Efeito das proteínas de reserva e das associadas ao amido aos lipidos nas propriedades reológicas de farinhas de trigo mole

Texto

(1)UIVERSIDADE TÉCICA DE LISBOA ISTITUTO SUPERIOR DE AGROOMIA. EFEITO DAS PROTEÍAS DE RESERVA E DAS ASSOCIADAS AO AMIDO E AOS LÍPIDOS AS PROPRIEDADES REOLÓGICAS DE FARIHAS DE TRIGO MOLE. TESE APRESENTADA PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR NO RAMO DE ENGENHARIA AGRO-INDUSTRIAL. Ana Sofia Rosa Bagulho. Júri: Presidente: Reitor da Universidade Técnica de Lisboa Vogais: Doutor José Maria Carrillo Becerril, Professor Catedrático da Universidade Politécnica de Madrid, Espanha Doutor Raul Filipe Xisto Bruno de Sousa, Professor Catedrático do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa Doutora Maria Luisa Duarte Martins Beirão da Costa, Professora Catedrática do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa Doutor João Manuel Neves Martins, Professor Associado do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa Doutora Carla Maria Cadete Martins Moita Brites, Investigadora Auxiliar da Estação Agronómica Nacional do Instituto Nacional dos Recursos Biológicos, I.P. Doutor Henrique de Pinho Guedes Pinto, na qualidade de especialista. LISBOA 2008. Orientador: Doutor Raul Filipe Xisto Bruno de Sousa Co-Orientadores: Doutor José Maria Carrillo Becerril Doutora Carla Maria Cadete Martins Moita Brites.

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(3) Tese de doutoramento financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (SFRH / BD / 1098 / 2000). iii.

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(5) AGRADECIMETOS. Muitas pessoas contribuíram de forma directa ou indirecta para a realização deste trabalho sem a ajuda das quais não teria atingido este objectivo. Não posso deixar de lhes agradecer e dedicar este trabalho que também é um pouco deles. Ao Professor Catedrático Raul Bruno de Sousa do Departamento de Química do Instituto Superior de Agronomia por ter aceite orientar esta tese, pela dedicação e apoio concedidos. Ao Professor Catedrático José Maria Carrillo da Unidad de Genética da E.T.S.I.A. pela orientação desta tese, em particular da componente genética. Em especial lhe agradeço a paciência que teve comigo ao longo de todos estes anos, as facilidades que me proporcionou para contornar no seu laboratório todas as dificuldades e uma enorme amizade. À Doutora Carla Moita Brites Investigadora Auxiliar da EAN por ter idealizado este projecto e ter acreditado em mim desde o princípio, a quem lhe devo os meus primeiros passos nesta área. Em especial lhe agradeço a orientação da componente tecnológica. À Professora Titular Marta Rodríguez Quijano da Unidad de Genética da ETSIA a quem devo uma grande amizade, paciência, dedicação e apoio a este trabalho que foi durante todos estes anos um projecto também seu. Em especial lhe agradeço a ajuda no estudo genético das segregações e todas as correcções realizadas a este trabalho. À Eng. Maria do Céu Muacho pela ajuda na realização de alguns ensaios laboratoriais, com quem partilhei bons momentos durante a execução deste trabalho. Às auxiliares de Laboratório de Química da ENMP, Beatriz Jara, Isabel Cachucho e Maria da Conceição Terrinca pela colaboração na realização dos ensaios de campo e determinações de qualidade. Aos Doutores Regina Lucas e Jorge Rubianes, colegas de experiências, com quem partilhei muitas alegrias e angústias no decorrer deste trabalho. Ao Jorge em especial lhe agradeço a minha iniciação nas técnicas moleculares.. v.

(6) À Doutora Patrícia Giraldo pelo tempo que me dedicou e os “primers” de puroindolinas que me desenhou. À Investigadora Auxiliar da ENMP Doutora Graça Pereira, Doutora Rita Costa e “quase” Doutora Cláudia Vicente com quem partilhei muitos “momentos de ADN e PCRs”. Ao Investigador Auxiliar da ENMP Eng. Benvindo Maçãs pelas facilidades concedidas que me permitiram dedicar mais tempo a este trabalho. À Investigadora Principal da ENMP Doutora Dolores Navas pela amizade e apoio durante a realização deste trabalho. À Eng. Marta Vacas de Carvalho pela correcção da parte estatística. À Fundação para a Ciência e a Tecnologia pelo suporte financeiro sem o qual não teria sido possível realizar esta tese. Ao meu marido José pela sua enorme paciência e pelo tempo que lhe roubei e o adiar dos nossos projectos comuns. Por fim aos meus Pais pelo apoio que me têm dado, em especial ao meu Pai por ter tido a paciência de ler e sugerir algumas correcções a este trabalho.. vi.

(7) RESUMO. O principal objectivo deste estudo foi aprofundar o conhecimento genético e funcional das prolaminas, puroindolinas e proteínas “waxy”, estabelecendo a sua relação com o comportamento reológico da massa e viscosidade da farinha. Foram realizados cruzamentos entre quatro variedades antigas (“Mocho de Espiga Branca”, “Bejense”, “Almadense”, “Ribeiro”) e duas variedades actuais (“Amazonas”, “Sorraia”), sendo os progenitores seleccionados em função da sua composição proteica e qualidade tecnológica. Determinou-se a composição alélica e localização cromossómica dos loci que codificam estas proteínas por electroforese SDSPAGE, A-PAGE e por PCR. A qualidade do grão, do glúten, do amido e comportamento na moagem das linhas F5 de cada cruzamento foram avaliadas, os dados foram correlacionados e relacionados com a composição proteica. As prolaminas tiveram uma grande influência na qualidade do glúten devido aos loci Glu-B1, Glu-D1 e um menor efeito dos loci Glu-3/Gli-1, mas tiveram pouca influência no perfil de viscosidades do amido. As puroindolinas afectaram significativamente todos os parâmetros de qualidade, contrariamente às proteínas “waxy”. Concluiu-se que tratando-se de populações segregantes, a dureza do grão influencia os resultados da qualidade tecnológica, pelo que a influência das prolaminas não é tão determinante como no caso de se analisarem fundos exclusivamente “soft” ou “hard”.. Palavras Chave: Triticum aestivum L., gluteninas, gliadinas, puroindolinas, proteínas waxy, qualidade do glúten, viscosidade da farinha.. vii.

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(9) Effects of prolamins, puroindolines and waxy proteins on rheological properties of bread wheat flours.. ABSTRACT. The main objective of this doctoral thesis is to advance in the genetic and functional knowledge of the prolamins, puroindolines, waxy proteins, and link with dough rheological behaviour and flour viscosity. Crosses between four Portuguese landraces (“Mocho de Espiga Branca”, “Bejense”, “Almadense”, “Ribeiro”) and two recent varieties (“Amazonas”, “Sorraia”) were done. These crosses parents were chosen by their protein composition and their technological quality. The allelic composition and the chromosomal location of the loci coding to these proteins were determined by electrophoretic techniques SDS-PAGE, APAGE and by PCR. The F5 progenies from the four crosses were evaluated concerning to kernel, gluten, starch quality and milling behaviour and these parameters were correlated with each other and related with protein composition. The prolamins affected significantly gluten quality due to Glu-B1, Glu-D1 loci and a minor Glu-3/Gli-1 loci effect in some parameters, but they have a little influence on starch viscosities profile. Puroindolines, affected significantly all milling, gluten and starch parameters, contrarily to waxy proteins. It was concluded that hardness is so crucial in bread wheat technological quality as prolamins, when genetic background was not exclusively “soft” or “hard”.. Key-Words: Triticum aestivum L., glutenins, gliadins, puroindolines, waxy proteins, gluten quality, flour viscosity.. ix.

