Aplicação de espectrometria de massas em estudos estruturais de chaperonas moleculares

Texto

(1)TATIANI BRENELLI DE LIMA. APLICAÇÃO DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM ESTUDOS ESTRUTURAIS DE CHAPERONAS MOLECULARES. CAMPINAS 2014. i.

(2) ii.

(3) UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA. TATIANI BRENELLI DE LIMA. APLICAÇÃO DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM ESTUDOS ESTRUTURAIS DE CHAPERONAS MOLECULARES. ORIENTADOR: PROF. DR. FÁBIO CESAR GOZZO. DISSERTAÇÃO. DE. MESTRADO. APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ORGÂNICA.. ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR TATIANI BRENELLI DE LIMA, E ORIENTADA PELO PROF.DR. FÁBIO CESAR GOZZO.. _______________________ Assinatura do Orientador. CAMPINAS 2014 iii.

(4) iv.

(5) vi.

(6) ‘’ Se um dia tudo lhe parecer perdido, lembre-se de que você nasceu sem nada, e que tudo que conseguiu foi através de esforços e os esforços nunca se perdem, somente dignificam as pessoas’’. Charlie Chaplin (1889-1977). vii.

(7) viii.

(8) Dedico esta dissertação aos meus pais Hélio e Sueli e ao meu irmão Thiago, por todo apoio, paciência e carinho.. ix.

(9) x.

(10) Agradecimentos Ao meu orientador, Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo. Por primeiramente ter me aceitado no grupo, pela oportunidade, pelos incentivos, pelo excelente convívio, pela compreensão, pela paciência e pelos ensinamentos que serão levados para a vida. Aos meus pais, Sueli e Hélio, pela compreensão, carinho, paciência, incentivo incondicional, dedicação, amizade, e principalmente por todos os ensinamentos e exemplos que sempre me passaram durante todo o percurso da vida. Ao meu maninho, Thiago, pelo incentivo, carinho, cumplicidade, paciência e por tudo mais. A minha família, Mari, Edmilson, Rose, José Antônio, Cinthia, Rick, Fer, Julio, Sandy, e todos os demais, pelo incentivo, carinho e compreensão, e especialmente ao meu avô Torrinha (in memorian) pelo carinho, generosidade, simplicidade, por acreditar sempre em mim, por me ensinar a sempre seguir em frente por mais difícil que esteja caminhada, e por todos os demais conhecimentos sobre a vida passados durantes todos esses anos. Aos meus colegas do grupo Dalton, pela amizade, ótimo convívio e ensinamentos. Ao Alex, Mari e Hector pela amizade, apoio, paciência, por todas as dicas, ensinamentos e discussões cientificas. Ao Hugo, Luana, Allan, Adriana, Elidiane, Marcel, André, Gisel, Mauro, Gilce, Livia por todos os momentos de aprendizagem, pela amizade, paciência, apoio e ensinamentos. Ao Prof. Dr. Carlos H. I. Ramos, pela oportunidade, colaboração e discussões científicas em reuniões, acompanhadas com Viviane e Ana Olívia, que contribuíram para minha formação. Ao Prof. Tiago Santana Balbuena, pela sua disponibilidade, por ceder seu tempo, laboratório e equipamento. Aos meus amigos, Samara, Joy, Alessandra, Je, Tate, Marião, Dani, Ju, Afonso, Luci, Lia, Dulce, Enrico, Mari, Pati, Lari, Taty, e todos os demais, por toda amizade, apoio e compreensão. Aos professores que participaram da minha formação, por todos os ensinamentos que serão levados para toda vida, em especial ao Augusto e a Elizabeth pelos incentivos e conselhos. Ao Instituto de Química da UNICAMP, pela infraestrutura e por seus vários funcionários que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Aos funcionários das oficinas mecânica e eletrônica, à Rita, Priscila e xi.

(11) Vanessa pelo apoio, convívio e amizade. Aos funcionários da CPG por todo o suporte durante esse período. A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para a elaboração deste trabalho. Aos órgãos de fomento CNPq, Grupo GENOPROT de peptídeos naturais, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Bioanalítica, e principalmente à CAPES, pelo auxílio financeiro. A Deus, que torna tudo possível.. xii.

(12) Súmula Curricular Dados Pessoais Tatiani Brenelli de Lima Data de nascimento: 21/02/1990 Endereço eletrônico: tatianibl@gmail.com Formação Acadêmica 03/2012 – 02/2014 Mestrado em Química Orgânica Agência Financiadora: CAPES Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasil 03/2008 – 12/2011 Bacharelado em Química Tecnológica Pontifícia Universidade Católica de Campinas – Campinas, SP, Brasil Produção Científica Artigos Publicados Silva, V. C. H.; Cagliari, T. C.; Lima, T. B.; Gozzo, F. C.; Ramos, C. H. I. Conformational and functional studies of a cytosolic 90 kDa heat shock protein Hsp90 from sugarcane. Plant Physiology and Biochemistry (Paris) 68, 16-22, 2013 Alvim, H. G. O.; Lima, T. B.; de Oliveira, H. C. B.; Gozzo, F. C.; de Macedo, J. L.; Abdelnur, P. V.; Silva, W. A.; Neto, B. A. D. Ionic Liquid Effect over the Biginelli Reaction under Homogeneous and Heterogeneous Catalysis. ACS Catalysis, 3, 1420-1430, 2013. Alvim, H. G. O.; Lima, T. B.; de Oliveira, A. L.; de Oliveira, H. C. B.; Silva, F. M.; Gozzo, F. C.; Souza, R. Y.; Silva, W. A.; Neto, B. A. D. Facts, Presumptions, and Myths on the Solvent-Free and Catalyst-Free Biginelli Reaction. What is Catalysis for? JOC, 79, 8, 3383-3397, 2014. Artigos aceitos para publicação Tiroli-Cepeda, A. O.; Lima, T. B.; Balbuena, T. S.; Gozzo, F. C.; Ramos, C. H. I. Structural and functional characterization of the chaperone Hsp70 from sugarcane. Insights into conformational changes during cycling from cross-linking/mass spectrometry assays. Journal of Proteomics, 2014, no prelo. Trabalhos Apresentados em Eventos Lima, T. B.; Tiroli-Cepeda, A. O.; Balbuena, T. S.; Ramos, C. H. I.; Gozzo, F. C. Structural modeling of Hsp70 based on chemical cross-linking coupled to mass. xiii.

