Com base no estudo electroforético das populações F2 dos quatro cruzamentos
considerados, foi possível determinar a composição em prolaminas e definir a localização cromossómica dos genes que controlam a sua síntese.
As gluteninas das linhas F2 conjuntamente com as dos progenitores, foram
separadas por SDS-PAGE em subunidades de alta (HMW-GS) e baixa (LMW-GS) massa molecular. Os géis SDS-PAGE também permitiram uma clara separação das ω- gliadinas, sendo as bandas destes géis designadas por NR (não reduzidas). As ω-, γ-, β- e α-gliadinas foram ainda separadas por electroforese A-PAGE. O estudo incidiu sobre as bandas visíveis que não coincidiam nos dois progenitores de cada cruzamento. As gluteninas HMW-GS e a subunidade d4 foram identificadas respectivamente de acordo
com Payne e Lawrence (1983) (com ligeiras modificações) e Nieto-Taladriz et al.
(1998), as restantes prolaminas foram numeradas de acordo com a sua mobilidade nos géis (Figuras 14 e 15).
A identificação da localização cromossómica dos loci que codificam as subunidades de gluteninas HMW-GS baseou-se nalgumas caracterizações efectuadas anteriormente (Rodríguez-Quijano et al., 1998b e Igrejas et al., 2000), tendo sido
realizada por comparação com variedades testemunhas do catálogo de Payne e Lawrence (1983).
A localização cromossómica dos loci de gluteninas LMW-GS e de gliadinas foi definida com base na caracterização alélica das variedades “Amazonas” e “Sorraia” realizada previamente por Igrejas et al., 2000 e Metakovsky et al. (www.aaccnet.org).
Começou por se estudar a relação existente entre as diferentes bandas electroforéticas, que permitiu definir os diferentes blocos segregantes. Foram integradas no mesmo bloco, considerando-se pertencentes ao mesmo alelo, bandas electroforéticas com comportamento similar (presença/ausência) ao longo de toda a população F2
estudada.
Os blocos definidos para cada um dos progenitores foram comparados entre si ao longo das linhas F2 de cada cruzamento, de modo a permitir a identificação dos pares
alélicos associados a cada locus (segregações do tipo 1:2:1 correspondente a um locus com dois alelos codominantes). A sobreposição de bandas impossibilitou a definição completa de alguns dos loci, admitindo-se nestes casos segregações do tipo 3:1 (correspondente a um locus com um alelo dominante).
Figura 14: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de
gluteninas (inserções de 1 a 6) e das gliadinas não reduzidas (inserções de 7 a 12) dos progenitores: “Almadense” (Al), “Sorraia” (S), “Ribeiro” (R), “Bejense” (B), “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M). LMW HMW B C ω γ, β, α, D
Figura 15: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos
progenitores: “Amazonas” (A), “Bejense” (B), “M.E. Branca” (M),“Ribeiro” (R), “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S).
O estudo da segregação dos alelos de cada locus foi realizado através da construção de tabelas de contingência com as distribuições fenotípicas dos alelos na população F2 de cada cruzamento. Para comprovar a hipótese de alelismo, determinou-
se o ajuste às proporções teóricas esperadas através do teste estatístico do Qui-quadrado com um nível de significância de α=0,05 (Tabelas 15, 18, 21, 24).
A independência/ligamento entre os loci definidos anteriormente foi testada, com base na construção de tabelas de contingência e cálculo dos valores de Qui-quadrado com um nível de significância de α=0,05. As percentagens de recombinação entre os loci que apresentaram ligamento, foram obtidas com o método da máxima verosimilhança (Tabelas 16, 19, 22, 25). Confirmaram-se assim os loci que se
γ β ω α + -
Na Tabela 13 e 14 resumem-se as prolaminas estudadas em cada progenitor. Entre parênteses foram designados os respectivos alelos para as gluteninas HMW-GS dos seis progenitores, de acordo com Payne e Lawrence (1983). Para as variedades “Amazonas” e “Sorraia” também se designaram os alelos de gluteninas LMW-GS de acordo com a nomenclatura de Gupta e Shepherd (1990) e Jackson et al. (1996), de
gliadinas de acordo com Metakovsky (1991).
Tabela 13: Prolaminas dos progenitores “M.E. Branca” “Amazonas” e “Bejense”. São apresentados os blocos de subunidades de gluteninas (HMW e LMW), gliadinas [não reduzidas (NR) e reduzidas (ω,γ, β, γ)] com os correspondentes loci.