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(11) ÍDICE GERAL ITRODUÇÃO. 1. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 5. 1 - Qualidade do Trigo Mole e sua Avaliação. 7. 2 - Organização Cromossómica do Trigo Mole. 12. 3 – Composição Química do Grão de Trigo. 12. 3.1 – Proteínas. 13. 3.1.1 – Prolaminas. 14. 3.1.1.1 – Prolaminas do Trigo. 14. 3.1.1.1.1 - Definição e Classificação das Prolaminas. 14. 3.1.1.1.2 - Sequência e Estrutura das Prolaminas. 16. 3.1.1.1.3 - Controlo Genético das Prolaminas. 20. 3.1.1.1.4 - Interacções Moleculares e Propriedades Funcionais das Prolaminas. 23. 3.1.1.1.5 - Relação das Prolaminas com a Qualidade. 25. 3.1.1.1.6 - Influência do Genótipo e Efeitos Ambientais – Prolaminas. 29. 3.1.1.2 – Secalinas e a Translocação 1B/1R. 30. 3.1.1.2.1 - Definição e Estrutura das Secalinas. 30. 3.1.1.2.2 - Controlo Genético das Secalinas. 31. 3.1.1.2.3 - Relação das Secalinas com a Qualidade. 31. 3.1.2 – Puroindolinas. 32. 3.1.2.1 - Definição e Classificação das Puroindolinas. 32. 3.1.2.2 - Sequência e Estrutura das Puroindolinas. 33. 3.1.2.3 – Controlo Genético das Puroindolinas. 33. 3.1.2.4 - Interacções Moleculares e Propriedades Funcionais das Puroindolinas. 35. 3.1.2.5 - Relação das Puroindolinas com a Qualidade. 37. 3.1.2.6 - Influência do Genótipo e Efeitos Ambientais – Puroindolinas. 38. 3.2 – Amido. 39. 3.2.1 - Definição e Composição do Amido. 39. 3.2.2 Controlo Genético da Síntese de Amido. 40. 3.2.3 - Relação do Amido com a Qualidade. 41. 3.2.4 - Influência do Genótipo e Efeitos Ambientais – Amido. 43. 3.3 – Considerações Finais e Outros Componentes. CAPÍTULO II – MATERIAL E MÉTODOS. 43. 47. 1 - Material Vegetal. 47. 2 – Métodos. 51. xi.

(12) 2.1 – Extracção e Separação das Proteínas de Reserva. 51. 2.1.1 - Electroforese SDS-PAGE. 53. 2.1.2 - Electroforese A-PAGE. 53. 2.1.3 – Nomenclatura das Prolaminas. 55. 2.2 - Extracção e Separação das Proteínas “Waxy” 2.2.1 – Nomenclatura das Proteínas “waxy”. 55 56. 2.3 - Identificação da Composição Alélica em Puroindolinas. 56. 2.3.1 - Extracção e Separação das Puroindolinas. 57. 2.3.2 - Pesquisa de Mutações nas Sequências Codificantes das Puroindolinas. 58. 2.3.2.1 - Extracção e Quantificação de ADN. 58. 2.3.2.2 - Amplificação de ADN por PCR e Electroforese. 58. 2.3.2.3 – Sequenciação dos Genes que Codificam as Puroindolinas. 60. 2.3.3 – Nomenclatura das Puroindolinas. 60. 2.4 – Outras Determinações Realizadas por PCR. 60. 2.5 – Testes de Qualidade. 61. 2.5.1 - Massa de mil Grãos. 62. 2.5.2 – Massa do Hectolitro. 62. 2.5.3 - Preparação das Amostras. 62. 2.5.4 – Dureza. 63. 2.5.5 – Teor Proteico. 64. 2.5.6 - Teste de Sedimentação SDS. 64. 2.5.7 – Cinza. 65. 2.5.8 – Farinógrafo. 65. 2.5.9 – Alveógrafo. 66. 2.5.10 – RVA – Rapid Visco-Analyser. 67. 2.5.10 .1– Extracção do Amido. 69. 2.5.11 – Determinação do Teor de Amilose. 69. 2.6 – Análise de Dados. 70. 2.6.1 – Estudo Genético das Prolaminas. 70. 2.6.2 – Análise dos Parâmetros de Qualidade. 71. CAPÍTULO III – RESULTADOS. 75. 1 - Determinação de Marcadores Bioquímicos. 75. 1.1 – Análise Genética das Prolaminas. 75. 1.1.1 - Cruzamento I - “Amazonas x M.E. Branca”. 79. 1.1.1.1 - Gluteninas (HMW-GS e LMW-GS). 83. 1.1.1.2 - Gliadinas (Reduzidas e Não Reduzidas). 83. 1.1.1.3 - Ligamento entre os Genes das Prolaminas. 84. 1.1.2 - Cruzamento II - “Amazonas x Bejense”. xii. 86.

(13) 1.1.2.1 - Gluteninas (HMW-GS e LMW-GS). 89. 1.1.2.2 - Gliadinas (Reduzidas e Não Reduzidas). 90. 1.1.2.3 - Ligamento entre os Genes das Prolaminas. 90. 1.1.3 - Cruzamento III-“Sorraia x Almadense”. 93. 1.1.3.1 - Gluteninas (HMW-GS e LMW-GS). 96. 1.1.3.2 - Gliadinas (Reduzidas e Não Reduzidas). 97. 1.1.3.3 - Ligamento entre os Genes das Prolaminas. 98. 1.1.4 - Cruzamento IV -“Sorraia x Ribeiro”. 101. 1.1.4.1 - Gluteninas (HMW-GS e LMW-GS). 104. 1.1.4.2 - Gliadinas (Reduzidas e Não Reduzidas). 105. 1.1.4.3 - Ligamento entre os Genes das Prolaminas. 107. 1.1.5 – Resumo das Prolaminas Estudadas. 109. 1.2 – Caracterização das Proteínas “waxy”. 110. 1.2.1 – Determinação da Composição das Proteínas “waxy” nos Progenitores. 110. 1.2.2 – Estudo da Composição das Proteínas “waxy” na Descendência do Cruzamento I. 112. 1.3 – Caracterização das Puroindolinas. 113. 1.3.1 – Determinação da Composição das Puroindolinas nos Progenitores. 113. 1.3.2 – Estudo da Composição das Puroindolinas na Descendência dos Cruzamento II, III, IV 117 2 – Relação dos Marcadores Bioquímicos com os Parâmetros de Qualidade Tecnológica. 119. 2.1 – Cruzamento I - “Amazonas x M.E. Branca”. 120. 2.1.1 – Análise das Médias da População F5. 120. 2.1.2 – Influência dos Loci Estudados nos Parâmetros de Qualidade. 123. 2.1.2.1 – Dureza (Dur). 123. 2.1.2.2 - Teor Proteico (Prot). 123. 2.1.2.3 – Teste de Sedimentação (SDS). 124. 2.1.2.4 – Rendimento em Farinha (RF). 125. 2.1.2.5 – Cinza (Cz). 126. 2.1.2.6 – Farinógrafo (Ab, TD, Est, Enf, IQ). 126. 2.1.2.7 – Alveógrafo (P, L, W). 128. 2.1.2.8 – RVA (Vpico, Vmin, Vfinal, Tpast). 130. 2.1.2.9 – Teor de Amilose. 131. 2.1.3 – Estudo da Relação entre os Parâmetros de Qualidade. 132. 2.2 – Cruzamento II - “Amazonas x Bejense”. 135. 2.2.1 – Análise das Médias da População F5. 135. 2.2.2 – Influência dos Loci Estudados nos Parâmetros de Qualidade. 138. 2.2.2.1 – Dureza (Dur). 138. 2.2.2.2 - Teor Proteico (Prot). 139. 2.2.2.3 – Teste de Sedimentação (SDS). 139. 2.2.2.4 – Rendimento em Farinha (RF). 140. 2.2.2.5 – Cinza (Cz). 140. xiii.

