio foi realizado com a proteína dimérica. O modelo dimérico foi modelado, inicialmente, a partir da estrutura cristalográfica da Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9) obtendo uma estrutura de conformação fechada conforme apresentado na Figura 39.
62 Figura 39. Representação da estrutura dimérica da SHsp90 obtida através da modelagem do monômero gerado pelo Modeller utilizando como estrutura molde a estrutura cristalográfica da Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9).
Analisando os resultados obtidos através da taxa de incorporação de deutério para os diferentes peptídeos, observou-se que as regiões que apresentavam maiores taxas de incorporação de deutério no tempo de 10 segundos, não estavam completamente expostas ao solvente na estrutura proposta (Figura 40). Com isso, foi necessário propor um modelo que corroborasse com estes dados experimentais.
63 Figura 40. Representação da estrutura dimérica da SHsp90. (A) Um monômero está representado na forma de cartoon e a outro na forma de superfície. (B) monômeros representados na forma de superfície. Os peptídeos que apresentaram altas taxas de troca de hidrogênio-deutério estão destacados em vermelho, onde observa-se em algumas regiões a sobreposição pelo outro monômero, o que torna estas regiões pouco acessíveis ao solvente.
O modelo dimérico proposto, além de não corroborar com os dados experimentais de HDX, não concordou com os dados experimentais de análise
A
64 hidrodinâmica, coeficiente de difusão e raio hidrodinâmico (Tabela 2) obtidos experimentalmente com colaboração com Prof. Dr. Carlos Ramos. Para comparar esses dados experimentais com os modelos gerados foi utilizado o programa Hydropro128 para calcular os valores teóricos do coeficiente de difusão dos modelos tridimensionais. Esse programa calcula o coeficiente de difusão das estruturas modeladas através das coordenadas do arquivo .pdb e utilizando o coeficiente de difusão obtido através do programa calcula-se o raio hidrodinâmico através da Equação 05.127
𝐷 = 𝑘𝐵𝑇 6𝜋𝑛𝑅𝐻
Eq. 05
Onde, T é temperatura (ºC), kB é constante de Boltzmann, RH é o raio hidrodinâmico.
Tabela 2. Valores dos coeficientes de difusão e raios hidrodinâmicos experimentais e das estruturas diméricas da SHsp90 propostas a partir de modelagem baseada na estrutura molde da proteína Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9).
Coeficiente de difusão (D) - (cm2.s-1) Raio hidrodinâmico (RH) -
(Å)
Experimental 3,2x10-7 66,0
Modeller 4,16x10-7 50,8
Mholline 4,02x10-7 52,6
Conforme demonstrado na Figura 40 e na Tabela 2, os resultados experimentais não corroboraram com a estrutura dimérica proposta para SHsp90, portanto, foi realizado um estudo de interação proteína-proteína através de docking rígido do domínio C-terminal da SHsp90 gerado pelo programa Modeller. O docking foi realizado somente para estrutura gerada pelo Modeller devido à grande semelhança nas estruturas do domínio C-terminal para os modelos gerados pelo Modeller e Mholline.
65 Para um dos estudos de docking proteína-proteína utilizando o programa Zdock, os resíduos de aminoácidos que estão presentes na região de interação do domínio C-terminal do modelo dimérico foram utilizados para favorecer interações no docking entre estes domínios. Isto é, os resíduos de aminoácidos representados em azul (Figura 41) foram estabelecidos como resíduos de aminoácidos que pertencem ao sítio de interação e os resíduos de aminoácidos representados em verde foram restritos de interação. Para os outros estudos utilizando os programas Rosie e Zdock, o docking foi realizado sem restrição ou favorecimento de interações entre os resíduos de aminoácidos.
Figura 41. Representação da dimerização dos domínios C-terminal da SHsp90, a partir da estrutura gerada pelo Modeller, sendo representados em diferentes tons de azul os resíduos de aminoácidos que participam efetivamente da interação.
Através dos modelos de dimerização do domínio C-terminal da SHsp90 gerados por docking foi possível obter modelos tridimensionais da proteína SHsp90 utilizando os monômeros gerados por modelagem por homologia do Modeller e Mholline. Alguns modelos gerados apresentaram sobreposição de resíduos de aminoácidos entre os monômeros, portanto, foram descartados. A partir dos modelos que não apresentaram sobreposição de resíduos de aminoácidos foram calculados os coeficientes de difusão e raio hidrodinâmicos e, posteriormente, comparados com os valores experimentais (Tabela 3). Os números dos dímeros, apresentados nesta tabela, são referentes ao número da estrutura gerada, isto é, os programas geraram 10 modelos diméricos com menor
66 energia, sendo o modelo número 1, o modelo de interação proteína-proteína com menor energia calculado pelo programa.
Tabela 3. Valores dos coeficientes de difusão e raios hidrodinâmicos para as estruturas diméricas da SHsp90 obtidas através do docking rígido do domínio C-terminal utilizando os programas Zdock e Rosie.
