Validação dos modelos estruturais da SHsp90

A predição do modelo estrutural da SHsp90 foi realizada através de modelagem por homologia em plataformas online. Este processo envolve normalmente quatro etapas: busca por proteínas homólogas, alinhamento das sequências das proteínas, construção e otimização dos modelos e validação dos mesmos.54

As três primeiras etapas foram realizadas pelos softwares Modeller, I- Tasser, Swiss-Model e Mholline. A partir dos resultados da modelagem comparativa, observou-se que as mesmas estruturas das proteínas Hsp90 depositadas no PDB das espécies Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9), Leishmania major (PDB 3HJC) e Plasmodium falciparum (PDB 3K60) foram selecionadas pelos diferentes softwares para modelagem, obtendo cerca de 70%

51 similaridade entre as sequências das estruturas depositadas com SHsp90. Os modelos gerados pelos programas estão representados na Figura 29, onde observa-se que todos os modelos são bastante semelhantes, modificando principalmente regiões loops e poucas regiões de estruturas secundárias. A semelhança dos modelos gerados pelos diferentes programas de modelagem por homologia acontece principalmente devido ao fato dos diferentes programas utilizarem as mesmas proteínas-moldes.

Figura 29. Representação estrutural da SHsp90 modelada através de modelagem comparativa utilizando diferentes programas (I-Tasser, Mholline, Swiss-Model e Modeller). As estruturas da SHsp90 modeladas pelos diferentes softwares são bastante semelhantes modificando principalmente regiões de loops e poucas regiões de estrutura secundária. O programa I-Tasser disponibilizou 5 melhores estruturas que estão representadas nesta figura, enquanto que os outros programas disponibilizaram apenas a melhor estrutura.

A validação das estruturas da SHsp90 modeladas pelos diferentes softwares foi primeiramente realizada através das informações de restrições de distância obtidas pelas espécies de ligação cruzada obtidas experimentalmente. Para isso, foi utilizado o programa Xwalk para calcular as distâncias topológicas entre os resíduos de lisina que apresentaram espécies de ligação cruzada. Esta distância topológica foi calculada entre os átomos de carbono alfa destes resíduos de lisina. Os valores de distância calculados para os resíduos de lisina das espécies que sofreram modificação pelo ALC das diferentes estruturas foram comparados com os valores da distância máxima teórica entre os resíduos de

52 lisina que é de aproximadamente 24 Å (11,4 Å referente ao DSS + 10 Å referente as cadeias laterais dos resíduos de lisina calculada a partir do carbono alfa, Figura 30).76 _{O gráfico contendo as informações de distâncias topológicas calculadas} através do Xwalk para as diferentes estruturas da SHsp90 modeladas podem ser observadas na Figura 31, em que a distância limite máxima (24 Å) é representada por uma linha vermelha.

Figura 30. Faixa de (A) distância de alcance da cadeia espaçadora do DSS; (B) distância topológica teórica máxima de alcance do agente de ligação cruzada com a cadeia lateral do aminoácido lisina para validar modelos gerados.

Analisando a Figura 31, verifica-se que os modelos gerados pelo I-Tasser 3 e 5 apresentam algumas distâncias topológicas entre os carbonos alfa relativamente maiores que a distância máxima permitida, portanto, estes modelos foram descartados. O modelo gerado pelo Swiss-Model (SP) apresentou algumas espécies de ligação cruzada com distâncias ligeiramente maiores que a distância máxima permitida, entretanto, esse modelo não foi descartado, já que em solução

A

53 a estrutura da proteína apresenta uma determinada dinâmica, consequentemente as distâncias entre os resíduos de lisina podem ser menores.

Figura 31. Gráfico dos valores de distância topológica versus espécies de ligação cruzada obtidas pelo Xwalk entre os átomos de carbono alfa dos resíduos de lisina para os modelos gerados pelos programas I-Tasser (1-5), Mholline, Modeller e Swiss-Model (SP). A distância limite máxima (24 Å) está representada em uma linha vermelha.

O critério de acessibilidade ao solvente, obtido através dos resíduos de aminoácidos que sofreram algum tipo de modificação por ligação cruzada, também foi utilizado para validar os modelos gerados. Para isso, foram calculadas através do programa PyMOL as porcentagens de áreas dos resíduos de lisina acessíveis ao solvente (Figura 32). Observa-se que para todos os modelos os resíduos de lisina que sofreram modificação pelo ALC apresentaram acessibilidade ao solvente (porcentagem de área maior que zero), impossibilitando eliminação de alguma estrutura modelada a partir deste resultado experimental.