Locus M.E. Branca Amazonas Bejense
Glu-A1 2* (b) 1 (a) 2* (b) Glu-B1 13+16 (f) 7+9 (c) 20x+20y (e) Glu-D1 2+12 (a) 5+10 (d) 2+12 (a) Glu-A3 B-LMW4 B-LMW2 + B-LMW8 (d) - Glu-B3 B-LMW6 + C-LMW13 - (j) B-LMW1 + C-LMW12 Glu-D3 B-LMW5 + C-LMW14 C-LMW15 (c) - Gli-A1 NR4+ω5+ω8 NR5+ω6 (o) - Gli-B1(-R1) NR16+γ15+γ16 NR13+ω10+ω14+γ19 (l) NR2+NR14+NR15+ω7+ω12+γ17 Gli-D1 NR7 ω1 (b) NR8+ω4 Gli-A2 α23+α25 β20+α24+α26 (f) -
Tabela 14: Prolaminas dos progenitores “Almadense”, “Sorraia” e “Ribeiro”. São apresentados os blocos de subunidades de gluteninas (HMW e LMW), gliadinas [não reduzidas (NR) e reduzidas (ω,γ, β, γ)] com os correspondentes loci.
Locus Almadense Sorraia Ribeiro
Glu-A1 1 (a) 2* (b) 2¨ (f) Glu-B1 6 (n) 7OE+8* (al) 6+8 (d) Glu-D1 2+12 (a) 2+12 (a) 2+12 (a) Glu-A3 - B-LMW4 (a) - Glu-B3 - d4 + B-LMW7 + C-LMW12 (g) - Glu-D3 B-LMW5 + C-LMW10 C-LMW11 + C-LMW15 (c) C-LMW10 + C-LMW14 Gli-A1 NR9+NR10+NR11+ω2+γ18 NR17 (a) NR9+ω3+γ18 Gli-A3 - NR12+ω11 - Gli-B1 NR1+ω9 - (c) NR1+NR3+ω9 Gli-D1 NR6 NR8+ω1+ω4 (l) NR7 Glu-D6/Gli-D2 α21 (C-LMW9)/α22 (j) α21
As subunidades de gluteninas HMW-GS 1Bx7 das variedades “Amazonas” e “Sorraia” foram ainda testadas para comprovar se haveria ou não sobreexpressão desta proteína usando “primers” específicos. Verificou-se que a variedade “Sorraia” apresentava sobreexpressão, tal como a variedade testemunha “Glenlea” (Figura 16), pelo que se lhe atribuiu o alelo al, pois a sobreexpressão só foi descrita até ao momento
neste alelo (subunidades HMW7OE+8*) (Butow et al., 2004).
Figura 16:Amplificação por PCR usando “primers” específicos para detectar a sobrexpressão da subunidade HMW 1Bx7 dos progenitores: “Sorraia” (S), “Amazonas” (A). Testemunhas: “Glenlea” (G) – controle positivo e “Chinese Spring” (Ch) - controle negativo.
Foi assim possível identificar os loci principais dos cromossomas do grupo 1
(Glu-1, Glu-3, Gli-1) que codificam subunidades de gluteninas HMW-GS, LMW-GS e
gliadinas respectivamente. Também se estudaram alguns loci, com segregação independente dos referidos anteriormente, localizados nos cromossomas homeólogos do grupo de 6 (Gli-2). No cruzamento III – “Sorraia x Almadense” identificou-se mais um
locus no cromossoma 1A - o Gli-A3.
1.1.1 - Cruzamento I -
“Amazonas x M.E. Branca”A análise electroforética das prolaminas de 132 grãos F2 serviu de base à análise
genética deste cruzamento. Nas Figuras 17, 18 e 19 apresenta-se o fraccionamento das gluteninas por SDS-PAGE e das gliadinas por SDS-PAGE e A-PAGE nos progenitores deste cruzamento e em vários grãos F , indicando-se as bandas em estudo.
Na Tabela 15 apresentam-se as classes fenotípicas encontradas para cada locus, a frequência com que cada classe foi observada na F2 e o ajuste às proporções teóricas
esperadas (1:2:1). Apesar da maioria dos loci ter sido estudada nos 132 grãos, em alguns casos perderam-se dados por não ter sido possível identificar a composição proteica de alguns grãos (o Gli-A2 só foi seguido em 124 grãos).