Coeficiente de difusão (D) - (cm2.s-1) Raio hidrodinâmico (RH) - (Å) Coeficiente de difusão (D) - (cm2.s-1) Raio hidrodinâmico (RH) - (Å) Experimental 3,2x10-7 66,0 - - Modeller Mholline
Docking sem restrição - Zdock
Dímero 3 3,79x10-7 55,8 3,86x10-7 54,8
Dímero 4 3,62x10-7 58,4 3,73x10-7 56,7
Dímero 8 3,67x10-7 57,6 3,7x10-7 57,1
Dímero 9 3,79x10-7 55,8 3,82x10-7 55,3
Dímero 10 3,9x10-7 54,2 3,86x10-7 54,8
Docking com restrição - Zdock
Dímero 2 4,13x10-7 51,2 3,96x10-7 53,4 Dímero 3 3,63x10-7 58,2 3,68x10-7 57,4 Dímero 4 4,15x10-7 50,9 - - Dímero 6 4,14x10-7 51,0 3,98x10-7 53,1 Dímero 7 3,56x10-7 59,4 3,61x10-7 58,5 Dímero 10 3,54x10-7 59,7 3,61x10-7 58,5
Docking sem restrição - Rosie
Dímero 1 4,17x10-7 50,7 3,98x10-7 53,1 Dímero 4 3,55x10-7 59,5 3,63x10-7 58,2 Dímero 5 3,55x10-7 59,5 3,59x10-7 58,9 Dímero 6 3,72x10-7 56,8 3,69x10-7 57,3 Dímero 8 3,60x10-7 58,7 3,58x10-7 59,0 Dímero 9 3,54x10-7 59,7 3,98x10-7 53,1
67 Analisando a Tabela 3, observa-se que as estruturas que mais se aproximaram do valor experimental foram: o dímero 10, referente ao docking com restrição do Zdock, e o dímero 9, referente ao docking do Rosie, ambos os modelos gerados a partir do monômero obtido por modelagem por homologia pelo programa Modeller. Analisando estas estruturas geradas, observa-se que os modelos obtidos apresentam uma conformação ligeiramente aberta quando comparadas com a estrutura dimérica inicial (Figura 42).
Os valores teóricos obtidos pelos modelos gerados pelo docking apresentaram uma pequena diferença quando comparados com os valores experimentais, estas pequenas diferenças obtidas podem ser explicadas por características das proteínas em solução, isso é, espessura da camada de solvatação dos polipeptídios em solução 133, e/ou também, pela interconversão entre os estados “aberto” e “fechado” da proteína.27
A estrutura dimérica proposta após os resultados de docking corrobora com as regiões que apresentaram as maiores taxas de incorporação de deutério no tempo de 10 segundos que indica regiões flexíveis e bastante acessíveis ao solvente, pois esta estrutura se apresenta em uma conformação aberta (Figura 42).
Figura 42. Representação da estrutura dimérica da SHsp90 obtida através do docking demonstrando uma estrutura com uma conformação ligeiramente aberta quando comparada com a estrutura proposta inicialmente (Figura 40). Os peptídeos que apresentaram altas taxas de troca de hidrogênio-deutério estão destacadas em vermelho,
68 onde não observa-se sobreposição de resíduos de aminoácidos que apresentaram altas taxas de incorporação de deutério.
Além desta estrutura dimérica proposta a partir dos dados de docking concordar com os dados experimentais de HDX e análise hidrodinâmica, outro dado experimental que corrobora com esta estrutura proposta foi obtido através de fluorescência de emissão dos resíduos de triptofano em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Carlos Ramos. Esse experimento foi realizado com a SHsp90 enovelada e desenovelada (adição de cloreto de guanidina (Gdm-Cl) na solução), para obter informações do ambiente dos resíduos de triptofano. Para este experimento, a excitação dos resíduos de triptofanos foi realizada em 295 nm e a emissão foi de 305 a 420 nm.127
Analisando o espectro de emissão obtido (Figura 43), verifica-se que a estrutura nativa apresenta um comprimento de onda máximo de emissão de 335 nm e um centro de massa em 344 nm, e a estrutura desenovelada apresenta um comprimento de onda máximo de emissão em 353 nm e um centro de massa de 357 nm. Uma vez que o espectro de emissão representa a soma da fluorescência emitida pelos resíduos de triptofano, conclui-se que pelo menos parte dos resíduos de triptofano estão enterrados nas regiões internas da proteína, e isso pode ser pode ser observado na Figura 44. 127
Figura 43. Espectro de emissão de fluorescência para analisar o ambiente dos resíduos de triptofano. Os espectros foram obtidos com a SHsp90 na ausência (pontos quadrados)
69 e na presença de cloreto de guanidina (círculos abertos). A excitação dos resíduos de triptofano na análise ocorreu em 295nm e a emissão de 305 a 420 nm. 127
Além de destacar os resíduos de triptofano, em azul (Figura 44), foram destacados os resíduos de lisina (em vermelho, Figura 44) que sofreram algum tipo de modificação pelo ALC para verificar se esses resíduos apresentavam-se em regiões acessíveis ao solvente na estrutura dimérica proposta, já que estes resíduos de aminoácidos necessitam estar acessíveis ao solvente para sofrer reação com o ALC. Observando esta figura, verifica-se que os resíduos que sofreram modificação pelo ALC estão acessíveis ao solvente. Portanto, estes resultados de modificação por ALC também corroboram o modelo dimérico proposto.127
Figura 44. Representação estrutural da proteína SHsp90 na forma de dímero. Os resíduos de lisinas, que sofreram algum tipo de modificação pelo ALC, estão representados em vermelho e os resíduos de triptofano estão representados em azul.
