Identificação das espécies de ligação cruzada para SHsp90

Inicialmente a sequência da SHsp90 foi analisada (Figura 24). Observou-se que a proteína é rica em resíduos de lisinas (81 resíduos), o que torna a técnica de ligação cruzada acoplada à MS apropriada para obtenção de restrições de distâncias visando à construção de modelos estruturais para a proteína estudada, uma vez que o ALC utilizado neste trabalho (DSS) possui são derivados de grupos ésteres de N-hidróxisuccinimida (NHS) que reagem preferencialmente com grupo amino primário presentes na cadeia lateral de resíduos de lisina e no N-terminal de proteínas.

Figura 24. Sequência dos resíduos de aminoácidos da SHsp90 destacando-se em vermelho os 81 resíduos de lisina presentes na sequência.

A análise da proteína modificada através de LC-MS foi realizada após digerir a proteína em peptídeos, para isso, foi utilizada a tripsina como enzima de digestão. Esta enzima realiza hidrólise específica de ligações peptídicas contendo os resíduos de lisina ou arginina. Apesar desta proteína apresentar hidrólise

MASETETFAF QAEINQLLSL IINTFYSNKE IFLRELISNS SDALDKIRFE SLTDKSKLDA QPELFIHIVP DKANNTLTII DSGIGMTKSD LVNNLGTIAR SGTKEFMEAL AAGADVSMIG QFGVGFYSAY LVAERVVVTT KHNDDEQYVW ESQAGGSFTV TRDTSGEQLG RGTKVTLYLK DDQLEYLEER RLKDLIKKHS EFISYPISLW TEKTTEKEIS DDEDEEDKKD EEGKVEDVDE EKEEKEKKKK KIKEVSHEWQ LVDKQKPIWM RKPEEITKEE YAAFYKSLTN DWEEHLAVKH FSVEGQLEFK AVLFVPKRAP FDLFDTRKKL NNIKLYVRRV FIMDNCEELI PEWLSFVKGI VDSEDLPLNI SRETLQQNKI LKVIRKNLVK KCIELFFEIA ENKEDYNKFY EAFSKNLKLG IHEDSTNRTK IAELLRYHST KSGDELTSLK

DYVTRMKEGQ NDIYYITGES KKAVENSPFL EKLKKKGYEV LYMVDAIDEY AIGQLKEFEG KKLVSATKEG LKLDESEDEK KKKEELKEKF EGLCKVIKEV LGDKVEKVVV SDRVVDSPCC LVTGEYGWTA NMERIMKAQA LRDSSMSGYM SSKKTMEINP ENAIMEELRK RAEADKNDKS VKDLVMLLFE TALLTSGFSL DDPNTFGSPI HRMLKLGLSI DEDEAPEADT DMPPLEDDAG ESKMEEVD

45 específica para ligações peptídicas contendo estes resíduos de aminoácidos, é importante ressaltar que a modificação do resíduo de lisina com o ALC impede a clivagem neste resíduo, uma vez que este resíduo de lisina não é reconhecido pela tripsina por apresentar um tamanho maior na cadeia lateral e pela perda de basicidade do grupo amino da cadeia lateral.

A análise dos espectros de íons fragmentos (ESI-MS/MS) obtidos nas corridas de LC-MS para a SHsp90 modificada com o agente de ligação cruzada (DSS) revelou a formação de espécies de ligação cruzada do tipo intra- moleculares inter-peptídeos, intra-peptídeo e dead-end. Exemplos de espectros de massas de espécies modificadas pelo DSS do tipo inter-peptídeos, intra-peptídeo e dead-end podem ser observados através das Figuras 25, 26 e 27, respectivamente.

Nos espectros de massas da espécie do tipo inter-peptídeos (Figura 25 A e B) é possível observar fragmentações convencionais através das séries -b e -y dos peptídeos que sofreram reação com o ALC, normalmente através da quebra das ligações peptídicas. Para o cálculo dos íons fragmentos após a modificação com o ALC, deve-se somar à massa do íon o valor da modificação causada pelo ALC e pelo peptídeo da outra cadeia. Fragmentações simultâneas entre ambas as cadeias peptídicas também podem ser observadas, como é o caso do fragmento b8αy7β (Figura 25A) que é obtido através da fragmentação do resíduo 8 da cadeia alfa (SKLDAQPELFIHIVPDK), formando um íon b, e do resíduo 7 da cadeia beta (ELISNSSDALDKIR), formando um íon y (Figura 25A).