(13) spectrometry. Painel. Evento: V Congresso da Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas (V BrMass), dezembro de 2013. Lima, T. B.; Tiroli-Cepeda, A. O.; Ramos, C. H. I.; Gozzo, F. C. Structural modeling of Hsp40 based on chemical cross-linking coupled to mass spectrometry results. Apresentação Oral. Evento: III ICAP, julho de 2013. Lima, T. B.; Zanphorlin, L. M.; Ramos, C. H. I.; Gozzo, F. C. Mapping the interaction between Hsp90 C-terminal and TOM: insights from chemical crosslinking and H/D exchange. Apresentação Oral. Evento: BrProt, dezembro de 2012. Lima, T. B.; Silva, V. C. H.; Zanphorlin, L. M.; I.; Gozzo, F. C. Generation of Structural Models of Hsp90 using cross-linking and H/D exchange coupled to mass spectrometry. Painel. Evento: BrProt, dezembro de 2012. Silva, V. C. H.; Lima, T. B.; Cagliari, T. C.; Gozzo, F. C.; Ramos, C. H. I. Structural and Functional Studies of the Heat Shock Protein 90kDa from Sugarcane-Hsp90. Painel. Evento: VI Escola de Modelagem Molecular em Sistemas Biológicos, agosto de 2012. Lima, T. B.; Etchegaray, A. Aplicação de surfactantes iônicos e não iônicos para inibir o crescimento de cianobactérias e extrair compostos intracelulares. Painel. Evento: 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, maio de 2011. Lima, T. B.; Silva-Stenico, M. E.; Alves, M. G; Fiore, M. F.; Tornisielo, V. L. Etchegaray, A. Aplicação de surfactantes na inibição do crescimento e extração de toxinas da cianobactéria Microcystis aeruginosa. Painel. Evento: 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, maio de 2011. Lima, T. B.; Etchegaray, A. Ação inibitória de surfactantes no crescimento da cianobactéria Synechococcus elongatus. Painel. Evento: 33ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, maio de 2010. Outras Produções 08/2010 – 07/2011 Iniciação Científica Síntese e aplicação de biossurfactantes para descontaminação ambiental Agência Financiadora: PIBIC/CNPq Pontifícia Universidade Católica de Campinas – Campinas, SP, Brasil 08/2009 – 07/2010 Iniciação Científica Produção e caracterização de peptídios naturais e quimicamente modificados Pontifícia Universidade Católica de Campinas – Campinas, SP, Brasil xiv.

(14) Resumo Aplicação de Espectrometria de Massas em Estudos Estruturais de Chaperonas Moleculares. A espectrometria de massas (MS) tem sido bastante utilizada em análises de amostras biológicas, tornando-se uma ferramenta indispensável para pesquisas na área de proteômica. A ligação cruzada é um processo de união covalente entre dois átomos espacialmente próximos. A ligação cruzada acoplada a MS permite estudos estruturais de proteínas baseado nas restrições de distâncias determinadas pelas espécies inter- e intramoleculares ligadas entre as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos. Essa técnica vem sendo bastante utilizada na análise de interação entre proteínas, entretanto, um aspecto pouco explorado é a análise estrutural de proteínas. O objetivo desse trabalho foi determinar as estruturas terciárias e quaternárias de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar ou proteínas de choque térmico (do inglês, sugarcane heat shock protein, SHsp) utilizando a técnica de ligação cruzada acoplada com MS e modelagem molecular. As restrições de distâncias obtidas pela ligação cruzada e o gráfico de Ramachandran foram utilizados para validar as estruturas tridimensionais da SHsp70 e SHsp90 obtidas por modelagem por homologia. Informações adicionais de dinâmica e flexibilidade da SHsp90 foram obtidas pela técnica de troca hidrogênio/deutério (HDX). As chaperonas moleculares são proteínas importantes presentes em células para evitar o enovelamento incorreto de outras proteínas e suas agregações. A tolerância ao estresse climático em plantas ainda é um fenômeno pouco compreendido, mas provavelmente as chaperonas moleculares desempenham um papel importante neste mecanismo de controle aos danos desses organismos. Desse modo, caracterizar estruturas de Hsp de cana de açúcar é uma informação essencial para a compreensão do mecanismo de ação destas chaperonas. Os estudos estruturais baseados em ligação cruzada acoplada a MS e modelagem por homologia permitiram propor um modelo estrutural para SHsp90 e SHsp70.. xv.

(15) xvi.

(16) Abstract. Structural studies of molecular chaperones by mass spectrometry. Mass spectrometry (MS) has been extensively used to analyze biological samples and has advanced as an indispensable tool for proteomics research. Cross-linking is the process of chemically joining two spatially close atoms by a covalent bond. Chemical cross-linking coupled to MS allows structural studies of proteins based on distance constraints determined by inter- and intra-molecular cross-link between side chains of amino acids residues. This technique has often been used to analyze protein-protein interaction but is mostly unexplored for structural analysis of proteins. The aim of this work was to investigate tertiary and quaternary structures of sugarcane molecular chaperones or heat shock proteins (SHsp) using chemical cross-linking coupled to MS and homology modeling. The distance constraints obtained by chemical crosslinking and Ramachandran plots were used to validate tridimensional structures of SHsp70 and SHsp90 that were predicted by homology modeling. Additional information about flexibility and dynamics of SHsp90 was obtained using hydrogen/deuterium exchange (HDX) coupled to MS. Molecular chaperones are important proteins present in cells that help prevent incorrect folding of proteins and their aggregation. The stress tolerance in plants is still poorly understood, but heat shock proteins likely play a large role in the plant damage control machinery. Therefore, characterizing Sugarcane Hsp structures is essential towards the mechanism of action of such chaperones. The structural study of molecular chaperones by chemical cross-linking coupled to MS and homology modelling allowed the generation of a structural model for SHsp90 and SHsp70.. xvii.

(17) xviii.

(18) Sumário Lista de Abreviaturas e Acrômios...................................................................... xxi Lista de Tabelas................................................................................................. xxiii Lista de Figuras.................................................................................................. xxv 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................1 1.1. Estrutura de Proteínas ....................................................................................1 1.2. Enovelamento de Proteínas............................................................................6 1.3. Chaperonas Moleculares ..............................................................................10 1.4. Importância de chaperonas moleculares em plantas ....................................12 1.5. Hsp70 ...........................................................................................................13 1.6. Hsp90 ...........................................................................................................15 1.7. Métodos de Determinação Estrutural de Proteínas ......................................17 1.8. Modelagem molecular de proteínas ..............................................................20 1.9. Espectrometria de Massas em Estudos de Proteômica Estrutural ...............22 1.10.. Proteômica estrutural por ligação cruzada acoplada a MS ....................23. 1.11. a MS. Proteômica estrutural por troca de hidrogênio-deutério acoplada ...............................................................................................................28. 2. OBJETIVOS..................................................................................................35 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ............................................................36 3.1. Materiais .......................................................................................................36 3.2. Reação de ligação cruzada, alquilação e digestão enzimática de proteínas .............................................................................................................36 3.3. Análise por LC-MS das amostras de ligação cruzada ..................................38 3.4. Reação de troca hidrogênio-deutério para SHsp90 ......................................40 3.5. Análise por LC-MSE das amostras de HDX ..................................................41 3.6. Predição e validação de modelos estruturais da SHsp90 e SHsp70 ............42 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................44 4.1. Identificação das espécies de ligação cruzada para SHsp90 .......................44 4.2. Validação dos modelos estruturais da SHsp90 ............................................50 4.3. Análise dos dados de HDX da SHsp90 ........................................................57 4.4. Identificação das espécies de ligação cruzada para SHsp70 .......................74 xix.

(19) 4.5. Validação dos modelos estruturais da SHsp70 ............................................79 5. CONCLUSÃO ...............................................................................................82 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................83 7. ANEXO I .......................................................................................................90. xx.

(20) Lista de Abreviaturas e Acrômios ADP. Adenosina Difosfato. AGC. Automatic Gain Control. ALC. Agente de Ligação Cruzada. ATP. Adenosina Trifosfato. CD. Dicroísmo Circular. cDNA. DNA complementar. CID. Dissociação Induzida por Colisão. CopA. ATPase transportadora de cobre. D. Coeficiente de difusão. Da. Dalton (1 Da = 1,661.10-24 g). DDA. Aquisição Dependente de Dados. DMF. N,N-dimetilformamida. DNA. Ácido Desoxirribonucleico. DRX. Difração de Raio–X. DSG. Glutarato de N,N-disuccinimidila. DSS. Suberato de N,N-disuccinimidila. DTT. 1,4-Ditiotreitol. EDTA. Ácido etilenodiamino tetra-acético. EM. Electron Microscopy. ESI. Electrospray Ionization. FIH. Fator Inibidor de HIF-1α. FRET. Transferência de Energia Ressonante por Fluorescência. HDX. Troca Hidrogênio-Deutério. HEPES. Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)1-pipezinil]-etanosulfónico. HIF-1α. Fator Induzido por Hipóxia 1-alfa. Hsp. Heat-shock protein. IAA. Iodoacetamida. IM. Mobilidade Iônica. IPTG. Isopropil-1-β-D-tiogalactopiranósido xxi.