Este modelo dimérico da SHsp90 proposto foi utilizado para comparar os dados teóricos de acessibilidade ao solvente desta estrutura, calculado utilizando
70 o PyMOL, com os dados experimentais de HDX. Para isso, foi calculada a porcentagem de área acessível ao solvente para cada peptídeo observado na análise de HDX. Estas porcentagens de área acessíveis ao solvente foram comparadas com as porcentagens de incorporação de deutério (Figura 45), sendo os peptídeos numerados em ordem crescente conforme a sequência da proteína (os gráficos de taxa de incorporação de deutério para os peptídeos gerados na análise de HDX estão apresentados no ANEXO I).
Figura 45. Gráfico da porcentagem de área acessível ao solvente (calculada utilizando o PyMOL) ou porcentagem de incorporação de deutério versus peptídeos gerados pela
análise de HDX. Os gráficos de taxa de incorporação de deutério para os peptídeos numerados estão apresentados no ANEXO I.
Analisando o gráfico (Figura 45) observa-se que a maioria das regiões acessíveis ao solvente apresentam também altos valores de incorporação de deutério. As regiões que apresentam altos valores de incorporação de deutério desde o tempo de 10 segundos são consideradas regiões bastante dinâmicas e flexíveis, devido a comparação da cinética de troca hidrogênio-deutério dos hidrogênios que participam ou não de ligação de hidrogênio.103Ao correlacionar os peptídeos que apresentaram estas características com a estrutura da proteína, observa-se que as regiões que apresentam maior dinâmica se encontram principalmente no domínio intermediário e em regiões de ligação entre os domínios (Figura 46). A alta presença de regiões dinâmicas no domínio do
71 intermediário deve ocorrer pois esse domínio é responsável pela interação com co-chaperonas e outras proteínas.
Figura 46. Representação em azul das regiões dinâmica da proteína SHsp90 obtidas do experimento de HDX através da alta taxa de incorporação de deutério no tempo de 10 segundos.
Além da informação de dinâmica e flexibilidade dos peptídeos, observa-se na Figura 45 algumas regiões com um aumento gradativo da taxa de incorporação de deutério com aumento de tempo de reação, indicando baixa acessibilidade ao solvente e/ou estrutura rígida. Isto pode ser observado, dentre outras regiões, nas alfa-hélices B e M e folha beta C1 (Figura 36 e 47) referentes aos peptídeos 5-12, 81-83 e 35-36 (Figura 45 e Anexo I), respectivamente, que apresentam baixa acessibilidade ao solvente e estrutura secundárias no modelo da SHsp90. Com isso, as informações obtidas experimentalmente com HDX corroboram com a estrutura modelada por homologia para estes domínios. Foram representadas as estruturas dos domínios N-terminal e domínio do intermediário separado da estrutura do C-terminal para facilitar a visualização das estruturas secundárias e as porcentagens de incorporação de deutério para os peptídeos.
72 Figura 47. Representação da porcentagem de incorporação de deutério para o domínio N-terminal e o domínio do intermediário na cinética de incorporação de deutério. As letras B, C1 e M, são referentes as alfa-hélices B e M e folha beta C1 da Figura 36.
No domínio responsável pela dimerização, C-terminal, observa-se uma grande quantidade de peptídeos não identificados na análise de HDX (Figura 48), isso pode ter ocorrido por causa da interação entre os domínios que dificulta a digestão pela enzima pepsina. Entretanto, neste domínio, observa-se algumas regiões bastante flexíveis e dinâmicas. Neste domínio, não se observa regiões com baixa taxa de incorporação de deutério, porém, isso não indica ausência de interação entre os domínios, já que a interação deve ocorrer entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos podendo não acarretar na perturbação da taxa de incorporação de deutério da cadeia principal. 103,105
B B B B B M M M M M C1 C1 C1 C1 C1
73 Figura 48. Representação da taxa de incorporação de deutério para o domínio C-terminal na cinética de incorporação de deutério.
74