(14) 2.2.2.6 – Farinógrafo (Ab, TD, Est, Enf, IQ). 141. 2.2.2.7 – Alveógrafo (P, L, W). 144. 2.2.2.8 – RVA (Vpico, Vmin, Vfinal, Tpast). 146. 2.2.3 – Estudo da Relação entre os Parâmetros de Qualidade. 147. 2.3 – Cruzamento III - “Sorraia x Almadense”. 151. 2.3.1 – Análise das Médias da População F5. 151. 2.3.2 – Influência dos Loci Estudados nos Parâmetros de Qualidade. 154. 2.3.2.1 – Dureza (Dur). 154. 2.3.2.2 - Teor Proteico (Prot). 154. 2.3.2.3 – Teste de Sedimentação (SDS). 155. 2.3.2.4 – Rendimento em Farinha (RF). 156. 2.3.2.5 – Cinza (Cz). 156. 2.3.2.6 – Farinógrafo (Ab, TD, Est, Enf, IQ). 157. 2.3.2.7 – Alveógrafo (P, L, W). 159. 2.3.2.8 – RVA (Vpico, Vmin, Vfinal, Tpast). 161. 2.3.2.9 – Estudo da Linha Recombinante entre os Loci Glu-D3 e Gli-D1. 162. 2.3.3 – Estudo da Relação entre os Parâmetros de Qualidade 2.4 – Cruzamento IV - “Sorraia x Ribeiro”. 163 166. 2.4.1 – Análise das Médias da População F5. 166. 2.4.2 – Influência dos Loci Estudados nos Parâmetros de Qualidade. 170. 2.4.2.1 – Dureza (Dur). 170. 2.4.2.2 - Teor Proteico (Prot). 170. 2.4.2.3 – Teste de Sedimentação (SDS). 171. 2.4.2.4 – Rendimento em Farinha (RF). 171. 2.4.2.5 – Cinza (Cz). 172. 2.4.2.6 – Farinógrafo (Ab, TD, Est, Enf, IQ). 173. 2.4.2.7 – Alveógrafo (P, L, W). 175. 2.4.2.8 – RVA (Vpico, Vmin, Vfinal, Tpast). 177. 2.4.3 – Estudo da Relação entre os Parâmetros de Qualidade 2.5 – Análise Discriminante dos Principais Loci. 179 182. CAPÍTULO IV – DISCUSSÃO. 195. 1 – Escolha dos Progenitores. 195. 2 – Análise Genética das Prolaminas. 195. 2.1 – Gluteninas HMW-GS. 196. 2.2 – Gluteninas LMW-GS. 197. 2.3 – Gliadinas. 198. 2.4 – Relações de Ligamento entre os Loci. 199. 3– Relação das Proteínas Estudadas com os Parâmetros de Qualidade 3.1 - HMW-GS (Glu-1). 201 201. xiv.

(15) 3.2 - LMW-GS e Gliadinas (Glu-3/Gli-1). 205. 3.3 – Gliadinas (Gli-2) e Loci Minoritários (Gli-A3). 208. 3.4 – Proteínas “Waxy” – Wx-A1. 209. 3.5 – Puroindolinas. 211. 3.6 - Efeitos Aditivos e Interactivos. 216. 4 – Relação entre os Parâmetros de Qualidade. 217. 4.1 – Massa de Mil Grãos e Massa do Hectolitro. 217. 4.2 – Textura e Teor Proteico do Grão. 218. 4.3 – Volume de Sedimentação. 220. 4.4 – Parâmetros do Farinógrafo e Alveógrafo. 220. 4.5 – Parâmetros do RVA. 221. 5 – Análise Discriminante dos Principais Loci. 222. CAPÍTULO V – COCLUSÕES. 225. 1 – Considerações Finais. 227. BIBLIOGRAFIA. 231. AEXOS. 259. xv.

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(17) ÍDICE DE TABELAS Tabela 1: Sumário das várias prolaminas e suas características (Shewry e Halford, 2002).. 16. Tabela 2: Sistemas de pontuação de qualidade das HMW-GS (Carrillo et al., 2006).. 25. Tabela 3: Comparação da influência dos alelos Glu-1 e Glu-3 na força em trigo mole (Cornish et al., 2006).. 28. Tabela 4: Comparação da influência dos alelos Glu-1 e Glu-3 na extensibilidade em trigo mole (Cornish et al., 2006).. 28. Tabela 5: Composição dos géis de electroforese SDS-PAGE (4 géis).. 53. Tabela 6: Composição das soluções utilizadas nos géis de electroforese A-PAGE.. 54. Tabela 7: Composição dos géis de electroforese A-PAGE (4 géis).. 54. Tabela 8: Sequências nucleotídicas dos “primers” e temperaturas de anelação utilizadas na análise das mutações de PINA.. 59. Tabela 9: Sequências nucleotídicas dos “primers” e temperaturas de anelação utilizadas na análise das mutações da PINB.. 59. Tabela 10: Sequências nucleotídicas dos “primers” e temperaturas de anelação utilizadas na análise da sobreexpressão da HMW-GS 1Bx7 e na determinação alélica do locus Wx-B1.. 61. Tabela 11: Composição das soluções utilizadas no teste de sedimentação SDS.. 64. Tabela 12: Programas usados nos ensaios de RVA.. 68. Tabela 13: Prolaminas dos progenitores “M.E. Branca” “Amazonas” e “Bejense”. São apresentados os blocos de subunidades de gluteninas (HMW e LMW), gliadinas [não reduzidas (NR) e reduzidas (ω,γ, β, γ)] com os correspondentes loci.. 78. Tabela 14: Prolaminas dos progenitores “Almadense”, “Sorraia” e “Ribeiro”. São apresentados os blocos de subunidades de gluteninas (HMW e LMW), gliadinas [não reduzidas (NR) e reduzidas (ω,γ, β, γ)] com os correspondentes loci.. 78. Tabela 15: Dados da segregação F2 das subunidades de prolaminas do cruzamento I - “Amazonas x M.E. Branca” (a x b).. 82. Tabela 16: Dados da segregação, análise de ligamento (χ2) e percentagem de recombinação (R±SE) entre os loci estudados na F2 do cruzamento I - “Amazonas (a,c) x M.E. Branca (b,d)”.. 84. Tabela 17: Caracterização alélica dos recombinantes entre os loci Glu-A3 e Gli-A1 encontrados na segregação do cruzamento I.. 84. Tabela 18: Dados da segregação F2 das subunidades de prolaminas do cruzamento II - “Amazonas x Bejense” (a x b).. 89. Tabela 19: Dados da segregação, análise de ligamento (χ2), proporções esperadas na segregação e percentagem de recombinação (R±SE) entre os loci estudados na F2 do cruzamento II - “Amazonas (a,c)x Bejense (b,d)”.. 91. Tabela 20: Caracterização alélica dos recombinantes entre os loci Glu-A3 e Gli-A1 encontrados na segregação do cruzamento II.. 91. Tabela 21: Dados da segregação F2 das subunidades de prolaminas do cruzamento III - “Sorraia x Almadense” (a x b).. 95. Tabela 22: Dados da segregação, análise de ligamento (χ2), proporções esperadas na segregação e percentagem de recombinação (R±SE) entre os loci estudados na F2 do cruzamento III - “Sorraia (a,c) x Almadense (b,d)”.. 99. xvii.