(21) LB. Luriae Bertani. LC-MS. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial LID. Região rica em alfa hélices. MALDI. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization. MS. Espectrometria de massas. MS/MS. Espectrometria de massas sequencial. MSn. Espectros de íons fragmentos do tipo multi-estágio. MWCO. Molecular Weight Cut Off. NBD. Domínio de Ligação Nucleotídica. NEF. Fatores de Troca Nucleotídica. NHS. N-hidróxisuccinimida. PDB. Protein Data Bank. PISCES. Protein Sequence Culling Server. Q-TOF. Analisador de massas do tipo quadrupolo - tempo de vôo. RH. Raio Hidrodinâmico. RMN. Ressonância Magnética Nuclear. SAXS. Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos. SBD. Domínio de Ligação com Substrato. sHsp. Small Heat-shock proteins. SHsp. Sugarcane Heat-shock protein. SPE. Extração em fase sólida. TCEP. Cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina. TOF - TOF. Analisador de massas do tipo tempo de vôo - tempo vôo. TOF. Analisador de massas do tipo tempo de vôo. Tris.HCl. Cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano. UPLC. Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência. xxii.

(22) Lista de Tabelas Tabela 1. Classificação das chaperonas moleculares quanto a massa molecular em kDa dos monômeros desta proteína, o oligômero funcional e função.26 ............................................................................................................. 11 Tabela 2. Valores dos coeficientes de difusão e raios hidrodinâmicos experimentais e das estruturas diméricas da SHsp90 propostas a partir de modelagem baseada na estrutura molde da proteína Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9). ........................................................... 64 Tabela 3. Valores dos coeficientes de difusão e raios hidrodinâmicos para as estruturas diméricas da SHsp90 obtidas através do docking rígido do domínio C-terminal utilizando os programas Zdock e Rosie. ........................................... 66. xxiii.

(23) xxiv.

(24) Lista de Figuras. Figura 1. Representação da ligação peptídica de proteínas, onde observa-se que essa ligação é planar e as ligações N – Cα e Cα – C podem apresentar rotações cujos ângulos são denominados phi (ø) e psi (Ψ), respectivamente. .... 1 Figura 2. Representação dos níveis estruturais de uma proteína. Estrutura primária é definida pela sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína. A estrutura secundária é o arranjo espacial local entre os resíduos de aminoácidos. A estrutura terciária é definida pelo arranjo tridimensional de todos resíduos de aminoácidos. A estrutura quaternária, por sua vez, é definida como o arranjo espacial de subunidades de cadeias polipeptídicas. Estrutura baseada na hemoglobina (PDB 1C7D). ................................................ 2 Figura 3. Arranjo estrutural das estruturas secundárias. (A) Orientação dos átomos da cadeia principal na alfa-hélice. As ligações de hidrogênio são formadas pelos átomos de hidrogênio e o oxigênio da ligação peptídica entre 4 resíduos de aminoácidos (i, i+4) estabilizando esta conformação. (B) Vista de cima do eixo de uma alfa-hélice. As cadeias laterais (R) dos resíduos de aminoácidos estão do lado de fora na estrutura da alfa-hélice. (C) Orientação dos átomos da cadeia principal na estrutura folha beta que consiste em uma estrutura em ziguezague. A ligação de hidrogênio ocorre entre os átomos de hidrogênio e oxigênio da ligação peptídica entre seguimentos adjacentes na cadeia polipeptídica .............................................................................................. 3 Figura 4. Estrutura do complexo formado entre a proteína p53 (demonstrada em azul escuro) e domínio CBP-bromo (demonstrada em cinza) (PDB 1JSP). Aproximação da região de interação entre o sítio de ligação do domínio de ligação CBP e o peptídeo da proteína p53. Os resíduos de interação do domínio CBP estão representados em verde e os resíduos de interação da proteína p53 estão representado em vermelho, amarelo e em azul claro que contém um resíduo de acetil-lisina (AcLys) .......................................................... 4 Figura 5. Alterações da estrutura da HIF-1α na interação com o domínio CBP (PDB 1L8C) (A) e com o fator de inibição da HIF-1α (FIH) (PDB 1H2K) (B). A proteína intrinsecamente desestruturada HIF-1α está demonstrada em vermelho e as regiões que apresentam diferentes estruturas nos dois complexos estão representadas em azul ............................................................. 4 Figura 6. Porcentagem de resíduos de aminoácidos em estruturas tridimensionais de proteínas (A) e em estruturas secundárias de proteínas (alfa-hélice, folha beta ou loop) (B). Esses valores foram obtidos por cálculos através de 1654 estruturas de alta resolução de proteínas depositadas no PDB filtradas pelo servidor PISCES. Os resíduos de aminoácidos estão representados por abreviação de uma letra ......................................................... 5 xxv.

(25) Figura 7. Etapas do enovelamento de proteínas pela teoria do colapso hidrofóbico. Inicialmente ocorre um colapso hidrofóbico, etapa rápida, no qual, tende-se isolar os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em contato com o solvente, seguido de um rearranjo das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos através das interações internas que levam a estrutura nativa da cadeia polipeptídica a partir de uma etapa lenta. Nesta figura, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos estão representados em cinza, enquanto que os resíduos de aminoácidos hidrofílicos em branco.................................................. 7 Figura 8. Representação do funil de potencial de energia de enovelamento e de formação de agregados. A região roxa (esquerda) demonstra o afunilamento da cadeia polipeptídica ocasionada por contatos intramoleculares para o estado nativo da proteína, com menor entropia que a cadeia polipeptídica desenovelada. A região rosa (direita) demonstra as conformações da cadeia polipeptídica se movendo em direção a formação de agregados proteicos (agregado amorfo, oligômero e fibra amilóide) através de contatos intermoleculares. Os funis estão sobrepostos pois a formação de agregados pode ocorrer a partir de intermediários durante o processo de enovelamento, assim como da desestabilização da estrutura nativa. Os agregados proteicos e estruturas parcialmente enoveladas podem ser prevenidas através de chaperonas moleculares .................................................. 8 Figura 9. Representação esquemática da atuação das chaperonas moleculares em células com base na classificação quanto as funções destas proteínas. As holdases (1) podem se ligar a proteínas desenoveladas e transportar para as foldases (2) que auxiliam no re-enovelamento desta proteínas. As desagregases (3) separam agregados proteicos e transportam para as holdases e foldases. As chaperonas também atuam no transporte de proteínas sem estrutura para o proteassomo (4) para degradação. 26 ............... 11 Figura 10. Estrutura cristalográfica da Hsp70 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2QXL), com 26% de similaridade de sequência com a SHsp70. O domínio de ligação nucleotídica (NBD) está representado em verde e o domínio de ligação com substrato (SBD) em amarelo e vermelho, onde está destacada a região rica em alfa-hélices (LID). ................................................... 14 Figura 11. Representação esquemática do ciclo da Hsp70. A Hsp40 interage com a proteína desenovelada e transporta para Hsp70. A atividade do tipo ATPase da Hsp70 é, então, estimulada. Após conversão do ATP por ADP pela Hsp70, a Hsp40 se desliga do complexo e a Hsp70 atua no enovelamento da proteína-substrato. O fator de troca nucleotídica (NEF) se liga à Hsp70 para auxiliar na troca de ADP por ATP, alterando a conformação da Hsp70 que libera a proteína-substrato enovelada e disponibiliza a proteína para um novo ciclo. ............................................................................................ 15 Figura 12. Estrutura cristalográfica da Hsp 90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2GG9), com 60 % similaridade de sequência com Hsp 90 de seres xxvi.