A caracterização das subunidades de gluteninas e ω-gliadinas por SDS-PAGE (Igrejas et al., 2000) e a caracterização alélica de gliadinas por A-PAGE (Metakovsky et al., www.aaccnet.org) da variedade “Amazonas”, serviram de base ao estudo deste
cruzamento.
Figura 17: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas dos progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do
cruzamento I - “Amazonas x M.E. Branca” (inserções 1 a 11).
HMW
LMW D
B
Identificaram-se os seis principais loci dos cromossomas do grupo de homeologia 1 (Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, Glu-A3 e GliA1, Glu-B3/GliB1(-R1), Glu- D3/GliD1), e um locus no braço curto de um dos cromossomas do grupo de homeologia
6 (Gli-A2) (Tabela 15). O locus Glu-B3/GliB1(-R1) foi assim designado devido à
presença de secalinas na variedade “Amazonas”, resultantes da translocação 1B/1R.
Figura 18: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das gliadinas não reduzidas
dos progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do cruzamento I
(inserções 1 a 11). ω
γ, β, α,
Figura 19: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos
progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do cruzamento I
(inserções 1 a 10).
Tabela 15: Dados da segregação F2 das subunidades de prolaminas do cruzamento I -
“Amazonas x M.E. Branca” (a x b).
Locus Prolaminas º
descendentes
Amazonas (a) M.E. Branca (b) a ab b χχχχ2(1:2:1)
Glu-A1 1 2* 33 65 34 0,05ns Glu-B1 7+9 13+16 21 65 46 9,50** Glu-D1 5+10 2+12 34 68 30 0,36ns Glu-A3 B-LMW2+B-LMW8 B-LMW4 31 66 35 0,24ns Gli-A1 NR5+ω6 NR4+ω5+ω8 29 67 36 0,77ns Glu-B3/Gli-B1(-R1) -/NR13+ω10+ω14+γ19 B-LMW6+C-LMW13/ NR16+γ15+γ16 26 62 44 5,39ns Glu-D3/Gli-D1 C-LMW15/ ω1 B-LMW5+C-LMW14/ NR7 34 62 36 0,55ns Gli-A2 β20+α24+α26 α23+α25 33 58 33 0,52ns **- nível de significância de 1%
ns- não significativo, comprova-se o alelismo a: possui o alelo da variedade “Amazonas”
γ β ω α + -
As distribuições fenotípicas de todos os loci, com excepção do locus Glu-B1,
ajustaram-se às distribuições teóricas esperadas 1:2:1, para um nível de significância de α=0,05, o que confirma a atribuição dos alelos. No locus Glu-B1 houve um desvio significativo das distribuições fenotípicas, no entanto a identificação deste par alélico não levanta dúvidas (HMW7+9 vs HMW13+16), pelo que se atribuiu este desvio ao
acasoe se considerou este locus.
1.1.1.1 - Gluteninas (HMW-GS e LMW-GS)
Em relação às subunidades de gluteninas HMW-GS estudou-se a segregação (tipo 1:2:1) das subunidades codificadas pelo Glu-A1 (“Amazonas”- 1 e “M.E. Branca”-
2*), pelo Glu-B1 (“Amazonas”- 7+9 e “M.E. Branca”- 13+16) e pelo Glu-D1
(“Amazonas”- 5+10 e “M.E. Branca”- 2+12) (Tabela 15, Figura 17).
Das subunidades de gluteninas LMW-GS identificaram-se bandas associadas aos loci Glu-A3, Glu-B3, Glu-D3. No Glu-B3, a variedade “Amazonas” tem o alelo nulo,
devido à translocação 1B/1R (Tabela 15, Figura 17).
1.1.1.2 - Gliadinas (Reduzidas e ão Reduzidas)
Foram identificados quatro loci de gliadinas, Gli-A1, Gli-B1(-R1), Gli-D1 e Gli- A2, os quais foram estudados com segregações do tipo 1:2:1 (Figuras 18 e 19, Tabela
15).
A presença da translocação 1B/1R na variedade “Amazonas” foi bem visível tanto nos géis SDS-PAGE (Figura 18 – grupo de bandas 13) como nos géis de A-PAGE (Figura 19 – grupo de bandas que engloba a 10 e a 14). Este conjunto de bandas (secalinas) é codificado por genes do braço 1RS e correspondem ao alelo Gli-B1l
como variante alélica em relação às prolaminas codificadas pelos loci Glu-B3/Gli-B1 da
variedade “M.E. Branca”.