(18) Tabela 23: Caracterização alélica dos recombinantes entre os loci Glu-A3/Gli-A1 e Gli-A3, Glu-D3 e GliD1 encontrados na segregação do cruzamento III.. 100. Tabela 24: Dados da segregação F2 das subunidades de prolaminas do cruzamento IV - “Sorraia x Ribeiro” (a x b).. 104. Tabela 25: Dados da segregação, análise de ligamento (χ2) e percentagem de recombinação (R±SE) entre os loci estudados na F2 do cruzamento IV - “Sorraia (a,c) x Ribeiro (b,d)”.. 108. Tabela 26: Caracterização alélica do recombinante entre os loci Glu-D3 e Gli-D1 encontrado na segregação do cruzamento IV.. 108. Tabela 27: Prolaminas estudadas nos quatro cruzamentos e correspondentes loci.. 109. Tabela 28: Composição alélica dos loci que codificam as proteínas “waxy” dos progenitores.. 112. Tabela 29: Composição alélica dos loci que codificam PIN A e PINB dos progenitores.. 117. Tabela 30: Valores médios dos parâmetros determinados em grão/farinha integral dos progenitores do cruzamento I. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação das linhas F5.. 121. Tabela 31: Valores médios dos parâmetros determinados na farinha dos progenitores do cruzamento I. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação das linhas F5.. 121. Tabela 32: Valores médios dos parâmetros do RVA e teor de amilose dos progenitores do cruzamento I. Valores médios mínimos, máximos e coeficiente de variação de 30 linhas F5.. 121. Tabela 33: Análise de variância dos valores de dureza (Dur) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 123. Tabela 34: Análise de variância dos valores de volume de sedimentação (SDS) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 124. Tabela 35: Separação das médias (lsmeans) do volume SDS em função da interacção Glu-D1*Glu-B3/GliB1(-R1).. 125. Tabela 36: Análise de variância dos valores de rendimento em farinha (RF) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 125. Tabela 37: Análise de variância da capacidade de absorção de água (Ab) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 126. Tabela 38: Análise de variância do tempo de desenvolvimento do farinógrafo (TD) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 127. Tabela 39: Análise de variância da estabilidade do farinógrafo (Est) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 127. Tabela 40: Análise de variância do grau de enfraquecimento do farinógrafo (Enf) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 128. Tabela 41: Análise de variância do número de qualidade do farinógrafo (IQ) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I. 128. Tabela 42: Análise de variância da tenacidade do alveógrafo (P) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 129. Tabela 43: Análise de variância da extensibilidade do alveógrafo (L) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 129. Tabela 44: Análise de variância da força do alveógrafo (W) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 129. Tabela 45: Análise de variância da viscosidade mínima do RVA (Vmin) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 130. Tabela 46: Análise de variância da viscosidade final do RVA (Vfinal) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 131. xviii.

(19) Tabela 47: Análise de variância da temperatura de formação da pasta do RVA (Tpas) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 131. Tabela 48: Análise de variância do teor de amilose (Amil) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento I.. 131. Tabela 49: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros de qualidade do cruzamento I.. 133. Tabela 50: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros do RVA, teor de amilose e restantes parâmetros de qualidade do cruzamento I.. 134. Tabela 51: Valores médios dos parâmetros determinados em grão/farinha integral dos progenitores do cruzamento II. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 136. Tabela 52: Valores médios dos parâmetros determinados na farinha dos progenitores do cruzamento II. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 136. Tabela 53: Valores médios dos parâmetros do RVA dos progenitores do cruzamento II. Valores médios mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros de 35 linhas F5.. 136. Tabela 54: Análise de variância dos valores de dureza (Dur) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 138. Tabela 55: Análise de variância dos valores de proteína (Prot) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 139. Tabela 56: Análise de variância dos valores de volume de sedimentação (SDS) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 139. Tabela 57: Análise de variância dos valores de rendimento em farinha (RF) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 140. Tabela 58: Análise de variância dos teores de cinza (Cz) na farinha e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 140. Tabela 59: Análise de variância da capacidade de absorção de água (Ab) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 141. Tabela 60: Análise de variância do tempo de desenvolvimento do farinógrafo (TD) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 142. Tabela 61: Análise de variância da estabilidade do farinógrafo (Est) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 142. Tabela 62: Análise de variância do grau de enfraquecimento do farinógrafo (Enf) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 143. Tabela 63: Análise de variância do número de qualidade do farinógrafo (IQ) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II. 143. Tabela 64: Separação das médias (lsmeans) do número de qualidade em função da interacção GluB1*Glu-D1.. 143. Tabela 65: Análise de variância da tenacidade do alveógrafo (P) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 144. Tabela 66: Separação das médias do número de qualidade em função da interacção Glu-D1*Glu-A3/GliA1.. 145. Tabela 67: Análise de variância da extensibilidade do alveógrafo (L) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 145. Tabela 68: Análise de variância da força do alveógrafo (W) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 145. Tabela 69: Análise de variância da viscosidade máxima do RVA (Vpico) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 146. xix.

(20) Tabela 70: Análise de variância da viscosidade mínima do RVA (Vmin) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 147. Tabela 71: Análise de variância da viscosidade final do RVA (Vfinal) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 147. Tabela 72: Análise de variância da temperatura de formação da pasta do RVA (Tpas) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento II.. 147. Tabela 73: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros de qualidade do cruzamento II.. 149. Tabela 74: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros do RVA e restantes parâmetros de qualidade do cruzamento II.. 150. Tabela 75: Valores médios dos parâmetros determinados em grão/farinha integral dos progenitores do cruzamento III. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 152. Tabela 76: Valores médios dos parâmetros determinados na farinha dos progenitores do cruzamento III. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 152. Tabela 77: Valores médios dos parâmetros do RVA dos progenitores do cruzamento III. Valores médios mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros de 30 linhas F5.. 152. Tabela 78: Análise de variância dos valores de dureza (Dur) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 154. Tabela 79: Análise de variância dos valores de proteína (Prot) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 155. Tabela 80: Análise de variância dos valores de volume de sedimentação (SDS) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 155. Tabela 81: Análise de variância dos valores de rendimento em farinha (RF) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 156. Tabela 82: Análise de variância dos teores de cinza (Cz) na farinha e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 156. Tabela 83: Análise de variância da capacidade de absorção de água (Ab) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 157. Tabela 84: Análise de variância do tempo de desenvolvimento do farinógrafo (TD) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 158. Tabela 85: Análise de variância da estabilidade do farinógrafo (Est) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 158. Tabela 86: Análise de variância do grau de enfraquecimento do farinógrafo (Enf) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 159. Tabela 87: Análise de variância do número de qualidade do farinógrafo (IQ) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 159. Tabela 88: Análise de variância da tenacidade do alveógrafo (P) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 160. Tabela 89: Análise de variância da extensibilidade do alveógrafo (L) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 160. Tabela 90: Análise de variância da força do alveógrafo (W) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 160. Tabela 91: Análise de variância da viscosidade máxima do RVA (Vpico) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 161. Tabela 92: Análise de variância da viscosidade mínima do RVA (Vmin) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 161. xx.