(26) humanos. Domínio N-terminal (azul), domínio intermediário (verde), domínio C-terminal (laranja)............................................................................................. 16 Figura 13. Estrutura cristalográfica da Hsp90 em conformação aberta à esquerda e em conformação fechada após ligação nucleotídica. ...................... 17 Figura 14. Estatísticas do banco de dados do PDB a partir do ano de 1990. (A) Gráfico demonstrando o número de estruturas nativas de proteínas depositadas no PDB anualmente e estruturas nativas totais. (B) Gráfico demonstrando o número de novos enovelamentos depositados no PDB anualmente e tipos de enovelamentos totais. (C) Gráfico demonstrando o número de estruturas depositadas no PDB por diferentes técnicas de obtenção de informações estruturais de proteínas............................................. 19 Figura 15. Estrutura do ALC do tipo homobifuncional derivado de ésteres de N-hidróxisuccinimida (NHS) utilizados em experimentos de ligação cruzada com análise por MS. ........................................................................................... 24 Figura 16. Esquema representativo da metodologia de ligação cruzada acoplada a MS para obter informações estruturais de proteínas. (1) Reação da proteína com ALC. (2) Digestão enzimática formando peptídeos. (3) Análise da mistura de peptídeos por LC-MS/MS. (4) Agrupamento das restrições de distância obtidas experimentalmente e formação do mapa de ligação cruzada. (5) Utilização das restrições de distância para determinação e/ou validação de modelos estruturais compatíveis com a proteína-alvo. ......... 26 Figura 17. Esquema representativo das espécies de ligação cruzada. (A) Espécie do tipo inter-peptídeo; (B) Espécie do tipo intra-peptídeo; (C) Espécie do tipo dead-end. .................................................................................. 27 Figura 18. Tipos de átomos de hidrogênio encontrados em peptídeos. Os diferentes átomos presentes nos resíduos de aminoácidos estão representados em diferentes cores conforme descrito na legenda. Os átomos de hidrogênio das ligações peptídicas da cadeia principal estão representados em amarelo e os demais átomos de hidrogênio representados em verde. Os resíduos de aminoácidos estão representados na forma abreviada com as três letras do código dos aminoácidos. ................................. 29 Figura 19. Troca hidrogênio-deutério para um determinado complexo proteico. Os átomos de hidrogênio lábeis da cadeia principal (representados como bolas azuis) são trocados por átomos de deutério quando colocados em solução de D2O. Os átomos de hidrogênio que não se apresentam em ligações de hidrogênio e estão em regiões acessíveis ao solvente são trocados por átomos de deutério rapidamente. Entretanto, átomos de hidrogênio que estão acessíveis ao solvente mas pertencem a algum tipo de estrutura secundária, como alfa-hélice e folhas betas, ou apresentam alguma ligação de hidrogênio são protegidos desta troca. Interações entre cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos podem não perturbar a taxa de xxvii.

(27) incorporação de deutério da cadeia principal. Exemplo baseado na estrutura da lisozima interagindo com anticorpo (PDB 1MEL) .......................................... 29 Figura 20. Gráfico do logaritmo da constante de troca (kex) hidrogêniodeutério para os diferentes tipos de hidrogênios lábeis encontrados em proteínas e peptídeos em função do pH da solução. O mínimo de troca para os hidrogênios da cadeia principal é em torno de pH 2,5. As faixas em amarelo demonstram as faixas de pH da solução utilizadas nos experimentos de HDX para realizar as reações de troca (pH 7,0-8,0) e para diminuir a taxa de troca reversa dos ensaios (pH 2,0-3,0) ......................................................... 30 Figura 21. Efeitos da temperatura na constante de troca hidrogênio-deutério um peptídeo modelo de poli-alanina em solução com pH 7,0. A equação de Arrhenius foi utilizada para calcular as constantes de troca em diferentes temperaturas. A constante de troca hidrogênio-deutério em 25ºC é aproximadamente 7 vezes maior que a constante de troca hidrogêniodeutério em 0ºC ................................................................................................. 32 Figura 22. Esquema representativo do experimento de HDX acoplado a MS. (1) Diluição da proteína em tampão D2O. (2) Parar a troca hidrogêniodeutério em diferentes tempos de incubação para construir a cinética de troca hidrogênio-deutério, utilizando um tampão desenovelante pH 2,5, 0ºC. (3) Digestão das amostras utilizando pepsina. (4) Análise dos peptídeos separados através de cromatografia por MS. (5) Processamento das amostras obtendo informações do número de átomos de deutério incorporados por um determinado peptídeo através da comparação do padrão isotópico deste peptídeo na amostra controle e na amostra da cinética. (6) Interpretação dos dados de incorporação de deutério na estrutura da proteína .......................................................................................... 33 Figura 23. Sequência dos resíduos de aminoácidos do C-terminal da SHsp90. Os resíduos de aminoácidos sublinhados foram demarcados como resíduos de aminoácidos pertencentes ao sítio de interação do C-terminal e os resíduos de aminoácidos não destacados foram restringidos do sítio de interação do C-terminal. ..................................................................................... 43 Figura 24. Sequência dos resíduos de aminoácidos da SHsp90 destacandose em vermelho os 81 resíduos de lisina presentes na sequência. ................... 44 Figura 25. Espectros de ESI-MS/MS para espécies do tipo inter-peptídeos da proteína SHsp90. A modificação pelo agente de ligação cruzada está representada por um traço preto entre os resíduos de lisina. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. Os padrões isotópicos dos íons precursores antes da deconvolução dos espectros foram introduzidos nos espectros. ................................................................................ 46 Figura 26. Espectro de ESI-MS/MS para espécies do tipo intra-peptídeo da proteína SHsp90. A modificação pelo ALC está representada em preto entre xxviii.