Para a espécie de modificação do tipo inter-peptídeos é denominada de cadeia alfa o peptídeo maior (peptídeo: SKLDAQPELFIHIVPDK, Figura 25A; peptídeo: SDGELTSLKDYVTR, Figura 25B) quando comparado com o peptídeo da cadeia beta, peptídeo menor (peptídeo: ELISNSSDALDKIR, Figura 25A; peptídeo: TKIAELLR, Figura 25B). Através de peptídeos desta espécie, pode-se obter informações quanto a restrições de distância entre os resíduos de aminoácidos na estrutura terciária, uma vez que a modificação pelo ALC ocorre somente em resíduos de aminoácidos espacialmente próximos; além de informações quanto a acessibilidade ao solvente dos resíduos de aminoácido que

46 sofreram a modificação pelo ALC, uma vez que os grupo amino primário da cadeia lateral destes resíduos de aminoácido tem que estar acessível ao solvente para que sofra reação com o ALC.

Figura 25. Espectros de ESI-MS/MS para espécies do tipo inter-peptídeos da proteína SHsp90. A modificação pelo agente de ligação cruzada está representada por um traço preto entre os resíduos de lisina. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b

B A

47 e -y. Os padrões isotópicos dos íons precursores antes da deconvolução dos espectros foram introduzidos nos espectros.

No espectro de massas da espécie do tipo intra-peptídeo (Figura 26A e B) observa-se uma fragmentação convencional através das séries -b e -y do peptídeo que sofreu modificação pelo ALC. Para o cálculo dos íons fragmentos após a modificação com o ALC, deve-se somar à massa do íon o valor da modificação causada pelo ALC. No entanto, entre os resíduos de lisina modificados pelo ALC a fragmentação convencional não é observada.129 _Através de peptídeos desta espécie, pode-se obter informações da estrutura secundária da proteína,93 _{informações quanto restrição de distância entre os resíduos de} aminoácidos na estrutura terciária, além de informações quanto a acessibilidade ao solvente do resíduo de aminoácido que sofreu a modificação pelo ALC.

As espécies do tipo dead-end são obtidas através da modificação de resíduos de lisina com o ALC na forma hidrolisada. A hidrólise dos ALCs podem ocorrer antes ou depois da reação com a cadeia lateral do resíduo de lisina. Esta espécie de peptídeo modificado pelo ALC fornece informação quanto a acessibilidade ao solvente do resíduo de lisina. Um exemplo de espectro de massas de uma espécie dead-end pode ser observado na Figura 27. Esta espécie, assim como as outras espécies, apresenta uma fragmentação convencional através das séries -b e -y com o rompimento das ligações peptídicas, em que a modificação efetuada pelo ALC reside em apenas um resíduo de aminoácido e pode ser facilmente identificada pelo software MASCOT, tratando-a como se fosse uma modificação pós-traducional.

Com base nos diferentes tipos de espécies formadas pela reação da proteína Shsp90 com o ALC foi possível mapear as interações entre os resíduos de lisina que se apresentam espacialmente próximos na estrutura terciária da proteína em solução e mapear os resíduos de lisina que estão acessíveis ao solvente (Figura 28). Comparando as espécies do tipo inter-peptídeos, intra- peptideo e dead-end observou-se que todos os peptídeos que apresentaram modificações pelo ALC através das espécies do tipo inter- ou intra-peptídeos apresentaram também modificações pelo ALC na forma hidrolisada.

48 Figura 26. Espectro de ESI-MS/MS para espécies do tipo intra-peptídeo da proteína SHsp90. A modificação pelo ALC está representada em preto entre os resíduos de lisina. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. Os padrões isotópicos dos íons precursores antes da deconvolução dos espectros foram introduzidos nos espectros.

A

49 Figura 27. Espectro de ESI-MS/MS para espécie do tipo dead-end da proteína SHsp90. O grupo hidroxila representa o ALC hidrolisado. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. Os padrões isotópicos do íon precursor antes da deconvolução do espectro foi introduzido no espectro.

Analisando o mapa de interações entre os resíduos de lisina modificados pelo agente de ligação cruzada obtidos a partir das espécies do tipo intra- e inter- peptídeos (Figura 28) observa-se um maior número de ligações cruzadas no domínio intermediário (representado em verde), quando comparado com os demais domínios C- e N- terminal da SHsp90. Esse resultado indica maior flexibilidade desta região uma vez que este domínio é responsável pela ligação com substratos e co-chaperonas em espécies homólogas da Hsp90.130

50 Figura 28. Mapeamento das ligações cruzadas dos resíduos de lisina (K) das espécies do tipo inter- e intra-peptídeos (em vermelho) e das espécies do tipo dead-end (sublinhado) obtidas com a análise das corridas de LC-MS da proteína SHsp90. O domínio N-terminal está representado em azul, o domínio intermediário em verde e o domínio C-terminal em laranja.