(21) Tabela 93: Análise de variância da viscosidade final do RVA (Vfinal) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 162. Tabela 94: Análise de variância da temperatura de formação da pasta do RVA (Tpas) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento III.. 162. Tabela 95: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros de qualidade do cruzamento III.. 165. Tabela 96: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros do RVA e restantes parâmetros de qualidade do cruzamento III.. 166. Tabela 97: Valores médios dos parâmetros determinados em grão/farinha integral dos progenitores do cruzamento IV. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 167. Tabela 98: Valores médios dos parâmetros determinados na farinha dos progenitores do cruzamento IV. Valores médios, mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros das linhas F5.. 168. Tabela 99: Valores médios dos parâmetros do RVA dos progenitores do cruzamento IV. Valores médios mínimos, máximos e coeficiente de variação dos mesmos parâmetros de 32 linhas F5.. 168. Tabela 100: Análise de variância da dureza (Dur) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 170. Tabela 101: Análise de variância dos valores de proteína (Prot) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 171. Tabela 102: Análise de variância dos valores de volume de sedimentação (SDS) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 171. Tabela 103: Análise de variância dos valores de rendimento em farinha (RF) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 172. Tabela 104: Análise de variância dos teores de cinza (Cz) na farinha e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 172. Tabela 105: Separação das médias do teor em cinza em função da interacção Glu-B1*Pina-D1. 173. Tabela 106: Análise de variância da capacidade de absorção de água (Ab) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 173. Tabela 107: Análise de variância do tempo de desenvolvimento do farinógrafo (TD) e separação das médias em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 174. Tabela 108: Análise de variância da estabilidade do farinógrafo (Est) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 174. Tabela 109: Análise de variância do grau de enfraquecimento do farinógrafo (Enf) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 175. Tabela 110: Análise de variância do número de qualidade do farinógrafo (IQ) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 175. Tabela 111: Análise de variância da tenacidade do alveógrafo (P) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 176. Tabela 112: Análise de variância da extensibilidade do alveógrafo (L) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 176. Tabela 113: Análise de variância da força do alveógrafo (W) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 176. Tabela 114: Análise de variância da viscosidade máxima do RVA (Vpico) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 177. Tabela 115: Análise de variância da viscosidade mínima do RVA (Vmin) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 178. xxi.

(22) Tabela 116: Análise de variância da viscosidade final do RVA (Vfinal) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 178. Tabela 117: Análise de variância da temperatura de formação da pasta do RVA (Tpas) e separação das médias (lsmeans) em função das variantes alélicas, nas linhas do cruzamento IV.. 178. Tabela 118: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros de qualidade do cruzamento IV.. 180. Tabela 119: Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros do RVA e restantes parâmetros de qualidade do cruzamento IV.. 181. Tabela 120: Matrizes de classificação da análise discriminante para o cruzamento I.. 183. Tabela121: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas - Glu-B1 (cruzamento I).. 183. Tabela 122: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Glu-D1 (cruzamento I).. 184. Tabela 123: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas GluB3/Gli-B1(R1) (cruzamento I).. 185. Tabela 124: Matrizes de classificação da análise discriminante para o cruzamento II.. 186. Tabela 125: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Glu-B3/Gli-B1(-R1) (cruzamento II).. 186. Tabela 126: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Pina-D1 (cruzamento II).. 187. Tabela 127: Matrizes de classificação da análise discriminante para o cruzamento III.. 188. Tabela128: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Glu-B1 (cruzamento III).. 188. Tabela129: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Pina-D1 (cruzamento III).. 189. Tabela 130: Matrizes de classificação da análise discriminante para o cruzamento IV.. 190. Tabela 131: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Glu-B1 (cruzamento IV).. 190. Tabela 132: Coeficientes estandardizados para as variáveis canónicas – Pina-D1 (cruzamento IV).. 191. xxii.

(23) ÍDICE DE FIGURAS Figura 1: Evolução da superfície cultivada com trigo em Portugal. Fonte: Eurostat.. 6. Figura 2: Evolução da produção total de trigo em Portugal. Fonte: Eurostat.. 6. Figura 3: Diversidade de produtos alimentares obtidos a partir do trigo (Brites, 2000a).. 8. Figura 4: Estrutura das gluteninas HMW-GS do tipo x e y (adaptado de Shewry et al., 2006).. 17. Figura 5: Estrutura das α-/β-, γ-, ω-gliadinas (adaptado de Gianibelli et al., 2001).. 19. Figura 6: Localização cromossómica dos loci que codificam as prolaminas do trigo mole (adaptado de Carrillo et al., 2006).. 20. Figura 7: Faseamento do programa de trabalhos.. 48. Figura 8: Plantas F2 derivadas dos quatro cruzamentos semeadas em estufa (2000/2001).. 49. Figura 9: Multiplicação das linhas F4 dos quatro cruzamentos realizada no campo da ENMP em 2002/2003.. 50. Figura 10: Esquema de extracção efectuado para determinar a composição em prolaminas.. 51. Figura 11: Curva farinográfica com a expressão dos principais parâmetros.. 66. Figura 12: Curva alveográfica com a expressão dos principais parâmetros.. 67. Figura 13: Curva do RVA com a expressão dos principais parâmetros.. 69. Figura 14: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas (inserções de 1 a 6) e das gliadinas não reduzidas (inserções de 7 a 12) dos progenitores: “Almadense” (Al), “Sorraia” (S), “Ribeiro” (R), “Bejense” (B), “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M).. 76. Figura 15: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos progenitores: “Amazonas” (A), “Bejense” (B), “M.E. Branca” (M), “Ribeiro” (R), “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S).. 77. Figura 16: Amplificação por PCR usando “primers” específicos para detectar a sobrexpressão da subunidade HMW 1Bx7 dos progenitores: “Sorraia” (S), “Amazonas” (A). Testemunhas: “Glenlea” (G) – controle positivo e “Chinese Spring” (Ch) - controle negativo.. 79. Figura 17: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas dos progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do cruzamento I - “Amazonas x M.E. Branca” (inserções 1 a 11).. 80. Figura 18: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das gliadinas não reduzidas dos progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do cruzamento I (inserções 1 a 11).. 81. Figura 19: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos progenitores “Amazonas” (A) e “M.E. Branca” (M) e de vários grãos F2 do cruzamento I (inserções 1 a 10).. 82. Figura 20: Representação dos marcadores encontrados no cromossoma 1A com as respectivas distâncias genéticas (em % de recombinação).. 85. Figura 21: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas dos progenitores “Amazonas” (A) e “Bejense” (B) e de vários grãos F2 do cruzamento II - “Amazonas x Bejense” (inserções 1 a 11).. 86. Figura 22: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das gliadinas não reduzidas dos progenitores “Amazonas” (A) e “Bejense” (B) e de vários grãos F2 do cruzamento II (inserções 1 a 11).. 87. Figura 23: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos progenitores “Amazonas” (A) e “Bejense” (B) e de vários grãos F2 do cruzamento II (inserções 1 a 11).. 88. Figura 24: Representação dos marcadores encontrados no cromossoma 1A com as respectivas distâncias genéticas (em % de recombinação).. 92. xxiii.