(28) os resíduos de lisina. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. Os padrões isotópicos dos íons precursores antes da deconvolução dos espectros foram introduzidos nos espectros. ..................................................... 48 Figura 27. Espectro de ESI-MS/MS para espécie do tipo dead-end da proteína SHsp90. O grupo hidroxila representa o ALC hidrolisado. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. Os padrões isotópicos do íon precursor antes da deconvolução do espectro foi introduzido no espectro.............................................................................................................. 49 Figura 28. Mapeamento das ligações cruzadas dos resíduos de lisina (K) das espécies do tipo inter- e intra-peptídeos (em vermelho) e das espécies do tipo dead-end (sublinhado) obtidas com a análise das corridas de LC-MS da proteína SHsp90. O domínio N-terminal está representado em azul, o domínio intermediário em verde e o domínio C-terminal em laranja. ................. 50 Figura 29. Representação estrutural da SHsp90 modelada através de modelagem comparativa utilizando diferentes programas (I-Tasser, Mholline, Swiss-Model e Modeller). As estruturas da SHsp90 modeladas pelos diferentes softwares são bastante semelhantes modificando principalmente regiões de loops e poucas regiões de estrutura secundária. O programa ITasser disponibilizou 5 melhores estruturas que estão representadas nesta figura, enquanto que os outros programas disponibilizaram apenas a melhor estrutura. ............................................................................................................ 51 Figura 30. Faixa de (A) distância de alcance da cadeia espaçadora do DSS; (B) distância topológica teórica máxima de alcance do agente de ligação cruzada com a cadeia lateral do aminoácido lisina para validar modelos gerados. ............................................................................................................. 52 Figura 31. Gráfico dos valores de distância topológica versus espécies de ligação cruzada obtidas pelo Xwalk entre os átomos de carbono alfa dos resíduos de lisina para os modelos gerados pelos programas I-Tasser (1-5), Mholline, Modeller e Swiss-Model (SP). A distância limite máxima (24 Å) está representada em uma linha vermelha. ............................................................... 53 Figura 32. Porcentagens de áreas acessíveis ao solvente dos resíduos de lisina que sofreram modificação pelo ALC. As porcentagens de área foram calculadas utilizando o programa PyMOL. ......................................................... 54 Figura 33. Gráficos de porcentagens de resíduos em: regiões favoráveis (A); regiões adicionalmente permitidas (B); regiões generosamente permitidas (C); regiões desfavoráveis (D); obtidas pelo PROCHECK para os gráficos de Ramachandran das estruturas modeladas (I-Tasser 1,2 e 4; Mholline, SwissModel e Modeller) e das estruturas cristalográficas (Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9), Leishmania major (PDB 3HJC) e Plasmodium falciparum (PDB 3K60)) utilizadas como modelo para modelagem por homologia. .......................................................................................................... 55 xxix.

(29) Figura 34. Gráfico de Ramachandran para o modelo da SHsp90 gerado pelo Modeller, onde os resíduos de aminoácidos estão representados em preto, as regiões dos valores dos ângulos de torções (phi e psi) favoráveis estão representadas em vermelho, as regiões dos valores dos ângulos de torções adicionalmente permitidas estão representadas em amarelo, , as regiões dos valores dos ângulos de torções generosamente permitidas estão representadas em bege e , as regiões dos valores dos ângulos de torções não permitidas estão representadas em branco. ............................................... 56 Figura 35. Representação das distâncias topológicas dos ALCs (em azul) em termos de superfície da estrutura da SHsp90 modelada pelo Modeller. ............ 57 Figura 36. Mapa de cobertura da sequência de resíduos de aminoácidos da SHsp90 obtidas pela otimização do ensaio de HDX. As faixas em azul representam os peptídeos gerados na digestão péptica, analisados por LCMSE e identificados pelo DynamX, demonstrando 77 % de cobertura. A estrutura secundária é referente ao modelo da SHsp90 gerado pelo Modeller.. 58 Figura 37. Representação do padrão isotópico dos peptídeos na análise de HDX para calcular a taxa de incorporação de deutério. (A) Demonstração da massa média (em verde) e largura do padrão isotópico (em laranja) dos peptídeos. (B) Curva de incorporação de deutério para o peptídeo MRKPEEITKEEY. Esta curva apresenta no eixo y o número máximo de átomos de deutério que podem ser incorporados para este peptídeo, isto é, 10 átomos de deutério podem ser incorporados pelo peptídeo MRKPEEITKEEY. .............................................................................................. 60 Figura 38. Exemplos de curvas de cinética da taxa de incorporação de deutério obtida pelo processamento utilizando o DynamX após a análise de HDX acoplado a LC-MSE para proteína SHsp90................................................ 61 Figura 39. Representação da estrutura dimérica da SHsp90 obtida através da modelagem do monômero gerado pelo Modeller utilizando como estrutura molde a estrutura cristalográfica da Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9). ...................................................................................................... 62 Figura 40. Representação da estrutura dimérica da SHsp90. (A) Um monômero está representado na forma de cartoon e a outro na forma de superfície. (B) monômeros representados na forma de superfície. Os peptídeos que apresentaram altas taxas de troca de hidrogênio-deutério estão destacados em vermelho, onde observa-se em algumas regiões a sobreposição pelo outro monômero, o que torna estas regiões pouco acessíveis ao solvente. ...................................................................................... 63 Figura 41. Representação da dimerização dos domínios C-terminal da SHsp90, a partir da estrutura gerada pelo Modeller, sendo representados em diferentes tons de azul os resíduos de aminoácidos que participam efetivamente da interação. ................................................................................. 65 xxx.

(30) Figura 42. Representação da estrutura dimérica da SHsp90 obtida através do docking demonstrando uma estrutura com uma conformação ligeiramente aberta quando comparada com a estrutura proposta inicialmente (Figura 40). Os peptídeos que apresentaram altas taxas de troca de hidrogênio-deutério estão destacadas em vermelho, onde não observa-se sobreposição de resíduos de aminoácidos que apresentaram altas taxas de incorporação de deutério. ............................................................................................................. 67 Figura 43. Espectro de emissão de fluorescência para analisar o ambiente dos resíduos de triptofano. Os espectros foram obtidos com a SHsp90 na ausência (pontos quadrados) e na presença de cloreto de guanidina (círculos abertos). A excitação dos resíduos de triptofano na análise ocorreu em 295nm e a emissão de 305 a 420 nm ................................................................ 68 Figura 44. Representação estrutural da proteína SHsp90 na forma de dímero. Os resíduos de lisinas, que sofreram algum tipo de modificação pelo ALC, estão representados em vermelho e os resíduos de triptofano estão representados em azul. ...................................................................................... 69 Figura 45. Gráfico da porcentagem de área acessível ao solvente (calculada utilizando o PyMOL) ou porcentagem de incorporação de deutério versus peptídeos gerados pela análise de HDX. Os gráficos de taxa de incorporação de deutério para os peptídeos numerados estão apresentados no ANEXO I. ... 70 Figura 46. Representação em azul das regiões dinâmica da proteína SHsp90 obtidas do experimento de HDX através da alta taxa de incorporação de deutério no tempo de 10 segundos. ................................................................... 71 Figura 47. Representação da porcentagem de incorporação de deutério para o domínio N-terminal e o domínio do intermediário na cinética de incorporação de deutério. As letras B, C1 e M, são referentes as alfa-hélices B e M e folha beta C1 da Figura 36.................................................................... 72 Figura 48. Representação da taxa de incorporação de deutério para o domínio C-terminal na cinética de incorporação de deutério. ............................ 73 Figura 49. Sequência de aminoácidos da SHsp70 destacando-se em vermelho os 51 resíduos de lisina. ..................................................................... 74 Figura 50. Espectros de ESI-MS/MS para espécies do tipo inter-peptídeos da proteína SHsp70. A modificação pelo agente de ligação cruzada está representada por um traço preto entre os resíduos de lisina. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. ........................................ 76 Figura 51. Espectro de ESI-MS/MS para espécies do tipo intra-peptídeo da proteína SHsp70. A modificação pelo ALC está representada em preto entre os resíduos de aminoácidos modificados. Os íons fragmentos estão anotados conforme a série -b e -y. .................................................................................... 77 xxxi.

(31) Figura 52. Mapeamento das ligações cruzadas dos resíduos de lisina (K) das espécies de inter e intra-peptídeos (em vermelho) e das espécies de deadend (sublinhado) obtidas com a análise das corridas de LC-MS da proteína SHsp70. O domínio N-terminal está representado em azul e o domínio Cterminal em verde............................................................................................... 78 Figura 53. Distâncias topológicas versus espécies de ligação cruzada obtidas pelo Xwalk para os modelos gerados pelo software do I-Tasser (1-5) .. 80 Figura 54. Representação da estruturas Hsp70. (A) estrutura inicial modelada por modelagem por homologia com conformação aberta. (B) estrutura final com rearranjo dos subdomínios. As lisinas que reagiram com o ALC estão marcadas em vermelho. Em amarelo estão as distâncias euclidianas entre os resíduos de aminoácidos ................................................... 81. xxxii.