54 Figura 32. Porcentagens de áreas acessíveis ao solvente dos resíduos de lisina que sofreram modificação pelo ALC. As porcentagens de área foram calculadas utilizando o programa PyMOL.

O gráfico de Ramachandran obtido a partir do software PROCHECK foi, então, utilizado para obter informações sobre a qualidade dos modelos aprovados pelas informações experimentais de ligação cruzada. Este programa avalia os parâmetros estereoquímicos da estrutura, como comprimentos de ligação, os ângulos, planaridade da cadeia lateral, planaridade das cadeias peptídicas, a qualidade do gráfico de Ramachandran, entre outros. O principal gráfico por ele gerado é o gráfico de Ramachandran, que apresenta uma correlação entre os ângulos torcionais da cadeia principal (phi e psi) para cada resíduo, sendo considerado um modelo de boa qualidade aquele que possui mais de 90% dos resíduos em regiões favoráveis.

Os resultados das porcentagens de resíduos de aminoácidos em regiões favoráveis, adicionalmente favoráveis, generosamente favoráveis e desfavoráveis obtidos através do gráfico de Ramachandran para cada modelo validado pelos resultados de restrições de distância podem ser observados na Figura 33. A maioria dos modelos gerados apresentaram entre 80 e 90 % dos resíduos em regiões favoráveis, sendo que os modelos gerados pelo Modeller e Mholline apresentaram maior porcentagem de resíduos em regiões favoráveis.

55 Também foram gerados os gráficos de Ramachandran para as estruturas utilizadas como proteínas-molde para modelagem da SHsp90 (Figura 33). Observa-se que a estrutura de Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9) apresenta aproximadamente 70% dos resíduos em regiões favoráveis, enquanto que as estruturas cristalográficas de Leishmania major (PDB 3HJC) e Plasmodium falciparum (PDB 3K60) mais de 90% dos resíduos em regiões favoráveis. A baixa porcentagem de resíduos em regiões favoráveis da Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9) ocorre por ser o único modelo com todos os domínios da Hsp90, enquanto que a estrutura da Leishmania major (PDB 3HJC) apresenta apenas os domínios intermediário e C-terminal e a Plasmodium falciparum (PDB 3K60) somente o domínio N-terminal.

Figura 33. Gráficos de porcentagens de resíduos em: regiões favoráveis (A); regiões adicionalmente permitidas (B); regiões generosamente permitidas (C); regiões desfavoráveis (D); obtidas pelo PROCHECK para os gráficos de Ramachandran das estruturas modeladas (I-Tasser 1,2 e 4; Mholline, SwissModel e Modeller) e das estruturas cristalográficas (Saccharomyces cerevisiae (PDB 2CG9), Leishmania major (PDB 3HJC) e

Plasmodium falciparum (PDB 3K60)) utilizadas como modelo para modelagem por

homologia.

Um exemplo do gráfico de Ramachandran do modelo gerado pelo Modeller para SHsp90 pode ser observado na Figura 34, onde as regiões A, B e L (em vermelho) representam as regiões dos valores dos ângulos de torsão (phi e psi) mais favoráveis, dentre os possíveis, nas estruturas secundárias alfa-hélice, folha beta e loops, respectivamente. As regiões adicionalmente permitidas (em amarelo)

A

C

B

56 possuem ângulos de aminoácidos com valores próximos aos mais favoráveis na estrutura tridimensional da proteína. As regiões generosamente permitidas (em bege) apresentam valores de ângulos menos favoráveis, portanto, diminuem a qualidade da predição estrutural. As regiões desfavoráveis (em branco) possuem valores de ângulos inadequados para constituição da proteína estruturada. 131,132

Figura 34. Gráfico de Ramachandran para o modelo da SHsp90 gerado pelo Modeller, onde os resíduos de aminoácidos estão representados em preto, as regiões dos valores dos ângulos de torções (phi e psi) favoráveis estão representadas em vermelho, as regiões dos valores dos ângulos de torções adicionalmente permitidas estão representadas em amarelo, , as regiões dos valores dos ângulos de torções generosamente permitidas estão representadas em bege e , as regiões dos valores dos ângulos de torções não permitidas estão representadas em branco.

Em consequência de maiores porcentagens de resíduos de aminoácidos em regiões favoráveis, os modelos gerados pelo Modeller e Mholline foram considerados validados nesta etapa. Portanto, para demonstrar os caminhos percorridos em termos de superfície da estrutura da proteína pelos ALCs, em azul na Figura 35, foram empregados os softwares Xwalk e o PyMOL.

57 Figura 35. Representação das distâncias topológicas dos ALCs (em azul) em termos de superfície da estrutura da SHsp90 modelada pelo Modeller.