(24) Figura 25: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas dos progenitores “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento III - “Sorraia x Almadense” (inserções 1 a 10).. 93. Figura 26: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das gliadinas não reduzidas dos progenitores “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento III (inserções 1 a 10).. 94. Figura 27: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos progenitores “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento III (inserções 1 a 11).. 95. Figura 28: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas HMWGS dos progenitores “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento III” (inserções 1 a 10) onde se inclui o recombinante do locus Glu-B1 encontrado (inserção 8). 97. Figura 29: Representação dos marcadores encontrados no cromossoma 1A com as respectivas distâncias genéticas (em % de recombinação) a que se encontram.. 101. Figura 30: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das subunidades de gluteninas dos progenitores “Ribeiro” (R) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento IV - “Sorraia x Ribeiro” (inserções 1 a 11).. 102. Figura 31: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das gliadinas não reduzidas dos progenitores “Ribeiro” (R) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento IV (inserções 1 a 11).. 103. Figura 32: Comparação das gliadinas reduzidas (A-PAGE) das variedades “Almadense” (Al) e “Ribeiro” (R). As bandas ω9, γ18 e α21 estão presentes nas duas variedades.. 105. Figura 33: Fraccionamento por electroforese em géis A-PAGE das gliadinas reduzidas dos progenitores “Ribeiro” (R) e “Sorraia” (S) e de vários grãos F2 do cruzamento IV (inserções 1 a 10).. 106. Figura 34: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das isoproteinas “waxy”. Progenitores: “Bejense” (B), “Almadense” (Al), “M.E. Branca” (M), “Ribeiro” (R), “Sorraia” (S), “Amazonas” (A). Testemunha: “Chinese Spring” (Ch).. 110. Figura 35: Amplificação por PCR (Nakamura et al., 2002) para detectar a variabilidade alélica da Wx-B1. Progenitores: “Amazonas” (A), “Sorraia” (S),. “Bejense” (B), “Almadense” (Al), “M.E. Branca” (M), “Ribeiro” (R). Testemunhas: “Diego” (D), “Mariñar” (Mñ), “Chinese Spring” (Ch).. 111. Figura 36: Amplificação por PCR (Vanzetti et al., 2005) para detectar a variabilidade alélica da Wx-B1. Progenitores: “Amazonas” (A), “Sorraia” (S), “Bejense” (B), “Almadense” (Al), “M.E. Branca” (M), “Ribeiro” (R). Testemunhas: “Chinese Spring” (Ch), “Mariñar” (Mñ), “Diego” (D).. 112. Figura 37: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das proteínas “waxy” dos progenitores “M.E. Branca” (M) e “Amazonas” (A) e de várias linhas F5 do cruzamento I. As linhas assinaladas na figura têm o alelo nulo para o locus Wx-A1.. 113. Figura 38: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das proteínas “waxy” de vários grãos F5 (1 a 6) de uma linha do cruzamento I, heterozigótica para o locus Wx-A1.. 113. Figura 39: Fraccionamento por electroforese em géis SDS-PAGE das puroindolinas dos progenitores: “Almadense” (Al), “Sorraia” (S), “Ribeiro” (R), “Bejense” (B), “Amazonas” (A), “M.E. Branca” (M).. 114. Figura 40: Amplificação por PCR usando “primers” específicos (Gautier et al., 1994) para detectar as sequências que codificam PINB (1) e PINA (2) dos progenitores: “Sorraia” (S), “Amazonas” (A), “M.E. Branca” (M), “Almadense” (Al), “Bejense” (B) e “Ribeiro” (R).. 115. Figura 41: Comparação da sequência nucleotídica da região codificante do alelo selvagem Pina-D1a (“Chinese Spring”) com a sequência do alelo presente na variedade “Bejense” - Pina-D1l. A delecção da citosina na posição 267 bem como o codão stop são assinalados na figura.. 116. Figura 42: Amplificação por PCR usando “primers” específicos para distinguir o alelo Pina-D1l e o alelo Pina-D1a em várias linhas F5 do cruzamento II: alelo Pina-D1a - L1, L2; heterozigóticas – L3, L4; alelo Pina-D1l – L5, L6.. 118. Figura 43: Amplificação por PCR usando “primers” específicos (Gautier et al., 1994) para detectar o alelo Pina-D1b nos progenitores “Almadense” (Al) e “Sorraia” (S) e em várias linhas F5 do cruzamento III. A linha assinalada tem o alelo Pina-D1b como o progenitor “Sorraia”.. 118. Figura 44: Curva farinográfica do progenitor “Amazonas”.. 122. xxiv.

(25) Figura 45: Curva farinográfica do progenitor “M.E. Branca”.. 122. Figura 46: Perfis de viscosidade dos progenitores do cruzamento I obtidos com o RVA.. 122. Figura 47: Influência da interacção Glu-D1*Glu-B3/Gli-B1(-R1) nos valores médios do volume SDS.. 125. Figura 48: Curva farinográfica do progenitor “Amazonas”.. 137. Figura 49: Curva farinográfica do progenitor “Bejense”.. 137. Figura 50: Perfis de viscosidade dos progenitores do cruzamento II obtidos com o RVA.. 137. Figura 51: Influência da interacção Glu-B1*Glu-D1 nos valores médios do número de qualidade.. 143. Figura 52: Influência da interacção Glu-D1*Glu-A3/Gli-A1 nos valores médios da tenacidade.. 145. Figura 53: Curva farinográfica do progenitor “Sorraia”.. 153. Figura 54: Curva farinográfica do progenitor “Almadense”.. 153. Figura 55: Perfis de viscosidade dos progenitores do cruzamento III obtidos com o RVA.. 153. Figura 56: Curva farinográfica do progenitor “Sorraia”.. 169. Figura 57: Curva farinográfica do progenitor “Ribeiro”.. 169. Figura 58: Perfis de viscosidade dos progenitores do cruzamento IV obtidos com o RVA.. 169. Figura 59: Influência da interacção Glu-B1*Pina-D1 nos valores médios do teor em cinza.. 173. Figura 60: Discriminação das variantes alélicas do Glu-B1: G1 – alelo da variedade “Amazonas”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “M: E:Branca”.. 183. Figura 61: Discriminação das variantes alélicas do Glu-D1: G1 – alelo da variedade “Amazonas”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “M: E:Branca”.. 184. Figura 62: Discriminação das variantes alélicas do Glu-B3/Gli-B1(-R1): G1 – alelo da variedade “Amazonas”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “M: E:Branca”.. 185. Figura 63: Discriminação das variantes alélicas do Glu-B3/Gli-B1(-R1): G1 – alelo da variedade “Amazonas”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Bejense”.. 186. Figura 64: Discriminação das variantes alélicas do Pina--D1: G1 – alelo da variedade “Amazonas”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Bejense”.. 187. Figura 65: Discriminação das variantes alélicas do Glu-B1: G1 – alelo da variedade “Sorraia”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Almadense”.. 188. Figura 66: Discriminação das variantes alélicas do Pina-D1: G1 – alelo da variedade “Sorraia”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Almadense”.. 189. Figura 67: Discriminação das variantes alélicas do Glu-B1: G1 – alelo da variedade “Sorraia”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Ribeiro”.. 190. Figura 68: Discriminação das variantes alélicas do Pina-D1: G1 – alelo da variedade “Sorraia”, G2 – heterozigótico, G3 - alelo da variedade “Ribeiro”.. 191. xxv.