(32) Introdução. 1. INTRODUÇÃO 1.1.. Estrutura de Proteínas. Proteínas são macromoléculas biológicas compostas de aminoácidos ligados através de ligações peptídicas, podendo ter diferentes estruturas tridimensionais e podem ser classificadas quanto à composição química como proteínas simples (compostas apenas de resíduos de aminoácidos) ou proteínas conjugadas (compostas por um grupo prostético - que constituem componentes químicos diretamente associados aos aminoácidos).1 A ligação peptídica entre os resíduos de aminoácidos apresenta caráter parcial de dupla ligação devido à ressonância entre a dupla ligação da carbonila e a ligação carbono-nitrogênio, portanto, esta ligação é rígida e planar. A geometria dos átomos de carbono alfa (Cα) da cadeia principal se encontra em configuração trans, configuração energeticamente favorável (Figura 1) quando comparada a configuração cis, e os resíduos de aminoácidos presentes em quase todas as proteínas estão em configuração estereoquímica L, devido a estereoespecificidade dos sítios ativos assimétricos das enzimas. 1,2. Figura 1. Representação da ligação peptídica de proteínas, onde observa-se que essa ligação é planar e as ligações N – Cα e Cα – C podem apresentar rotações cujos ângulos são denominados phi (ø) e psi (Ψ), respectivamente.1. A estrutura tridimensional de uma determinada proteína é denominada estrutura nativa ou enovelamento proteico. O enovelamento proteico apresenta diferentes níveis de organização estrutural conforme representado na Figura 2. A estrutura primária é definida pela sequência específicas de resíduos de aminoácidos que compõe a cadeia polipeptídica, esta sequência de aminoácidos é única para cada proteína e define a estrutura e função desta proteína.. 1,2,3. 1.

(33) Introdução. Figura 2. Representação dos níveis estruturais de uma proteína. Estrutura primária é definida pela sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína. A estrutura secundária é o arranjo espacial local entre os resíduos de aminoácidos. A estrutura terciária é definida pelo arranjo tridimensional de todos resíduos de aminoácidos. A estrutura quaternária, por sua vez, é definida como o arranjo espacial de subunidades de cadeias polipeptídicas. Estrutura baseada na hemoglobina (PDB 1C7D).1,2,3. O arranjo espacial entre os resíduos de aminoácidos adjacentes da cadeia principal através de ligações de hidrogênio define a estrutura secundária. Este nível organizacional pode ser classificado em alfa-hélice e folha beta, sugeridos por Linus Pauling e colaboradores em 1951.4 A alfa-hélice apresenta uma estrutura helicoidal, em que a principal alfa-hélice contém 3,6 resíduos de aminoácidos por volta e ligação de hidrogênio entre 4 resíduos de aminoácidos (Figura 3A e 3B). As folhas beta consistem em um estrutura em ziguezague, na qual a ligação de hidrogênio ocorre entre segmentos adjacentes na cadeia polipeptídica (Figura 3C).1,2,5. 2.

(34) Introdução. Figura 3. Arranjo estrutural das estruturas secundárias. (A) Orientação dos átomos da cadeia principal na alfa-hélice. As ligações de hidrogênio são formadas pelos átomos de hidrogênio e o oxigênio da ligação peptídica entre 4 resíduos de aminoácidos (i, i+4) estabilizando esta conformação. (B) Vista de cima do eixo de uma alfa-hélice. As cadeias laterais (R) dos resíduos de aminoácidos estão do lado de fora na estrutura da alfa-hélice. (C) Orientação dos átomos da cadeia principal na estrutura folha beta que consiste em uma estrutura em ziguezague. A ligação de hidrogênio ocorre entre os átomos de hidrogênio e oxigênio da ligação peptídica entre seguimentos adjacentes na cadeia polipeptídica. 5. Algumas regiões das proteínas apresentam estruturas não regulares denominadas loops e turns. Os turns são pequenos segmentos de aminoácidos que ligam duas estruturas secundárias. Os loops são segmentos com um número maior de resíduos de aminoácidos causando uma região flexível na proteína. 1,5 A região desestruturada das proteínas pode ser responsável por diversos papéis biológicos fundamentais nos organismos. Como exemplos, em algumas enzimas esta região é responsável pela ligação com o substrato e pode participar nesta catálise, como é o caso da interação entre proteína p53 e o domínio CBP (Figura 4); em proteínas responsáveis pela ligação com DNA. Os loops quando presente entre alfa-hélices tornam possível a interação destas estruturas 3.

(35) Introdução. secundárias com o DNA. Existem proteínas instrisecamente desestruturadas que assumem uma determinada conformação estrutural ao ligar-se com diferentes substratos, como o caso da interação entre o fator induzido por hipóxia 1 alfa (HIF1α) com o fator inibidor de HIF-1α (FIH) e com o domínio da CBP (Figura 5).5-7. Figura 4. Estrutura do complexo formado entre a proteína p53 (demonstrada em azul escuro) e domínio CBP-bromo (demonstrada em cinza) (PDB 1JSP). Aproximação da região de interação entre o sítio de ligação do domínio de ligação CBP e o peptídeo da proteína p53. Os resíduos de interação do domínio CBP estão representados em verde e os resíduos de interação da proteína p53 estão representado em vermelho, amarelo e em azul claro que contém um resíduo de acetil-lisina (AcLys). 6. A. B. Figura 5. Alterações da estrutura da HIF-1α na interação com o domínio CBP (PDB 1L8C) (A) e com o fator de inibição da HIF-1α (FIH) (PDB 1H2K) (B). A proteína intrinsecamente desestruturada HIF-1α está demonstrada em vermelho e as regiões que apresentam diferentes estruturas nos dois complexos estão representadas em azul.7. Alguns resíduos de aminoácidos tem tendência de serem encontrados em maiores quantidades em proteínas e em determinadas estruturas secundárias, 4.

(36) Introdução. portanto, estudos foram realizados para determinar estas porcentagens de resíduos de aminoácidos (Figura 6). Para isso, foram utilizadas 1654 proteínas nativas obtidas a partir do servidor PISCES (Protein Sequence Culling Server), que filtrou estruturas tridimensionais de proteínas com alta resolução depositadas no PDB (Protein Data Bank). Com base nesse estudo, foi observada uma maior porcentagem dos resíduos de aminoácidos leucina e alanina em proteínas nativas; de prolina e glicina em loops; de ácido glutâmico e alanina em alfa-hélice e valina e iso-leucina em folhas beta, quando comparado com os demais aminoácidos.8. Figura 6. Porcentagem de resíduos de aminoácidos em estruturas tridimensionais de proteínas (A) e em estruturas secundárias de proteínas (alfa-hélice, folha beta ou loop) (B). Esses valores foram obtidos por cálculos através de 1654 estruturas de alta resolução de proteínas depositadas no PDB filtradas pelo servidor PISCES. Os resíduos de aminoácidos estão representados por abreviação de uma letra.8. O arranjo tridimensional de todos os átomos da cadeia polipeptídica é definido como estrutura terciária, no qual interações entre os resíduos de aminoácidos podem ocorrer através de ligação de hidrogênio, ligação de dissulfeto, interações iônicas e hidrofóbicas.. O arranjo estrutural entre. 5.