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(27) LISTA DE ABREVIATURAS χ2 – teste estatístico Qui-quadrado µL – microlitro (10-6 L) Ab – capacidade de absorção de água da farinha determinada pelo farinógrafo Amil – teor de amilose, em (%) A-PAGE - electroforese em gel de poliacrilamida em pH ácido BE – enzima ramificante associada à síntese de amilopectina (“branching enzyme”) Break – enfraquecimento do RVA (Vpico-Vmin), em (cP) CIMMYT - “Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo” cP – centipoise (unidade de viscosidade dinâmica) CV – coeficiente de variação Cz – teor de cinza da farinha, em (%) DBE – enzima desramificante associada à síntese de amilopectina (“debranching enzyme”) DSC – Calorometria diferencial de varrimento (differencial scanning calorimetry) AD – ácido desoxirribonucleico DMF - dimetilformamida. Dur - dureza Enf – grau de enfraquecimento da massa determinado com o farinógrafo, em (UF) EMP – Estação Nacional de Melhoramento de Plantas Est – estabilidade da massa determinada com o farinógrafo, em (min) F – teste estatístico F de Fisher g - grama g.l. – graus de liberdade GBSS – enzima responsável pela síntese de amilose (“granule bound starch sintase”) GSP-1 -“grain softness protein-1” Hec – massa do hectolitro, em (Kg/hL) het – heterozigótico para a composição de prolaminas consideradas HMW-GS – subunidades de gluteninas de alta massa molecular IQ – número de qualidade determinado no farinógrafo, em (mm). xxvii.

(28) Kb - kilo pares de bases – 103 pb (medida de comprimento do ADN) KDa - kilodalton (unidade de massa atómica) L – extensibilidade da massa determinada com o alveógrafo, em (mm) LMW-GS – subunidades de gluteninas de baixa massa molecular M.E. Branca - variedade de trigo mocho de espiga branca M1000 – massa de mil grãos, em (g) Máx – valor máximo Mb – mega pares de bases – 106 pb (medida de comprimento do ADN) min – minuto mL – mililitro mm – milímetro nm - nanómetro n.s. – não significativo Mín – valor mínimo - número de linhas IR - espectrofotometria de reflectância no infravermelho próximo R – notação para identificar as gliadinas separadas por SDS-PAGE P – tenacidade da massa determinada com o alveógrafo, em (mmH2O) P/L – relação de equilíbrio em (mmH2O/mm) pb – pares de bases (medida de comprimento do ADN) PCR – reacção em cadeia com a polimerase (“polimerase chain reaction”) PIA - puroindolina A PIB - puroindolina B Prot – teor proteico, em (%) PSI – Índice de tamanho das partículas (“particle size índex”) QTL – loci de características quantitativas (quantitative trait loci) R± ±SE – percentagem de recombinação entre dois loci ± desvio padrão r – coeficiente de correlação de Pearson r.p.m. – rotações por minuto R2 – coeficiente de determinação da análise de variância. xxviii.

(29) RF – rendimento em farinha obtido com o moinho Chopin CD1, em (%) RP-HPLC – cromatografia líquida de alta definição em fase reversa RVA – analisador rápido de viscosidade (“rapid visco-analyser”) S.Q. – soma de quadrados da análise de variância S1 – retrogradação 1 (Vfinal-Vmin), em cP S2 – retrogradação 2 (Vfinal – Vpico), em cP SDS – volume de sedimentação do teste SDS em (mm); reagente dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE – electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio SKCS – metodologia para determinar a dureza (“single kernel characterization system”) SP – polimorfismo num nucleótido (“single nucleotide polimorfism”) SS - enzima associada à síntese de amilopectina (“starch sintase”) T. 1B/1R – translocação 1B/1R TD – tempo de desenvolvimento da massa determinado com o farinógrafo em (min) Tris – hidroximetil aminometano TPas – temperatura de formação da pasta, em (ºC) tpico – tempo do pico do RVA, em (min) UE – União Europeia UF – unidades farinográficas Vfinal - viscosidade final do RVA, em (cP) Vmin – viscosidade mínima do RVA, em (cP) Vpico – viscosidade máxima do RVA, em (cP) W – força da massa determinada com o alveógrafo, em (10-4 J) dTP - desoxinucleótido trifosfato. TBE - solução tampão contendo Tris, ácido bórico e EDTA EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético. Pr > F - probabilidade de aceitação da hipótese nula TE – Tampão Tris-EDTA. TEMED - N, N, N, N’-tetrametilenodiamina.. xxix.

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(31) INTRODUÇÃO. ITRODUÇÃO Os avanços científicos, na área da genética e do melhoramento de plantas, têm contribuído para os aumentos de produtividade ao longo das últimas décadas. A qualidade é uma característica explorada pelos melhoradores, que têm ainda como principais objectivos, a produção e a sua regularidade, seleccionando variedades capazes de se adaptarem bem à especificidade do clima da região.. Da história da ENMP destaca-se a preponderância do melhoramento genético dos trigos, sobretudo dos trigos panificáveis (Barradas et al., 1996), para a obtenção de novas variedades nacionais com grande expressão na lavoura. Na indução de variação genética, a realização de hibridações artificiais, seguida de selecção, tem sido o principal método adoptado pela ENMP (Departamento de Cereais), para o qual se têm usado diversas fontes de germoplasma, recorrendo a variedades antigas e a materiais provenientes de diferentes latitudes, através de esquemas de cruzamentos artificiais devidamente planeados.. A filosofia de melhoramento de trigo na ENMP tem-se caracterizado por ser um processo dinâmico, com objectivos bem definidos no tempo, a fim de satisfazer as necessidades da economia nacional (Barradas et al., 1996). Neste sentido, as exigências de produtividade e de qualidade têm constituído factores essenciais de selecção, que conduzem à procura de diversificadas fontes de variação genética.. A variabilidade genética observada nos trigos antigos deve assim ser considerada como uma importante fonte de genes, até mesmo recorrendo aos novos processos biotecnológicos, com vista à transferência de genes de interesse que por vezes desapareceram das variedades modernas fruto da desejada uniformidade fenotípica (Igrejas, 2000). Para além deste aspecto há ainda o interesse cultural e histórico destes materiais, que ao não haver um esforço para a sua caracterização acabam por se perder.. É neste contexto que surge o presente trabalho. Pretendeu-se estudar o comportamento de variedades antigas originárias da flora portuguesa (Vasconcelos, 1933) relativamente a alguns parâmetros de qualidade (Brites e Bagulho, 1999b), a fim. 1.