(37) Introdução. subunidades da proteína (cadeias peptídicas separadas) é definido como estrutura quaternária (Figura 2).1,2,5 A estrutura nativa das proteínas está diretamente ligada a sua estabilidade e atividade biológica, portanto, com exceção das proteínas intrinsicamente desordenadas, alterações em suas estruturas podem provocar a perda de sua função biológica. 1,2,5,6. 1.2.. Enovelamento de Proteínas. O mecanismo de enovelamento de proteínas é bastante estudado experimentalmente e teoricamente por diversos cientistas. Um grande estímulo para estes estudos é originário do dogma de Anfinsen e o paradoxo de Levinthal. O dogma de Anfinsen foi postulado a partir de estudos de desenovelamento com a proteína ribonuclease A, onde foi demonstrado que proteínas enovelam-se reversivelmente. Através desta observação, foi instituído que para proteínas pequenas e globulares a estrutura nativa depende apenas da sequência de aminoácidos e das condições do meio para se enovelar, consequentemente, o caminho para seu enovelamento deve levar à uma estrutura termodinamicamente estável. 9,10 Na mesma época, estudos teóricos realizados por Levinthal demonstraram que o enovelamento de uma cadeia polipeptídica, testando todo espaço conformacional possível, levaria um tempo maior que a idade do universo. Entretanto, experimentalmente isso não foi observado. Através dessa evidência, foi sugerido que o processo de enovelamento para uma proteína deve experimentar apenas uma parte do espaço conformacional, pressupondo que existem vias cinéticas de enovelamento. Essa diferença entre o tempo de enovelamento experimental e o tempo calculado ficou conhecido como paradoxo de Levinthal.11 Atualmente, sabe-se que o enovelamento proteico deve satisfazer dois requisitos: a termodinâmica e a cinética. Termodinamicamente a cadeia polipeptídica deve obter uma estrutura nativa única estável em condições fisiológicas e com menor energia livre independente das vias de enovelamento. 6.

(38) Introdução. Cineticamente a cadeia polipeptídica deve obter a estrutura nativa rapidamente, em escala de tempos biológicos. 12, 13 Existem diversas teorias referentes ao enovelamento de proteínas, uma dessas teorias diz que o enovelamento acontece a partir de um colapso hidrofóbico. Nessa etapa, o agrupamento das cadeias laterais de resíduos hidrofóbicos da cadeia polipeptídica ocorre espontaneamente, através de uma etapa rápida, formando um estado mais compacto, denominado de molten globule. A energia de formação desse intermediário é energeticamente estabilizada pelo sequestro das cadeias laterais hidrofóbicas do ambiente aquoso, originando um intermediário em que as cadeias laterais hidrofóbicas são mantidas na parte interna da proteína, enquanto que as cadeias laterais hidrofílicas ficam expostas ao solvente na superfície da proteína (Figura 7). Após a formação do intermediário molten globule, ocorre um rearranjo entre as interações dos resíduos de aminoácidos formando estruturas secundárias e domínios da estrutura nativa, a partir de uma etapa lenta.1,14,15. Figura 7. Etapas do enovelamento de proteínas pela teoria do colapso hidrofóbico. Inicialmente ocorre um colapso hidrofóbico, etapa rápida, no qual, tende-se isolar os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em contato com o solvente, seguido de um rearranjo das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos através das interações internas que levam a estrutura nativa da cadeia polipeptídica a partir de uma etapa lenta. Nesta figura, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos estão representados em cinza, enquanto que os resíduos de aminoácidos hidrofílicos em branco. 14,15. 7.

(39) Introdução. O processo de enovelamento proteico aceito atualmente é descrito através de um funil de potencial de energia, proposto inicialmente por Baldwin, conforme apresentado na Figura 8. A cadeia polipeptídica inicialmente desenovelada possui uma alta energia e grande número de conformações. O afunilamento estrutural buscando obter a menor energia livre ocorre através do colapso e interações entre os resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica até a proteína alcançar um estado nativo. Essa teoria possibilita a formação do estado nativo através de diversos caminhos. A formação de intermediários estáveis para algumas proteínas pode ocorrer durante o processo de enovelamento sendo encontrados em pequenas depressões no funil denominadas de mínimo locais de energia. 16-19. Figura 8. Representação do funil de potencial de energia de enovelamento e de formação de agregados. A região roxa (esquerda) demonstra o afunilamento da cadeia polipeptídica ocasionada por contatos intramoleculares para o estado nativo da proteína, com menor entropia que a cadeia polipeptídica desenovelada. A região rosa (direita) demonstra as conformações da cadeia polipeptídica se movendo em direção a formação de agregados proteicos (agregado amorfo, oligômero e fibra amilóide) através de contatos intermoleculares. Os funis estão sobrepostos pois a formação de agregados pode ocorrer a partir de intermediários durante o processo de enovelamento, assim como da desestabilização da estrutura nativa. Os agregados proteicos e estruturas parcialmente enoveladas podem ser prevenidas através de chaperonas moleculares.19. 8.

(40) Introdução. O processo de enovelamento in vivo é mais complexo devido a fatores presentes no ambiente celular, como força iônica e concentração de proteínas. Em virtude dessa complexidade do processo de enovelamento nesse ambiente, alterações na estrutura nativa de proteínas podem ocorrer, formando proteínas instáveis ou proteínas parcialmente enoveladas que podem favorecer a formação de agregados proteicos a partir da interação intermolecular de cadeias laterais hidrofóbicas, que em estados nativo estariam internalizadas (Figura 8).17-20 A agregação de proteínas desestruturadas ou parcialmente desestruturadas pode inicialmente formar estruturas amorfas, entretanto, interações mais complexas podem levar a formação de agregados proteicos fibrilares altamente organizados perpendicularmente por estruturas ricas em folha beta, denominados de fibras amilóides. Os diferentes tipos de agregados proteicos quando formados em células, se tornam tóxicos e no caso dos seres humanos são os causadores de diversas doenças neurodegenerativas como Parkinson, Alzheimer, Huntington, além de diabetes tipo II, câncer, dentre outras doenças.21,22 Para prevenir a formação de proteínas parcialmente desestruturas, em células, existe uma classe de proteínas denominadas chaperonas moleculares que são capazes de assistir o enovelamento de outras proteínas. Proteínas dessa classe, reconhecem cadeias polipeptídicas parcialmente enoveladas através das regiões hidrofóbicas expostas ao solvente, e a partir da energia liberada pela hidrólise de ATP, as chaperonas moleculares desenovelam essas cadeias polipeptídicas possibilitando um novo enovelamento para esse substrato. Além dessa função, essas proteínas também auxiliam na prevenção da formação de agregados proteicos, na desagregação de agregados proteicos, na translocação de proteínas para compartimentos sub-celulares específicos, assim como, no transporte. de. proteínas. desestruturadas. para. degradação,. colaborando. efetivamente com o sistema de controle de qualidade das proteínas na célula.. 18,19. 9.