(32) INTRODUÇÃO. se poder potenciar a sua introdução nalguns esquemas de cruzamentos artificiais envolvendo variedades actuais (Brites e Bagulho, 1999a). Os progenitores dos cruzamentos realizados neste trabalho foram seleccionados em função da sua composição proteica (proteínas de reserva e associadas ao amido), cuja variabilidade foi assegurada pelas variedades antigas e pela diferente textura de endosperma (“soft” e “hard”). As linhas F5, derivadas dos quatro cruzamentos realizados neste trabalho entre variedades antigas e variedades modernas, foram utilizadas para estudar o efeito conjunto da composição em prolaminas, puroindolinas e proteínas “waxy” em vários parâmetros indicadores do comportamento na moagem, da qualidade do glúten e do amido. Estas vertentes da qualidade não são normalmente estudadas conjuntamente, pelo que este trabalho pretende contribuir para uma abordagem mais integrada da qualidade.. Esta tese tem assim como principal objectivo aprofundar o conhecimento genético e funcional das proteínas de reserva e das proteínas associadas ao amido (“waxy” e puroindolinas), estabelecendo a sua relação com vários parâmetros determinantes da qualidade do trigo mole.. Os objectivos em concreto são,. - Determinar a composição em prolaminas, puroindolinas e proteínas “waxy” dos progenitores dos quatro cruzamentos (“Amazonas”, “Sorraia”, “M.E. Branca”, “Bejense”, “Almadense” e “Ribeiro”) e das linhas recombinantes. - Analisar a segregação das prolaminas nas populações F2 provenientes de cruzamentos entre os quatro trigos antigos e as duas variedades modernas de trigo mole, de modo a definir as variantes alélicas e a localização cromossómica dos loci que as codificam. - Avaliar a qualidade tecnológica e o perfil de viscosidade da farinha dos progenitores dos quatro cruzamentos e das linhas recombinantes. - Estudar a influência da composição em prolaminas, puroindolinas e proteínas “waxy” nos vários parâmetros de qualidade estudados, de modo a identificar proteínas que possam ser utilizadas como marcadores de importantes características tecnológicas. - Estudar a relação entre vários parâmetros de qualidade estudados.. 2.

(33) I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.

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(35) REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA A crise alimentar que o mundo tem vivido obriga a dedicar à agricultura uma atenção redobrada. Toda a fileira alimentar, em particular no que se refere aos alimentos básicos, terá de ser encarada e repensada como prioridade, para garantir a segurança alimentar das populações. A instabilidade do preço dos produtos petrolíferos que arrasta consigo o custo dos fertilizantes, o crescimento do número de países emergentes, as alterações climáticas mais pronunciadas, a expansão da produção de biodiesel e os fenómenos especulativos causadores da recente instabilidade, estão na origem da preocupação pela produção mundial de alimentos.. O trigo representa a fonte de calorias e de proteínas mais generalizada, cuja cultura se estende à maior parte dos países do mundo. O aumento da segurança alimentar das populações passará assim por uma maior produtividade do trigo, com padrões de qualidade mais elevados e adequados às necessidades da indústria, e um maior valor nutricional.. Em Portugal a cultura do trigo é anterior à própria nacionalidade, sendo já uma actividade preponderante quando a Península Ibérica fazia parte do Império Romano, onde constituía o alimento nobre das classes mais favorecidas (Barradas et al., 1996). A flora portuguesa foi desde sempre bastante rica em variedades de trigo antigas (Vasconcelos, 1933), com significativa expressão cultural durante séculos.. Actualmente, o trigo continua a ser um cereal importante para os sistemas tradicionais de agricultura do Sul de Portugal, onde se torna difícil encontrar outras alternativas viáveis (Bagulho et al., 1994). Nas últimas décadas, com excepção dos anos em que a PAC (Política Agrícola Comum) protegia significativamente a cultura do trigo rijo (Triticum durum Desf.), tem-se registado em Portugal uma maior tendência para a cultura do trigo mole (Triticum aestivum L.), representando o trigo rijo cerca de 10% da produção total nacional.. Depois da adesão de Portugal à CEE, hoje UE, a produção de trigo passou a obedecer às normas da PAC, e, apesar das ajudas à produção, a cultura tornou-se menos. 5.

(36) REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. atractiva, com substanciais reduções na área cultivada. No último decénio (1999-2008) a superfície ocupada pelo trigo passou de 221.000 hectares para 79.100 hectares, com uma quebra na produção ao nível dos 50 % (Figuras 1 e 2). Esta situação tende a agravar-se, pois com os actuais preços dos factores de produção, sobretudo combustíveis e fertilizantes, receia-se que a área de cultura do trigo se torne ainda mais reduzida, admitindo-se algumas excepções para as zonas de regadio, onde os rendimentos podem ser mais elevados e os riscos menores.. 250. Área (1000 ha). 200 150 100 50 0 1999. 2000. 2001. 2002. 2003. 2004. 2005. 2006. 2007. 2008. Ano. Figura 1: Evolução da superfície cultivada com trigo em Portugal. Fonte: Eurostat.. Produção Trigo (1000 t). 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Ano. Figura 2: Evolução da produção total de trigo em Portugal. Fonte: Eurostat.. 6.

(37) REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. As produções de trigo em Portugal são em geral baixas e dificilmente competitivas com as das regiões da Europa Central e do Norte, devido ao ambiente que caracteriza o Sul de Portugal, em que à acidez e reduzida fertilidade do solo se junta um clima difícil, normalmente pouco favorável à cultura dos cereais. Porém, a cultura do trigo encontra no sistema cereais\criação animal extensiva a sua principal justificação, sendo, na maioria dos casos, difícil conceber uma sem a outra.. O trigo é uma cultura de sementeira outono-invernal, em que o desenvolvimento das plantas enfrenta situações climatéricas muito distintas e imprevisíveis que condicionam o resultado das colheitas em Portugal. O clima é assim o principal factor limitante da cultura no nosso país, devido à sua irregularidade ao longo dos anos, e, durante o ciclo vegetativo das plantas, com uma concentração das chuvas nos quatro meses de Inverno e uma elevada secura nas estações de Primavera e Verão. O excesso de chuvas até à fase de espigamento condiciona profundamente as produções, mas são as condições climáticas da fase final do ciclo vegetativo das plantas que mais se reflectem na qualidade, por estarem directamente relacionadas com a formação do grão. A falta de humidade associada a elevadas temperaturas obriga a uma maturação forçada, com consequências na composição química e qualidade do grão.. 1 - Qualidade do Trigo Mole e sua Avaliação A qualidade do trigo mole é um conceito muito complexo e de difícil definição uma vez que depende de inúmeros factores: ampla gama de produtos finais, diferentes interesses em jogo (produção, indústria moageira e transformadora), evolução tecnológica, gostos do consumidor e questões culturais. Deve ser sempre definida em relação à aptidão que uma variedade tem para produzir um bom produto final. A qualidade do trigo mole é assim especificada em termos de produto final (Figura 3), uma vez que existe uma grande diversidade de produtos finais (panificação, fabrico de bolachas e biscoitos, pastelaria, fabrico de “noodles”, etc.).. 7.