(41) Introdução. 1.3.. Chaperonas Moleculares. As chaperonas moleculares podem ser classificadas em diferentes grupos conforme a homologia de sequência dos resíduos de aminoácidos, sendo as proteínas de choque térmico (heat-shock proteins, Hsp) a principal família. Esta família de proteínas foi descoberta por Ritossa, em 1962, quando observou o aumento. na. expressão. de. uma. proteína. desconhecida. ao. aumentar. acidentalmente a temperatura das estufas em uma análise com Drosophila. Esse fenômeno ficou conhecido, posteriormente, como resposta ao choque térmico, e as proteínas denominadas de proteínas de choque térmico.. 23-25. As famílias das chaperonas moleculares podem ser classificadas com base nas suas funções e interações com proteína-substrato ou com base na massa molecular dos monômeros da proteína. Na classificação com base nas funções e interações com proteína-substrato, essa família de proteína pode ser classificada como holdase, foldase e desagregase. As holdases podem reconhecer, ligar e estabilizar. polipeptídios. totalmente. ou. parcialmente. desnovelados,. são. independentes de ATP e responsáveis pelo transporte de proteínas-substrato para a foldase evitando a formação de agregados proteícos. As foldases, por sua vez, enovelam proteínas que perderam sua estrutura tridimensional através da energia de hidrólise do ATP. Finalmente, as desagregases são responsáveis pela desagregação de proteínas agregadas e transporte para as holdases e foldases (Figura 9).26 A classificação das famílias das chaperonas moleculares com base na massa molecular é dada pela massa molecular em kDa de seus monômeros, entretanto, normalmente suas estruturas ativas em células se apresentam na forma de oligomérica (Tabela 1). Dentre as famílias mais importantes das chaperonas moleculares é possível destacar as Hsp70, Hsp60/10, Hsp90, Hsp100 e sHsp (small heat-shock proteins).26,27 Estas proteínas estão presentes em maior número e variedade quando comparada com as demais proteínas conforme aumenta a complexidade do organismo, pois são necessárias para o sistema de controle de qualidade das proteínas com aumento da complexidade da 10.

(42) Introdução. organização intracelular, e são normalmente auxiliadas por co-chaperonas como a Hsp40. 26,27. Figura 9. Representação esquemática da atuação das chaperonas moleculares em células com base na classificação quanto as funções destas proteínas. As holdases (1) podem se ligar a proteínas desenoveladas e transportar para as foldases (2) que auxiliam no re-enovelamento desta proteínas. As desagregases (3) separam agregados proteicos e transportam para as holdases e foldases. As chaperonas também atuam no transporte de proteínas sem estrutura para o proteassomo (4) para degradação. 26 Tabela 1. Classificação das chaperonas moleculares quanto a massa molecular em kDa dos monômeros desta proteína, o oligômero funcional e função.26. (kDa)a. Proteína. Massa molecular oligômero funcional. sHsp. 10 - 30/ 8 – 24. holdase. Hsp40b. ~40/ dímero. holdase. Hsp60/Hsp10b. ~60/~10; duplo heptâmero/heptâmero. foldase. Hsp70. ~70/ monômero. foldase. Hsp90. ~90/ dímero. foldase. Hsp100. ~100/ hexâmetro. a monômero; b. /. Função. holdase/ disaggregase. co-chaperonas. 11.

(43) Introdução. Atualmente, sabe-se que a alteração na síntese de chaperonas moleculares podem ser causadas por outros tipos de estresse além da temperatura, podendo provocar alterações em suas atividades proteicas. Com isso, devido a importância do processo de enovelamento proteico e da atividade chaperona neste processo, vem crescendo o interesse de estudos para entender os processos de enovelamento proteico, uma vez que as proteínas desenoveladas são causadoras de diversas doenças nos seres humanos e alterações na atividade das chaperonas moleculares são importantes na resistência de organismos à diversas condições de estresse como é o caso de plantas. O objetivo destes estudos na área médica é desenvolver medicamentos que possam auxiliar nos tratamentos das doenças provocadas por essas alterações, enquanto que na área biotecnológica, estes estudos tornam-se importantes no desenvolvimento de organismos mais resistentes a diversas condições de estresse.26,28. 1.4.. Importância de chaperonas moleculares em plantas. As plantas são organismos que devido a sua imobilidade frequentemente necessitam de respostas fisiológicas para a sua sobrevivência em diversas condições de estresse às quais são expostas. As condições de estresse mais comuns para estes organismos são ocasionadas por agentes patogênicos, pela presença de metais pesados e etanol nos solos, assim como por mudanças ambientais, como secas, salinidade e temperaturas extremas. 29 Assim como nos demais organismos, em plantas podem ocorrer desnaturação e agregação de diversas proteínas em virtude das diversas condições de estresse. Esses acontecimentos podem acarretar em perdas econômicas no setor agrícola, pois influenciam diretamente em alguns processos celulares das plantas, como no crescimento, na fotossíntese, na estabilidade da membrana, nos metabólitos primários e secundários, além de inibir a germinação de diversas espécies. 30 Estudos demonstram que as plantas apresentam um mecanismo de resistência ao aumento gradativo de temperatura, sobrevivendo em condições que seriam letais para as espécies não resistentes. Esse fenômeno de resistência é 12.

(44) Introdução. observado devido mudanças fisiológicas nas quais ocorrem diminuição na síntese de proteínas normais e mRNA, além do aumento na síntese das chaperonas moleculares que auxiliam no enovelamento de outras proteínas. 30,31 Devido ao grande impacto econômico da cana-de-açúcar no Brasil, a alta resistência a diversos tipos de estresse e poucos estudos sobre os fatores que corroboram com a tolerância ao estresse dessas espécies, obter informações estruturais das Hsp90 e Hsp70 de cana-de-açúcar (SHsp90, SHsp70 – Sugarcane Heat-shock protein) é uma estratégia importante para entender os mecanismo biológicos destas proteínas nesses organismos. 32-34. 1.5.. Hsp70. A Hsp70 é uma das proteínas mais abundantes entre as proteínas de choque térmico em bactérias e eucariotos. Esta proteína possui aproximadamente 70 kDa em massa e é composta por dois domínios principais: o domínio de ligação nucleotídica (NBD) ou domínio N-terminal, de aproximadamente 45 kDa, responsável pela atividade ATPase; e o domínio de ligação com substrato (SBD) ou domínio C-terminal, de aproximadamente 25 kDa, responsável pela interação com outras proteínas (Figura 10). O domínio C-terminal possui uma região de interação com o substrato que tem alta afinidade por resíduos de aminoácidos neutros ou hidrofóbicos e uma região rica em alfa hélices (LID) que regula essa ligação com o substrato. 35,36. 13.

(45) Introdução. Figura 10. Estrutura cristalográfica da Hsp70 de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2QXL), com 26% de similaridade de sequência com a SHsp70. O domínio de ligação nucleotídica (NBD) está representado em verde e o domínio de ligação com substrato (SBD) em amarelo e vermelho, onde está destacada a região rica em alfa-hélices (LID).. Nas células de plantas, as proteínas homólogas de Hsp70 são encontradas principalmente no citoplasma, lúmen do retículo endoplasmático, na mitocôndria e cloroplastos. A atividade destas proteínas nesses organismos está relacionada com a translocação de proteínas organelares e secretoras de citosol por membranas para o retículo endoplasmático e mitocôndria, com o controle de atividades de proteínas reguladores, além do auxílio no enovelamento proteico.3538. A atividade da Hsp70 no auxílio do enovelamento das cadeias polipeptídicas ocorre a partir da interação destas proteínas com os substratos (cadeias polipeptídicas desestruturadas) na presença de ATP e co-chaperonas, como a Hsp40. A interação das co-chaperonas com a Hsp70 ocorre através do domínio conservado J das co-chaperonas, que é uma região rica em alfa-hélices e contém aproximadamente 70 resíduos de aminoácidos. A atividade da Hsp70 pode ser descrita através de um ciclo (Figura 11), onde inicialmente a Hsp70 ligada ao ATP apresenta baixa afinidade com o substrato, devido a conformação do domínio SDB aberto. O substrato, normalmente, é transportado pela Hsp40 que se liga à Hsp70 e estimula a atividade ATPase. O domínio NBD, ligado ao ADP, 14.